專利名稱：利用芽孢桿菌生產超氧化物岐化酶的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生產超氧化物歧化酶(SOD)的新菌種篩選和生產工藝。
超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)據(jù)其所含金屬輔基的不同分為Cu、Zn-SOD，Mn-SOD和Fe-SOD三種，它們都具有相同的催化功能。在動物、植物和微生物體內都含有SOD。生物體在某些病理情況下衰老或遭受逆境脅迫等，能產生過量的并具有毒性更強的超氧物陰離子自由基(
)，因
不能被及時清除而進一步衍生成毒性羥自由基(·OH)等氧自由基。
等自由基具有極強的氧化能力，在生物體內能引起生物分子激烈的連鎖自發(fā)氧化，造成脂質過氧化而破壞膜系統(tǒng)，使核酸斷裂，氨基酸分解、酶蛋白變性失活，蛋白質發(fā)生分解或聚合，生物體內一系列生理代謝和生化反應遭受干擾。
SOD是生物體內清除過量
的最重要的酶，其催化
歧化反應速率比自發(fā)反應速率快1010倍，將
歧化成H2O2和O2，再經過氧化氫酶等酶的作用將H2O2轉化為H2O和O2，防御
對生物分子的破壞作用，維護細胞正常的生理代謝和生化反應。
自1969年美國McCord和Fridovich從牛紅細胞中發(fā)現(xiàn)了SOD，并鑒定能歧化
，保護生物分子免遭氧化降解的作用以來，有關SOD的分子生物學方面的研究一直成為生物學領域的前沿課題，受到各國科學工作者的重視，認為這一創(chuàng)造性的研究工作可以與1953年Watson和Crick發(fā)表了有名的DNA雙螺旋結構學說所引起的結果相比擬。
特別是在近幾年來對SOD的應用研究引起了國際上的重大關注。SOD作為治療酶在臨床應用上的成功給醫(yī)學和分子藥理學帶來了新進展，能廣泛用于治療因O-2及其衍生物氧自由基引起的各種較為難治的疾病具有特殊療效。對自身免疫性疾病、回腸結腸炎、類風濕關節(jié)炎、皮肌炎，以及肺炎等炎癥有很好療效。對治療膀胱癌、前列腺癌等多種癌癥，以及癌癥化療引起骨髓損傷和白血球減少的恢復效果很好。對抗輻射損傷有特效。SOD在人類防衰老上有特殊作用，SOD可用于生產保健飲料和保護皮膚健美的日用化妝品。在農作物生產中，應用SOD可增強作物抗病、抗寒、抗旱、抗高溫、抗過氧化等抗逆能力和延緩衰老，顯著提高作物品質和產量。
SOD在醫(yī)藥、人類保健、飲料生產、日用化工和作物生產上具有廣泛的應用前景，但從發(fā)現(xiàn)SOD近二十多年來國內外生產SOD至今未取得大的突破。該方面的現(xiàn)有技術存在以下問題。
1、生產SOD的原料自1969年美國學者McCord和Fridovich從牛紅細胞中發(fā)現(xiàn)SOD并鑒定其催化功能[見McCord，J.M.Fridovich，J.Biol.Chem.，1969，244，6049.]以來，隨著SOD作為治療酶在臨床上廣泛成功地應用，對SOD的需求量日益增大。在七十年代初，美國Bannister最初利用牛血為原料生產SOD[見Bannister，J.V.，et al，Eur.J.Biochem.，18(1971)，178.]，直至八十年代至現(xiàn)在國際上主要用牛血生產SOD，[見Gartner，A.et al;Biochem，J.，221(1984)，549.]大約100公斤牛血(14頭牛)能生產1克SOD。由于牛血來源有限，開始研究試圖利用人血和其他動物血液及動物肝臟等組織生產SOD，但均未正式投入生產[見Marklund，S.L.，Proc.Natl.Acod.Sci.USA，79(1982)和Rocha，H.A.，et al;Eur，J.Biochem.，145(1984)，477]。牛血等動物血及組織和人血因價格昂貴和來源有限，國際上一些學者同時轉向利用植物生產SOD。
七十年代日本學者Sawada等和美國學者Beauchamp等最初分別研究了菠菜葉和麥胚等植物的SOD[見Sawada，Y.，et al;Biochem.Biophys Acta，268(1972)，305.和Beauchamp，C.O.et al;Biochem.Biophys.Acta，317(1973)，50]。直到1986年日本Hagiwara利用稻葉為原料生產SOD，因生產原料不便于工業(yè)化生產和處理原料麻煩，未能實現(xiàn)工業(yè)化生產[見Japan，154549，82，09.07.]。
國際上一些學者在研究利用動物血和植物生產SOD的同時，也致力于研究利用微生物生產SOD。開展這方面工作最早的應首推美國Weser，他研究釀酒酵母生產SOD[見Weser，V.，et al，Physiol.Chem，353(1972)，1821]。以后各國一些學者相繼研究了大腸桿菌(E.Coli)、鏈球菌(S.mutans)、織線藻(P.boryanum)和螺旋藻(S.platensis)等多種微生物的SOD。而最早用于工業(yè)化生產是日本的Takeda化學工業(yè)公司在1980年利用沙雷鐵氏菌屬(Serratia)的菌株生產Mn-SOD[見Japan，105645，80.07.30]，但熱穩(wěn)定性差，37℃僅穩(wěn)定60分鐘。以后日本相繼報道了利用葡萄糖細菌(Gluconobacter cerinus)和啤酒酵母(Nacardiopsis)生產熱穩(wěn)定Mn-SOD。但未獲得高含量的菌株[分別見Japan，274299，84.12.28.和Japan，219166，85.10.03]。
1990年日本Idemitsu石油化工有限公司使用螺旋藻(S.subsalsa)生產SOD，但SOD含量太低，僅347U/g干重[見Japan.0269181，90.03.07]。
1987年蘇聯(lián)Lengd化學制藥工業(yè)公司用深紅酵母(Rhodcforula rubra)生產SOD。工藝流程復雜，且產量也較低(0.032mg/g生物量)[見SU，213365，87.03.18]。1988年德國Veb Berlin-kosmetik也報道了利用酵母提取Cn、Zn-SOD，但所用酵母的SOD含量不高，工業(yè)生產不經濟[見DD，312216，88.03.13]。
2、生產SOD的工藝目前國際上生產SOD主要是利用牛血為原料，提取SOD一直是采用McCord等創(chuàng)立的方法和工藝流程[見McCord，J.M.etal;J.Biol.Chem.，244(1969)，6049]，該方法的一個最大的問題是除去溶血中的血紅蛋白的技術不易掌握[見Gartner，A;etal，Biochem.J.，221(1984)，549]。若采用Tsuchihashi改良的方法，因在溶血液中加入乙醇和氯仿等有機試劑多，增大成本[見Tsuc-hihashi，M.，Biochem.Z.，140(1972)1140.]。并且Hartz等認為該種方法損傷了SOD，造成酶結構改變和酶的輔基銅喪失達8%，影響酶活性。其次是該方法需用磷酸氫二鉀量極大，造成經濟成本增大[見Hartz，J.W.etal，J.Biol.Chem.，244(1969)，4565.]。
若采用植物提取SOD，因其含量低，加之種植植物不利于工業(yè)化生產，而且處理原料困難，粗酶液制備透析工作量大、消耗化學試劑多，也未能正式工業(yè)化生產。利用微生物發(fā)酵法生產SOD，現(xiàn)利用的原料包括酵母，大腸桿菌、鏈球菌螺旋藻和織線藻等，這些原料都因缺乏高含量菌株經濟效益不高，而且藻類培養(yǎng)還需照明等條件。特別是提取的SOD熱穩(wěn)定性差，有的需進行修飾才能供醫(yī)療用，有的需通過轉螯金屬離子造成程序復雜。
本項發(fā)明的目的是開辟一種來源廣泛、價格低廉、SOD含量高的生產SOD的新原料，并提供一種相應的便于工業(yè)化生產的新方法。
本發(fā)明開辟的生產SOD的新原料是芽孢桿菌(Bacillus Cereus)，也可以利用其中的一種，如“作物增產菌”(一種芽孢桿菌;保存于CGMCC，保藏號為0137，保藏日期為1988年9月20日)。經11年的菌種篩選，獲得的芽孢桿菌菌株-，精制SOD含量高達0.278mg/g生物量，比國際上八十年代末利用微生物生產SOD的原料含量高2.6-8.9倍。與SOD粗酶制劑相比較，要高10-50倍。篩選的該菌株并富含Cu.Zn-SOD、Mn-SOD和Fe-SOD三種SOD，其中Cu.Zn-SOD為SOD總量的21%，Mn-SOD為52%，F(xiàn)e-SOD為27%。
本發(fā)明創(chuàng)立的SOD綜合層析生產工藝流程不僅能為醫(yī)藥、獸藥、飲料、日用化工和作物生產，分別提供SOD粗制劑和精制劑，而且通過該流程能生產三種SOD。
利用芽孢桿菌生產SOD新方法其特征在于本法包括以下過程高SOD含量菌株篩選、發(fā)酵、菌細胞離析破碎、粗酶生產工藝和精制酶層析生產工藝。
(一)、高SOD含量菌株篩選1、分離

圖1是高SOD含量的芽孢桿菌的分離篩選示意圖，根據(jù)不同的需要或不同用途首先從人、動物、植物體表用30-50ml滅菌水淋洗，或取動物、植物組織，土壤1-10g經研磨轉入放有40ml滅菌水的三角瓶中按200-300rpm/min振蕩10分鐘，靜置半分鐘后以上清液作為菌源水。用滅菌吸管吸取菌源水25ml注入滅菌試管;將試管置80℃水中處理10分鐘，用接種環(huán)醮菌液在牛肉汁蛋白胨培養(yǎng)基(蛋白胨5g，牛肉汁3g、氯化鈉5g、瓊脂粉15g、配1000ml水)平板上劃線，置28-35℃下培養(yǎng)24小時，仔細選取不同菌落，進行涂片、染色鏡檢，為蠟質芽孢桿菌的，轉移到上述培養(yǎng)基斜面上編號以待酶活力測定。
2、上清液的制備將菌株接種于裝有150ml-250ml液體牛肉汁蛋白胨培養(yǎng)基的滅菌三角瓶中(培養(yǎng)基成份以上述成份不含瓊脂粉)，在27-34℃下?lián)u床振蕩培養(yǎng)24-30小時。采用4000rpm/min、4℃離心20分鐘，收集菌細胞2克以上，用0.9%NaCl溶液洗滌3次，對菌糊稱重后用50mmol/L、pH7.8磷酸鈉緩沖液(內含2mmol/L EDTA、2mmol/L巰基乙醇)按菌∶液為1∶1-2比例加入，攪拌成懸浮液，按每克菌加入0.05mg溶菌酶在冰浴上處理30分鐘，并輕輕攪拌，用100w功率超聲波發(fā)生器于冰浴上超聲處理共10分鐘，每次處理1分鐘間隔1分鐘。4000rpm/min，4℃離心20分鐘，取上清液(粗酶液)供測SOD活性。
3.酶活力測定采用本發(fā)明改進的高靈敏度的氯化硝基氮藍四唑(NBT)光還原測定SOD活力是最經濟、最簡便易行的適于大量菌株篩選的方法。
SOD活力測定方法在3ml0.05mol/L、pH7.8的磷酸緩沖液反應液中(內含有2.7ml 13×10-3mol/L的Met、0.1ml 75×10-6mol/L的NBT、0.1ml 100×10-9mol/L的EDTA、0.1ml2×10-6mol/L的VB2)加入5-30μl粗酶液后在30℃、4000lux光照條件下經30分鐘，在560nm下測定光密度，以緩沖液代替酶液作空白測定酶活性(酶活性單位采用抑制NBT光化還原50%為一個酶活性單位)。
經SOD活力測定篩選出酶活性最高的菌株，進行中試，SOD含量高，在50℃和pH4-9條件下酶活力穩(wěn)定，即可用于生產。
3、菌種培養(yǎng)、換代、保藏將菌種劃線接種于牛肉蛋白胨培養(yǎng)基(蛋白胨5g，牛肉汁3g、NaCl5g，瓊脂粉15g，配1000ml水)斜面，4℃(短期)或-10℃(長期)冰箱或冷庫保存，用劃線法定期轉管傳代。
4、芽孢桿菌生物學特性芽孢桿菌(Bacillus cereus)菌體直桿狀、成鏈、光鏡下長2.5-3.5μm，寬1μm，革蘭氏反應陰性，芽孢橢圓或柱狀，中長，孢囊不膨大，原生質內含有不著色顆粒。瓊脂平板培養(yǎng)，菌落圓形，直徑0.2cm，邊緣整齊，稍隆起，無光澤，不透明，蠟質;液體培養(yǎng)，形成菌膜。生長溫度15-45℃，置27-32℃，適宜pH6.0-7.5。適宜碳源麥芽糖、蔗糖。適宜氮源為蛋白胨，無機氮源為NH+4，發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖產酸，木糖、乳糖、甘露瓊不產酸，水解淀粉，利用檸檬酸鹽，還原硝酸鹽成亞硝酸鹽，7%NaCl中生長，pH5.7生長，V.P陽性，V.P液培養(yǎng)后pH4.56。能厭氧生長，接觸酶陽性，碳水化合物產氣陰性，不產生吲哚，苯丙氨酸脫氨陰性。
(二)、發(fā)酵圖2是芽孢桿菌生產SOD的發(fā)酵工藝流程示意圖，主要包括菌種活化、種子罐發(fā)酵及發(fā)酵罐培養(yǎng)。
1、菌種活化將高SOD含量的芽孢桿菌(Bacillus cereus)原菌種劃線接種于上述固體牛肉胨斜面培養(yǎng)基，接種前將裝有培養(yǎng)基的扁瓶在121℃條件下滅菌30分鐘，接種后在28-32℃條件下培養(yǎng)30-48小時，然后配成孢子液，用于種子罐接種。
2、種子罐發(fā)酵將種子罐滅菌后，裝入培養(yǎng)液再次滅菌，冷卻至30℃時，將孢子液接入培養(yǎng)液中，然后通入無菌空氣培養(yǎng)，即得種子罐發(fā)酵菌液。
3、發(fā)酵罐培養(yǎng)將發(fā)酵罐先滅菌，在裝入培養(yǎng)液后滅菌，然后保壓降溫至25-30℃，按1-2%的接種量將種子罐發(fā)酵菌液接入發(fā)酵罐培養(yǎng)液中培養(yǎng)，然后放罐供菌細胞離析。
4、滅菌及培養(yǎng)條件上述滅菌采用高壓蒸氣滅菌，即在121℃、壓力0.3-0.5Kg/cm2條件下，滅菌30分鐘，種子罐、發(fā)酵罐培養(yǎng)液滅菌攪拌速度230-250rpm/min，種子罐接種后，在28-35℃條件下培養(yǎng)8-10小時。發(fā)酵罐接種后，在28-35℃條件下培養(yǎng)18-30小時。通氣量1-2Vols/Vol/min，氧氣含量30-40%。
種子罐配方為蛋白胨0.4-0.6%，牛肉汁0.3-0.4%，NaCl0.4-0.6%，豆油0.2-0.4%，葡萄糖0.2-0.4%，pH值消毒前7.5，消毒后7.0-7.4。
發(fā)酵罐配方為牛肉汁0.3-0.5%，蛋白胨0.4-0.6%，NaCl0.4-0.6%，豆油0.3-0.5%，葡萄糖0.1-0.3%，淀粉0.3-0.5%，硫酸鎂0.05-0.1%，磷酸二氫鉀0.03-0.04%，碳酸鈣0.3-0.5%，500-1000μM的Cu、Zn、Mn、Fe，攪拌，pH值消毒前7.5-7.8，消毒后7.0-7.4。
5、發(fā)酵液要求發(fā)酵菌液含菌量在每毫升45億以上，芽孢成熟前放罐。pH值7.3-7.9。無雜菌污染。
(三)、菌細胞離析破碎圖3是芽孢桿菌細胞SOD粗提液工藝流程示意圖，主要包括細胞離析，細胞破碎等工藝。
1、菌細胞離析發(fā)酵罐菌液在控制流量200-400L/h注入離心機，離心機以4000-5000rpm/min速度將菌細胞離析沉淀，以菌糊自動流出，進入生理鹽水槽，經三次洗滌，離心后收集菌糊。
2、菌細胞破碎按菌糊與緩沖液以1∶1-2體積比例加入50mmol/L、pH7.8的磷酸鉀緩沖液，攪拌成菌液，按每升菌糊加入50mg溶菌酶，在0-4℃低溫條件下攪拌30分鐘。用250W功率超聲波細胞粉碎機在0-5℃低溫條件下對菌液處理10分鐘，每處理1分鐘間隔1分鐘。超聲波處理后對菌液鏡檢細胞破碎情況。然后將菌液以4000-5000rpm/min離心收集上清液作為SOD的粗提液。同時對粗提液方法進行SOD活性測定和蛋白濃度測定，計算SOD比活(U/mg)。
(四)、粗酶生產工藝圖4是芽孢桿菌SOD粗酶制劑生產工藝流程示意圖，由55%硫酸沉淀、75%硫酸沉淀及Sephadex G-75柱層析三步工藝組成。
1、55%硫酸銨沉淀將粗提液加入硫酸銨，使粗提液中硫酸銨達到55%飽和度。在22-28℃下利用攪拌器攪拌90分鐘，并靜置2-12小時。以10000×g離心30分鐘，分離出上清液，或采用膜過濾系統(tǒng)過濾得到濾液。
2、75%硫酸銨沉淀在55%硫酸銨沉淀后的上清液或濾液中，加入硫酸銨使其飽和度達到75%，在室溫下利用攪拌器攪拌90分鐘。以10000Xg離心30分鐘，或采用過濾系統(tǒng)過濾。將沉淀溶于最小量的5m mol/L、pH7.8磷酸鉀緩沖液中(內含2m mol/L EDTA)，然后用上述緩沖液和透析袋(分子量8000)進行動態(tài)透析，除去硫酸銨。透析時間24-48小時。
3、SephadexG-75柱層析用Sephadex G-75柱，預先用pH7.8、5m mol/L的磷酸鉀緩沖液平衡Sephadex G-75柱，將透析后的粗酶提取液加入到柱中，并用上述緩沖液洗脫。采用全自動分步收集系統(tǒng)收集洗脫液，通過檢測SOD活力，合并SOD活力高的收集液部分。對合并液檢測SOD活力和蛋白濃度;同時采用聚丙烯酰胺凝膠蛋白電泳和SOD電泳檢測SOD純度。
4、粗酶制劑質量要求粗酶提取液經Sephadex G-75層析收集的SOD高活力峰液，要求SOD比活達600以上，產率達50%以上。電泳檢測主要呈現(xiàn)SOD蛋白帶。
5、粗酶制劑產品經Sephadex G-75柱層析后的SOD酶液為粗酶制劑以液體制劑為產品，或通過冷凍干燥以粉末晶體制劑為產品。
(五)、精制酶層析生產工藝圖5是芽孢桿菌精制SOD制劑生產工藝流程示意圖，包括DE-52柱層析和不同種類SOD制劑的層析工藝。
1、DE-52柱層析將經Sephadex G-75柱層析后的粗酶液通過預先用pH7.8、5m mol/L的磷酸鉀緩沖液平衡的DE-52柱，用上述緩沖液洗脫至洗脫液中蛋白吸收(280nm)光密值低于0.05以下，并用0.005-0.3mol/L、pH7.8的磷酸鉀緩沖液進行梯度洗脫，并同時開始收集，經SOD活力檢測，將酶活力高的收集液合并，檢測SOD活力和蛋白濃度，并進行聚丙烯酰胺凝膠蛋白電泳和SOD電泳，檢測SOD純度。
2、精制酶質量要求經DE-52柱層析后收集的酶液，其SOD純度要求達到電泳純，SOD比活達3000以上。
3、不同種類SOD的層析工藝(1)Cu、Zn-SOD的層析工藝按前述層析生產工藝生產的SOD為Cu、Zn-SOD。
(2)Mn-SOD的層析工藝將上述經DE-52柱梯度洗脫前的洗脫液收集后，加熱到65℃，5分鐘后置于低溫下迅速冷卻，后又迅速加熱，依此重復3次。以10000×g離心分離出上清液，或通過加壓過濾分離出濾液。將上清液或濾液用聚乙二醇濃縮。
將濃縮液通過用pH5.5、40m mol/L的醋酸鉀緩沖液平衡的CM-52柱，并用pH5.5、0.04-0.20mol/L的醋酸鉀緩沖液進行梯度洗脫，同時進行收集，將酶活性高的收集液合并一起，檢測SOD活力，采用聚丙烯酰胺凝膠蛋白電泳和SOD電泳進行Mn-SOD純度鑒定，得到純Mn-SOD精酶制劑。
(3)Fe-SOD的層析工藝將經75%飽和度的硫酸銨沉淀、并已透析的粗酶液通過預先用pH5.5、0.01mol/L醋酸鉀緩沖液平衡的CM-52柱，以上述緩沖液洗脫，收集酶活力高的洗脫液，用pH7.8、50m mol/L磷酸鉀緩沖液透析。將透析液通過預先用pH2.8、5m mol/L的磷酸鉀緩沖液平衡的DE-52柱，用同樣緩沖液洗柱，并以5-50mmol/L、pH2.8的磷酸鉀緩沖液進行梯度洗脫，將符合純Fe-SOD標準的酶活力高的收集液合并，進行聚丙烯酰胺凝膠蛋白電泳和SOD電泳，檢查Fe-SOD純度。將符合純酶標準的收集液混合，加硫酸銨使達到80%飽和度，再經離心或過濾得到的沉淀為純Fe-SOD，將沉淀用pH7.8、50mmol/L磷酸鉀緩沖液透析，后經濃縮或通過加壓過濾為Fe-SOD精酶液。
4、精制酶層析生產過程要求在4℃條件下進行。對生產的產品作SOD電泳圖譜、原子吸收光譜、紫外和可見光吸收光譜能達到均一性的高活性純SOD。比活在3000u/mg以上。經最后層析得到的各種純SOD采用水透析、抽真空冷凍，干燥，即得純SOD晶體粉末產品。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比具有以下優(yōu)點(1)菌株SOD含量高精制SOD含量高達0.278mg/g生物量，比國際上八十年代末利用微生物生產SOD的原料含量高2.6-8.9倍。與SOD粗酶制劑相比較，要高10-50倍。
(2)篩選的該菌株并富含Cu.Zn-SOD、Mn-SOD和Fe-SOD三種SOD，其中Cu.Zn-SOD為SOD總量的21%，Mn-SOD為52%，F(xiàn)e-SOD為27%。
(3)本發(fā)明創(chuàng)立的SOD綜合層析生產工藝先進，不僅能為醫(yī)藥、獸藥、飲料、日用化工和作物生產，分別提供SOD粗制劑和精制劑，而且通過該流程能生產三種SOD。
(4)由于原料來源容易、低廉，便于工業(yè)化生產。
下面是
具體實施例方式用100公斤芽孢桿菌菌糊生產5.7克SOD。
1、從植物體組織中篩選出SOD含量達0.27mg/g的芽孢桿菌株。
2、用15噸發(fā)酵罐生產發(fā)酵菌液14噸。將發(fā)酵罐先滅菌，裝入培養(yǎng)液后再滅菌。
滅菌采用高壓蒸氣滅菌，即在121℃、壓力0.5Kg/cm2條件下，滅菌30分鐘，發(fā)酵罐培養(yǎng)液滅菌攪拌速度250rpm/min。然后降溫至28℃f，按2%的接種量將種子罐發(fā)酵菌液接入發(fā)酵罐。發(fā)酵罐接種后，在32℃條件下培養(yǎng)24小時。通氣量2Vols/Vol/min，氧氣含量40%。
發(fā)酵罐培養(yǎng)液配方為牛肉汁0.5%，蛋白胨0.5%，NaCl0.5%，豆油0.5%，葡萄糖0.2%，淀粉0.4%，硫酸鎂0.08%，磷酸二氫鉀0.04%，碳酸鈣0.5%，800μM的Cu、Zn、Mn、Fe，攪拌。pH值消毒前7.6，消毒后7.4。
發(fā)酵菌液含菌量在每毫升50億以上，芽孢成熟前放罐，pH為值7.5，無雜菌污染。
3、將菌細胞離析。發(fā)酵罐菌液在控制流量400L/h注入離心機，離心機以4000rpm/min速度將菌細胞離析沉淀以菌糊自動流出，進入生理鹽水槽，經三次洗滌，離心后收集到100公斤菌糊。
4、將菌細胞破碎。按菌糊與緩沖液以1∶1.5體積比例加入50mmol/L、pH7.8的磷酸鉀緩沖液，攪拌成菌液。按每升菌糊加入50mg溶菌酶，在4℃低溫條件下攪拌30分鐘。用250W功率超聲波細胞粉碎機在2℃低溫條件下對菌液處理10分鐘，每處理1分鐘間隔1分鐘。超聲波處理后對菌液鏡檢細胞破碎情況。然后將菌液以4000rpm/min離心。收集到115kg上清液作為SOD的粗提液。
5、提取粗酶。
(1)55%硫酸銨沉淀。將粗提液加入硫酸銨，使粗提液中硫酸銨達到55%飽和度。在22℃下利用攪拌器攪拌90分鐘，并靜置2小時，采用膜過濾系統(tǒng)過濾得到濾液。
(2)75%硫酸銨沉淀。在55%硫酸銨沉淀后的濾液中，加入硫酸銨使其飽和度達到75%，在室溫下利用攪拌器攪拌90分鐘，采用過濾系統(tǒng)過濾，將過濾物溶于最小量的5m mol/L、pH7.8磷酸鉀緩沖液中(內含2mmol/L EDTA)，然后用上述緩沖液和透析袋(分子量8000)進行動態(tài)透析，除去硫酸銨。透析時間40小時，得到108kg粗酶提取液。
(3)SephadexG-75柱層析。用Sephadex G-75柱，預先用pH7.8、5m mol/L的磷酸鉀緩沖液平衡Sephadex G-75柱，將透析后的粗酶提取液72kg加入到柱中，并用上述緩沖液洗脫。采用全自動分步收集系統(tǒng)收集洗脫液，合并SOD活力高的收集液部分。
6、SOD精制酶的制備(1)DE-52柱層析將經Sephadex G-75柱層析后的粗酶液通過預先用pH7.8、5m mol/L的磷酸鉀緩沖液平衡的DE-52柱，用上述緩沖液洗脫，將酶活力高的收集液合并，得到Cu.Zn-SOD純酶液。
7、不同種類SOD的精制酶的制備(1)Cu、Zn-SOD將CU.Zn-SOD純酶液濃縮、冷凍干燥可得到Cu.Zn-SOD純酶粉劑1.45kg。
(2)Mn-SOD將上述經DE-52柱梯度洗脫前的洗脫液收集，加熱到65℃，5分鐘后置于低溫下迅速冷卻，后又迅速加熱，依此重復3次，通過加壓過濾分離出濾液，將濾液濃縮。
將濃縮液通過用pH5.5、40m mol/L的醋酸鉀緩沖液平衡的CM-52柱，并用pH5.5、0.04-0.20mol/L的醋酸鉀緩沖液進行梯度洗脫，同時進行收集，將酶活性高的收集液合并一起，得到Mn-SOD純酶液，再經濃縮、冷凍干燥得到Mn-SOD純酶粉＜3.5克。
(3)Fe-SOD將經75%飽和度的硫酸銨沉淀、并已透析的粗酶液36kg通過預先用pH5.5、0.01mol/L醋酸鉀緩沖液平衡的CM-52柱，以上述緩沖液洗脫，收集酶活力高的洗脫液，用pH7.8、50m mol/L磷酸鉀緩沖液透析。將透析液通過預先用pH2.8、5m mol/L的磷酸鉀緩沖液平衡的DE-52柱，用同樣緩沖液洗柱，并以5-50mmol/L、pH2.8的磷酸鉀緩沖液進行梯度洗脫，將符合純Fe-SOD標準的酶活力高的收集液合并，將符合純酶標準的收集液混合，加硫酸銨使達到80%飽和度，再經過濾得到的為純Fe-SOD，將過濾物用pH7.8、50mmol/L磷酸鉀緩沖液透析，通過加壓過濾得到Fe-SOD純酶液，再經濃縮、冷凍干燥得到Fe-SOD純酶粉劑0.75克。
共獲得SOF純酶粉劑5.7克。
權利要求
1.一種利用芽孢桿菌生產超氧化物歧化酶(SOD)的方法，特征在于本法包括(1)SOD高含量菌株篩選(2)發(fā)酵(3)菌細胞離析破碎(4)粗酶生產工藝和精制酶層析生產工藝。
2.根據(jù)權利要求1所述的SOD生產方法，其特征在于所述的SOD高含量芽孢桿菌的篩選按以下步驟進行(1)分離根據(jù)不同的用途或需要，從人、動物、植物體表用30-50ml滅菌水淋洗，或取動物、植物組織，土壤1-10g經研磨轉入放有40ml滅菌水的三角瓶中按200-300rpm/min振蕩10分鐘，靜置半分鐘后以上清液作為菌源水，用滅菌吸管吸取菌源水25ml注入滅菌試管，將試管置80℃水中處理10分鐘，用接種環(huán)醮菌液在牛肉汁蛋白胨培養(yǎng)基(蛋白胨5g，牛肉汁3g、氯化鈉5g、瓊脂粉15g、配1000ml水)平板上劃線，置28-35℃下培養(yǎng)24小時，仔細選取不同菌落，進行涂片、染色鏡檢，為芽孢桿菌的，轉移到牛肉蛋白胨培養(yǎng)基斜面上編號以待酶活力測定;(2)上清液制備將菌株接種于裝有150ml-250ml液體牛肉汁蛋白胨培養(yǎng)基的滅菌三角瓶中(培養(yǎng)基成份以上述成份不含瓊脂粉)，在27-34℃下?lián)u床振蕩培養(yǎng)24-30小時，采用4000rpm/min、4℃離心20分鐘，收集菌細胞2克以上，用0.9%NaCl溶液洗滌3次，對菌糊稱重后用5mmol/L、pH7.8磷酸鈉緩沖液(內含2mmol/LEDTA、2mmol/L巰基乙醇)按菌∶液為1∶1-2比例加入，攪拌成懸浮液，按每克菌加入0.05mg溶菌酶，在冰浴上處理30分鐘，并輕輕攪拌，用100w功率超聲波發(fā)生器于冰浴上超聲處理共10分鐘，每次處理1分鐘間隔1分鐘，4000rpm/min，4℃離心20分鐘，取上清液供測SOD活性;(3)酶活力測定本發(fā)明采用改進的高靈敏度的氯化硝基氮藍四唑(NBT)光還原法測定SOD活力，即在3ml0.05mol/L、pH7.8的磷酸緩沖液反應液中(內含有2.7ml 13×10-3mol/L的Met、0.1ml 75×10-6mol/L的NBT、0.1ml 100×10-9mol/L的EDTA、0.1ml2×10-6mol/L的VB2)加入5-30μl酶液，在30℃、4000lux光照條件下處理30分鐘，在580nm下測定光密度，以緩沖液代替酶液作空白測定酶活性(酶活性單位采用抑制NBT光化還原50%為一個酶活性單位)，篩選出酶活性最高的菌株，進行中試，SOD含量高，在50℃和pH4-9條件下酶活力穩(wěn)定，即可用于生產;(4)菌種培養(yǎng)、換代、保藏將菌種劃線接種于牛肉蛋白胨培養(yǎng)基(蛋白胨5g，牛肉汁3g、NaCl5g，瓊脂粉15g，配1000ml水)斜面，4℃(短期)或-10℃(長期)冰箱或冷庫保存，用畫線法定期轉管傳代。
3.根據(jù)權利要求1所述的SOD生產方法，其特征在于所述的發(fā)酵過程按以下工藝進行(1)菌種活化將高SOD含量的芽孢桿菌(Bacillus cereus)原菌種劃線接種于固體牛肉胨斜面培養(yǎng)基，接種前將裝有培養(yǎng)基的扁瓶在121℃條件下滅菌30分鐘，接種后在28-32℃條件下培養(yǎng)30-48小時，然后配成孢子液，用于種子罐接種;(2)種子罐發(fā)酵將種子罐滅菌后，裝入培養(yǎng)液再次滅菌，冷卻至30℃時，將孢子液接入培養(yǎng)液中，然后通入無菌空氣培養(yǎng)，即得種子罐發(fā)酵菌液;(3)發(fā)酵罐培養(yǎng)將發(fā)酵罐先滅菌，在裝入培養(yǎng)液后滅菌，然后保壓降溫至25-30℃，按1-2%的接種量將種子罐發(fā)酵菌液接入發(fā)酵罐培養(yǎng)液中培養(yǎng)，當發(fā)酵菌液含菌量在每毫升45億以上，芽孢成熟前有少量芽孢脫落時放罐供菌細胞離析滅菌及培養(yǎng)條件a.滅菌采用高壓蒸氣滅菌，即在121℃、壓力0.3-0.5Kg/cm2條件下，滅菌30分鐘，種子罐、發(fā)酵罐培養(yǎng)液滅菌攪拌速度230-250rpm/min，種子罐接種后，在28-35℃條件下培養(yǎng)8-10小時。發(fā)酵罐接種后，在28-35℃條件下培養(yǎng)18-30小時，通氣量1-2Vols/Vol/min，氧氣含量30-40%;b.種子罐配方為蛋白胨0.4-0.6%，牛肉汁0.3-0.4%，NaCl0.4-0.6%，豆油0.2-0.4%，葡萄糖0.2-0.4%，pH值消毒前7.5，消毒后7.0-7.4;c.發(fā)酵罐配方為牛肉汁0.3-0.5%，蛋白胨0.4-0.6%，NaCl0.4-0.6%，豆油0.3-0.5%，葡萄糖0.1-0.3%，淀粉0.3-0.5%，硫酸鎂0.05-0.1%，磷酸二氫鉀0.03-0.04%，碳酸鈣0.3-0.5%，500-1000μM的Cu、Zn、Mn、Fe，攪拌。pH值消毒前7.5-7.8，消毒后7.0-7.4;發(fā)酵液要求當發(fā)酵菌液含菌量在每毫升45億以上，芽孢成熟前放罐，pH值7.3-7.9，無雜菌污染。
4.根據(jù)權利要求1所述的SOD生產方法，其特征在于所述的菌細胞離析破碎主要包括以下工藝過程(1)菌細胞離析發(fā)酵罐菌液以200-400L/h的控制流量注入離心機，離心機以4000-5000rpm/min速度將菌細胞離析沉淀以菌糊自動流出，進入生理鹽水槽，經三次洗滌，離心后收集菌糊;(2)菌細胞破碎按菌糊與緩沖液以1∶1-2體積比例加入50mmol/L、pH7.8的磷酸鉀緩沖液，攪拌成菌液，按每升菌糊加入50mg溶菌酶，在0-4℃低溫條件下攪拌30分鐘，用250W功率超聲波細胞粉碎機在0-5℃低溫條件下對菌液處理10分鐘，每處理1分鐘間隔1分鐘，超聲波處理后對菌液鏡檢細胞破碎情況，然后將菌液以4000-5000rpm/min離心，收集上清液作為SOD的粗提液，同時對粗提液方法進行SOD活性測定和蛋白濃度測定，計算SOD比活(U/mg)。
5.根據(jù)權利要求1所述的SOD生產方法，其特征在于所述的粗酶生產工藝過程如下(1)55%硫酸銨沉淀將粗提液加入硫酸銨，使粗提液中硫酸銨達到55%飽和度，在22-28℃下利用攪拌器攪拌90分鐘，并靜置2-12小時，以10000×g離心30分鐘，分離出上清液(或采用膜過濾系統(tǒng)過濾得到濾液);(2)75%硫酸銨沉淀在55%硫酸銨沉淀后的上清液或濾液中，加入硫酸銨使其飽和度達到75%，在室溫下利用攪拌器攪拌90分鐘，以10000Xg離心30分鐘(或采用過濾系統(tǒng)過濾)，將沉淀溶于最小量的5m mol/L、pH7.8磷酸鉀緩沖液中(內含2m mol/L EDTA)，然后用上述緩沖液和透析袋(分子量8000)進行動態(tài)透析，除去硫酸銨，透析時間24-48小時;(3)SephadexG-75柱層析先用pH7.8、5m mol/L的磷酸鉀緩沖液平衡Sephadex G-75柱，將透析后的粗酶提取液加入到柱中，并用上述緩沖液洗脫，采用全自動分步收集系統(tǒng)收集洗脫液，通過檢測SOD活力，合并SOD活力高的收集液部分;對合并液檢測SOD活力和蛋白濃度;同時采用聚丙烯酰胺凝膠蛋白電泳和SOD電泳檢測SOD純度，要求SOD比活達800以上，產率達50%以上，電泳檢測主要呈現(xiàn)SOD蛋白帶;粗酶制劑產品經Sephadex G-75柱層析后的SOD酶液為粗酶制劑以液體制劑為產品，或通過冷凍干燥以粉末晶體制劑為產品。
6.根據(jù)權利要求1所述的SOD生產方法，其特征在于所述的精制酶層析生產工藝包括DE-52柱層析和不同種類SOD制劑的層析工藝(1)DE-52柱層析將經Sephadex G-75柱層析后的粗酶液通過預先用pH7.8、5m mol/L的磷酸鉀緩沖液平衡的DE-52柱，用上述緩沖液洗脫至洗脫液中蛋白吸收(280nm)光密值低于0.05以下，并用0.005-0.3mol/L、pH7.8的磷酸鉀緩沖液進行梯度洗脫，并同時開始收集，經SOD活力檢測，將酶活力高的收集液合并，檢測SOD活力和蛋白濃度，并進行聚丙烯酰胺凝膠蛋白電泳和SOD電泳，檢測SOD純度;其純度要求達到電泳純，SOD比活達3000以上;(2)不同種類SOD的層析工藝(a)Cu、Zn-SOD的層析工藝按DE-52柱層析生產工藝生產的SOD即為Cu、Zn-SOD;(b)Mn-SOD的層析工藝將上述經DE-52柱梯度洗脫前的洗脫液收集后，加熱到65℃，5分鐘后置于低溫下迅速冷卻，后又迅速加熱，依此重復3次。以10000×g離心分離出上清液(或通過加壓過濾分離出濾液)，將上清液(或濾液)用聚乙二醇濃縮，將濃縮液通過用pH5.5、40m mol/L的醋酸鉀緩沖液平衡的CM-52柱，并用pH5.5、0.04-0.20mol/L的醋酸鉀緩沖液進行梯度洗脫，同時進行收集，將酶活性高的收集液合并一起，檢測SOD活力，采用聚丙烯酰胺凝膠蛋白電泳和SOD電泳進行Mn-SOD純度鑒定，得到純Mn-SOD精酶制劑;(c)Fe-SOD的層析工藝將經75%飽和度的硫酸銨沉淀、并已透析的粗酶液通過預先用pH5.5、0.01mol/L醋酸鉀緩沖液平衡的CM-52柱，以上述緩沖液洗脫，收集酶活力高的洗脫液，用pH7.8、50m mol/L磷酸鉀緩沖液透析，將透析液通過預先用pH2.8、5m mol/L的磷酸鉀緩沖液平衡的DE-52柱，用同樣緩沖液洗柱，并以5-50mmol/L、pH2.8的磷酸鉀緩沖液進行梯度洗脫，將符合純Fe-SOD標準的酶活力高的收集液合并，進行聚丙烯酰胺凝膠蛋白電泳和SOD電泳，檢查Fe-SOD純度，將符合純酶標準的收集液混合，加硫酸銨使達到80%飽和度，再經離心或過濾得到的沉淀為純Fe-SOD，將沉淀用pH7.8、50mmol/L磷酸鉀緩沖液透析，后經濃縮或通過加壓過濾為生產的Fe-SOD;(3)、精制酶層析生產過程要求在4℃條件下進行，對生產的產品作SOD電泳圖譜、原子吸收光譜、紫外和可見光吸收光譜能達到均一性的高活性純SOD，比活在3000u/mg以上，經最后層析得到的各種純SOD采用水透析、抽真空冷凍干燥，即得純SOD晶體粉末產品。
全文摘要
本發(fā)明涉及超氧化物歧化酶(SOD)的一種新菌種及生產工藝。本發(fā)明利用芽孢桿菌(Bacillus)菌體生產SOD，其精制SOD含量高達0.278毫克/克生物量，比國際上八十年代末利用微生物生產SOD的原料含量高2.6—8.9倍。本發(fā)明包括SOD高含量菌株篩選、發(fā)酵、菌細胞離析破碎、粗酶生產和精制酶層析生產工藝。用本發(fā)明可以同時生產出Cu、Zn-SOD、Mn-SOD和Fe-SOD三種SOD，且SOD活性高。
文檔編號C12N1/20GK1058614SQ91108549
公開日1992年2月12日 申請日期1991年9月2日 優(yōu)先權日1991年9月2日
發(fā)明者梅汝鴻, 夏立秋, 丁學知, 計平生, 陳璧, 唐文華, 吳加志, 嚴志農, 張守安, 奉公 申請人:北京農業(yè)大學