專利名稱：降低單克隆抗體不均一性的方法
由雜交瘤細胞大規(guī)模生產(chǎn)單克隆抗體已在許多疾病的預后、診斷和治療中引起了一場革命。單克隆抗體也可用于確定各種自然狀態(tài)(如妊娠)的各階段。但是，發(fā)現(xiàn)許多來自雜交瘤的抗體呈現(xiàn)不均一形式，這嚴重地阻礙了以高產(chǎn)率由生產(chǎn)株系獲得單克隆抗體所需的純化和分離操作。陽離子交換色譜表明，由體外培養(yǎng)細胞分泌的抗體至少有三種不同的不均一形式。這些形式的相對含量可能不同。由腹水產(chǎn)生的抗體尚未發(fā)現(xiàn)達到這種程度的不均一形式，但從商業(yè)角度看，由腹水大量生產(chǎn)抗體太繁瑣而且昂貴。
引起上述不均一性的生化基礎是在抗體重鏈羧基末端連有一個或多個額外氨基酸。鑒于由抗體基因的DNA順序推出的氨基酸順序確實含有額外氨基酸，因此，末端氨基酸通常很可能是在內(nèi)加工過程中或細胞分泌抗體時被除去。在三種不均一形式中，其中之一是在兩條重鏈上均不含額外末端氨基酸的抗體。第二種不均一形式在一條重鏈上含有一個額外氨基酸，而第三種形式在兩條重鏈上均含有額外氨基酸。
本發(fā)明包括一種從任何同型的不均一抗體的重鏈上特異地切除額外氨基酸，從而將三種形式全部轉化為一種基本純凈的均一混合物的方法。單克隆抗體技術的開發(fā)和應用取決于能否得到大量的基本均一的抗體。由于不能很容易地對分泌抗體的各種不均一形式進行純化和定性，因此在某種程度上阻礙了技術開發(fā)。本發(fā)明的實用性和特別重要之處在于，它在純化之前就可將大多數(shù)不均一抗體轉化為一種基本均一的形式。這一轉化使抗體的產(chǎn)率提高，并且具有更確定的生化特性，另外，還減少了純化過程中不均一抗體的污染。此外，擁有高度純化的單一形式抗體會大大增加后續(xù)的修飾反應(如免疫結合或固定反應)的可重復性和一致性。
就在此公開并請求保護的本發(fā)明的目的而言，下列術語定義如下。
抗體生產(chǎn)細胞在體外或體內(nèi)產(chǎn)生抗體的任何細胞、轉化細胞或雜交瘤。
腹水液從感染腹水瘤的動物腹腔內(nèi)排出的液體。
CP羧肽酶。
CPIP比例羧肽酶單位數(shù)與免疫球蛋白毫克數(shù)的比例。
培養(yǎng)液任何含有抗體的液體，包括(但不限于)直接取自培養(yǎng)物的液體、從培養(yǎng)物中取出后濃縮的液體、或者含有預先分離或純化過的抗體的液體。
G甘氨酸殘基。
不均一性指分泌的抗體有各種不同的生化形式這一現(xiàn)象，例如(但不限于)在一條或兩條抗體重鏈的羧基末端有一個或多個額外氨基酸。
不均一抗體呈現(xiàn)出各種不同生化形式的抗體，例如在一條或兩條抗體重鏈的羧基末端有一個或多個額外氨基酸。
雜交瘤分泌一種單克隆抗體的細胞或細胞系，該細胞系由骨髓瘤細胞與經(jīng)過適當免疫的動物的脾細胞融合而產(chǎn)生。
K賴氨酸殘基。
P脯氨酸殘基。
初級均一形式指抗體重鏈羧基末端不含有額外氨基酸的形式。
重組DNA克隆載體任何自主復制或整合的試劑，包括(但不限于)質粒，它包含一個DNA分子，該分子上可以或已經(jīng)加入一個或多個其他DNA片段。
轉染通過噬菌體DNA顆粒將DNA引入受體宿主細胞。
轉化體已經(jīng)轉化的受體宿主細胞。
轉化將DNA引入受體宿主細胞，改變其基因型，從而導致受體細胞發(fā)生變化。


圖1顯示單克隆抗體CEM231不均一形式間的區(qū)別的簡圖。
本發(fā)明是一種降低由抗體生產(chǎn)細胞分泌的抗體的不均一性的方法，所述方法包括改變一條或兩條抗體重鏈的羧基末端氨基酸。本發(fā)明最好的實例是選擇性地除去一條或兩條抗體重鏈羧基末端的一個或多個氨基酸。用于產(chǎn)生這一所期望結果的一種方法包括將含有分泌抗體的培養(yǎng)液pH降至足以降低所述抗體不均一性的pH，然后在一定溫度下將該培養(yǎng)液保溫一段時間，保溫時間和保溫溫度應足以降低抗體的不均一性。一般可將pH降至～3.0至～5.5之間，但該反應在pH～3.5至pH～4.5之間進行更為有效。在pH～4.0至pH～4.5之間進行則甚至更為有效，但就降低許多抗體的不均一性而言，優(yōu)選pH為～4.0。
保溫溫度和時間也會影響從不均一抗體重鏈除去羧基末端氨基酸的速率。保溫時間可以是幾秒至數(shù)天內(nèi)的任一長度，但最好使反應持續(xù)～1至～72小時。在許多情況下，使反應進行～4至～24小時更好。但是根據(jù)抗體的生化特性和其它反應參數(shù)，保溫反應僅在24小時內(nèi)即可達～95%完全，也可能需要～48至～72小時。保溫溫度的范圍很寬，但該反應最好在～2℃至～37℃之間進行。在～4℃至～37℃之間進行反應比較有利，在～4℃至～30℃之間也比較有利。對許多抗體來說，最優(yōu)選的反應溫度范圍為～4℃至～25℃，而最優(yōu)選的溫度為～25℃。
降低分泌抗體不均一性的另一方法包括在含有分泌抗體的培養(yǎng)液中，以足以降低所述抗體不均一性的體積加入腹水液，然后在足以降低抗體不均一性的溫度和pH下，將該培養(yǎng)液保溫足以降低抗體不均一性的一段時間。盡管很大體積范圍內(nèi)的腹水液均可使反應發(fā)生，但比較有效的是采用這樣一種混合物，其中所加入的腹水液和培養(yǎng)液的體積比為～2∶1至～1∶20。為使反應迅速而完全，加入腹水的體積以～1∶1至～1∶10較好，而～1∶1至～1∶2則更好。在優(yōu)選的反應液中，腹水液與培養(yǎng)液的體積比應為～1∶1。
保溫時間、保溫溫度和培養(yǎng)液pH也會影響上述腹水法的速度和效率。有利的保溫時間范圍從幾秒到許多天，但如果時間范圍在～1至～72小時之間則反應比較有效。如果保溫時間為～16至～72小時通常更有利于反應，而在～16至～48小時之間甚至更好。最優(yōu)選的反應時間為～16小時。反應溫度的范圍幾乎是無限制的，但較為有效的是在～2℃至～42℃之間。反應溫度在～2℃至～37℃之間更有利于反應，在～26℃至～37℃之間甚至更好。最優(yōu)選的反應溫度為～37℃。培養(yǎng)液pH也可加速或減慢反應，而且就防止抗體解離而言，pH也是很重要的。培養(yǎng)液pH可在很寬范圍內(nèi)變化，但如果pH在～4.0至～9.0之間則十分有效。pH在～7.5至8.5之間反應較為良好，在～7.5至～8.0之間則更好。培養(yǎng)液最佳pH為～7.5，因此，與低pH法相反，腹水法可在生理pH下實施。
降低分泌抗體不均一性的另一方法包括在含有分泌抗體的培養(yǎng)液中以足以降低所述抗體不均一性的CPIP比例加入羧肽酶，然后在足以降低抗體不均一性的溫度和pH下保溫該培養(yǎng)液足以降低抗體不均一性的一段時間。盡管很大范圍的CPIP比例都可使反應發(fā)生，但比較有效的是采用～0.01至～10.0之間的CPIP比例。以～0.2至～8.0之間的CPIP比例進行反應較好，采用～0.2至～1.0之間的CPIP比例更好。一般最優(yōu)選的CPIP比例為～0.4，但技術人員會認識到，高濃度的酶可使反應以較高的速度進行。技術人員還會認識到，許多不同類型的羧肽酶是本領域公知的，例如CpA、CpB、CpC、CpG、CpP、CpW、CpY等，這些酶都可用于本發(fā)明的方法。此外，羧肽酶的單位是標準化的，這在本領域內(nèi)是公知的，因此本發(fā)明的實施決不僅限于任何特定羧肽酶供貨商所限定的單位。技術人員還會認識到，可以將酶固定在固相載體上，這樣在純化過程中就不必除去酶。
保溫時間、保溫溫度和培養(yǎng)液pH也會影響上述羧肽酶法的速度和效率。有利的保溫時間范圍是數(shù)秒到幾天，但如果時間范圍在～1至～48小時之間則反應比較有效。保溫時間在～1至～24小時之間時常常更有利于反應，在～1至～16小時之間甚至更好。保溫時間為～5至～16小時之間更進一步有利于該反應，最有利的保溫時間為～5小時。該反應的溫度范圍幾乎是沒有限制的，但溫度在～1℃至～42℃之間較為有利。溫度在～15℃至～37℃之間更有利于反應，如果在～20℃至～30℃之間則甚至更為有利。最優(yōu)選的反應溫度是～23℃。培養(yǎng)液pH也可加快或減慢反應速度，該pH可在很寬的范圍內(nèi)變化，但在～6.0至～9.0之間較為有效。pH在～7.0至～8.0之間較有利于反應的進行，如果pH在～7.5至～8.0之間則更好。最優(yōu)選的培養(yǎng)液pH為～7.5。
技術人員會認識到，通過改變培養(yǎng)液pH、保溫時間、保溫溫度、腹水液比例或CPIP比例，任何上述方法都可滿足任何免疫球蛋白純化操作的需要。在降低不均一性的反應之后，可以采用本領域公知的方法從培養(yǎng)液中分離不均一性較低的抗體。技術人員很容易認識到，也可采用上述方法降低已經(jīng)過純化的抗體的不均一性。
采用多種其他化學處理法除去肽中的羧基末端殘基，可以得到基本相同的結果。例如，在某些情況下，可采用肼解、氚化、形成乙內(nèi)酰脲，而后用乙酰氧肟酸處理。實際上，能夠從免疫球蛋白片段的羧基末端除去一個或多個肽的任何化學反應都將落在本發(fā)明的范圍內(nèi)。特別是，能夠從羧基末端切除二肽的二肽羧肽酶也可用于實施本方法，任何能夠在羧基末端區(qū)的賴氨酸殘基以內(nèi)進行特異切割的其他酶也可用于實施本方法。
實施本發(fā)明的另一方法是選擇性地從編碼免疫球蛋白重鏈的基因中除去編碼羧基末端賴氨酸的密碼子。技術人員可以認識到，只要推測出了編碼抗體的DNA順序，則采用重組DNA技術除去編碼羧基末端肽的密碼子就屬普通技術。這一截短基因在轉染或轉化細胞中表達后，基因產(chǎn)物將包括一條抗體鏈，它與野生型抗體鏈的不同僅在于除去了羧基末端肽。另外，還可利用重組DNA技術在多肽的羧基末端加入編碼不同殘基的密碼子，從而改變羧基末端的電荷而降低抗體群的不均一性。因此，改變抗體羧基末端從而降低抗體群不均一性的任何操作，不論是化學操作還是生物學操作，均在本發(fā)明范圍內(nèi)。
本發(fā)明的優(yōu)選實例最好用單克隆抗體CEM231的轉化來說明。單克隆抗體CEM231是由雜交瘤CEM231.6.7分泌的，該雜交瘤于1988年1月7日保藏在美國典型培養(yǎng)物收集中心(ATCC，12301ParklawnDrive，Rockville，MD20852)，并成為該機構的永久性原種培養(yǎng)收集物的一部分。它可作為抗體來源和貯存庫而為公眾所得到，其登記號為ATCCHB9620。
該雜交瘤在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，將無細胞培養(yǎng)物濃縮40-115倍，然后通過H3PO4滴定將培養(yǎng)液pH降至4.0。將培養(yǎng)液在25℃下保溫24小時后，培養(yǎng)液中95%以上的抗體轉化為初級均一形式。如陽離子交換色譜所證實，在該初級均一形式中，抗體鏈的羧基末端不含額外氨基酸。此外，在某些情況下，在反應混合物中加入螯合劑如EDTA(1-10mM)可以提高這一轉化方法的效率。
也可采用腹水法將不均一CEM231轉化為初級均一形式。按1∶1的體積比將濃縮的CEM231培養(yǎng)液與腹水液混合，然后在pH7.4、37℃下保溫。該反應在16小時內(nèi)將幾乎等摩爾濃度的不均一抗體轉化為80%以上的初級均一抗體。在某些情況下，在反應混合物中加入螯合劑如EDTA(1-10mM)可以提高該轉化方法的效率。任何腹水液都可用于這一轉化方法，但最好采用這樣一類腹水液，即該腹水液中所含抗體的生化特性與被轉化抗體基本不同。這樣，在純化過程中就可利用這些特性的不同防止由腹水產(chǎn)生的抗體與轉化后的抗體之間產(chǎn)生交叉污染。
還可采用羧肽酶法將不均一CEM231轉化為初級均一形式。雜交瘤在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，將無細胞培養(yǎng)物濃縮70倍，然后以3.0的CPIP比例將羧肽酶B加到培養(yǎng)物中。該培養(yǎng)液在23℃下保溫5小時后，培養(yǎng)液中95%以上的抗體被轉化為初級均一形式。
除了單克隆抗體CEM231的轉化外，上述方法還用于降低多種抗體的不均一性，這些抗體來自雜交瘤細胞系和轉化或轉染細胞系。表Ⅰ列出了各種受試抗體的代表性實例和所得結果。
表Ⅰ轉化反應總結抗體方法結果CEV124pH44℃，4-24小時，＞80%峰QC1054pH44℃，43小時，60%峰TSE031pH4(低濃度)4℃，48小時，＞80%峰TSE031pH4(高濃度)4℃，14小時，＞80%峰AFU212pH44℃，56小時，＞80%峰ZHB068pH44℃，72小時，＞80%峰CEV124腹水37℃，16小時，＞80峰QC1054腹水37℃，24小時，69%峰HCU061腹水37℃，17小時，＞80%峰CEV124CP23℃，5小時，＞80%峰
QC1054CP22℃，16小時，＞80%峰CEM231CP22℃，16小時，＞80%峰(嵌合的)CEM231/CP22℃，16小時，＞80%峰CHA255(雙功能的)技術人員容易認識到，本發(fā)明方法還可用于降低非雜交瘤細胞產(chǎn)生的抗體的不均一性。特別是可以將編碼單克隆抗體的基因連入各種重組DNA克隆載體，然后將其轉化或轉染入適宜的宿主細胞，包括細菌或酵母。這樣，在適宜的條件下，轉化或轉染細胞將產(chǎn)生并分泌單克隆抗體。在用重組法轉化或轉染的宿主細胞中，還可以構建并表達嵌合抗體，該抗體含有的來自一個物種的可變區(qū)與來自另一個物種的恒定區(qū)相連。參見Boulianneetal.，Nature312643-646，1984，其技術內(nèi)容在此列為參考文獻。此外，本發(fā)明方法可用于降低人抗體或雙功能抗體的不均一性。本發(fā)明方法還可用于降低由血液、血清或其它體液中分離的抗體的不均一性。
本領域技術人員還能理解，許多不同的化合物都可用于降低培養(yǎng)液的pH，所有這些等同物都在本發(fā)明的范圍內(nèi)。采用腹水法時，抗體培養(yǎng)液與腹水液可以采用多種不同的比例，所有這些等同法均在本發(fā)明的范圍內(nèi)。此外，采用羧肽酶法降低抗體的不均一性時，可采用多種CPIP比例，所有這些也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。此外，最佳轉化所需要的保溫時間和溫度及培養(yǎng)液pH可根據(jù)所用抗體的具體生化特性而改變。在轉化過程開始前濃縮培養(yǎng)液也可能是有利的，但這些新方法對濃縮樣品和稀釋樣品都適用，因此，本發(fā)明不受樣品濃度的限制。
雜交瘤或其它分泌抗體的細胞系可在培養(yǎng)瓶或連續(xù)流動發(fā)酵罐中進行培養(yǎng)?？梢圆捎脽o血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)物的pH維持在約6.5至8.5的范圍內(nèi)，溫度范圍為30℃至40℃。每個分泌抗體的細胞系都有其自身的最佳條件要求，技術人員很容易確定這些條件。
下列實施例對此處所公開的發(fā)明作進一步的說明和描述。但本發(fā)明的范圍并不由于任何下列實施例而受到限制，給出試劑或儀器的來源僅僅是為了方便，決不限制本發(fā)明。根據(jù)需要，解釋并描述了實施本發(fā)明的實際方法。
實施例1雜交瘤CEM231.6.7的培養(yǎng)分泌單克隆抗體CEM231的雜交瘤CEM231.6.7得自ATCC。雜交瘤CEM231.6.7是ATCC的永久性原種培養(yǎng)收集物的一部分，并可作為抗體來源和貯存庫而為公眾所得，其登記號為ATCCHB9620。使冷凍細胞迅速融化，然后立即用添加有4mM谷氨酰胺的約10mlHL1培養(yǎng)液洗滌。HL1培養(yǎng)液購自VentrexofPortland，Maine。將細胞置于T培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)至獲得高密度細胞。
在兩個裝有HL1培養(yǎng)基(添加有4mM谷氨酰胺)的250ml旋轉瓶中接種正在分泌抗體的CEM231.6.7細胞，接種量為每毫升約300，000個細胞。將細胞在37℃下培養(yǎng)約48小時，直到細胞密度達到約900，000個細胞/ml。然后在每個旋轉瓶中加入另一等分的谷氨酰胺，使培養(yǎng)液中谷氨酰胺的終濃度達4mM。然后將含有CEM231.6.7細胞的旋轉瓶在37℃下再培養(yǎng)8至10天。
最后一次培養(yǎng)后，將細胞培養(yǎng)液倒入兩個250ml的瓶中，在BeckmannJ2-21離心機中，用BeckmannJA8轉子以約10，000rpm離心20分鐘。回收約375ml上清液。初步定量表明，抗體濃度約為80μg/ml。然后用裝有YM1076mm濾膜的400ml攪拌細胞濃縮儀將培養(yǎng)液濃縮至約40ml，該濃縮儀購自AmiconCorporation，ScientificSystemsDivision，21HartwellAvenue，Lexington，MA02173。用裝有YM10濾膜的50mlAmicon攪拌細胞濃縮儀將這40ml培養(yǎng)液進一步濃縮至約3.27ml。最后用1.2μm的25mmAcrodisc過濾濃縮的上清液。如果需要，可將所收集的上清液在-70℃下冷凍。
實施例2用低pH法轉化抗體CEM231用1N H2PO4滴定，將抗體CEM231的無細胞濃縮液調至pH4.0。然后將該樣品在25℃下保溫24小時，在Mōno-S HR 5/5柱上進行陽離子交換層析以測定不均一性，洗脫液為pH4.5的0.17M乙酸鈉緩沖液及0.0-0.2M NaCl梯度。實驗數(shù)據(jù)證明，24小時后樣品中已沒有可檢測的不均一性。
實施例3用腹水液轉化抗體CEM231基本按照Galfre和Milstein(MethodsinEnzymology73∶43-44，1981)的方法，從產(chǎn)腹水液的小鼠體內(nèi)分離腹水液。上述文獻的技術內(nèi)容在此列為參考文獻。將經(jīng)過純化的單克隆抗體CEM231分成若干等分，每等分約含200μg抗體。將各等分抗體與腹水液混合，腹水液與抗體培養(yǎng)液的比例為1∶2。將該樣品在24℃下保溫24小時，在Mono-SHR5/5柱上進行陽離子交換層析以測定不均一性，洗脫液為pH4.4的0.17M乙酸鈉緩沖液和0.0-0.2MNaCl梯度。實驗數(shù)據(jù)證明，24小時后，80%以上的抗體被轉化為初級均一形式，而不加腹水液保溫的對照樣品仍含有幾乎等摩爾濃度的三種不均一形式。
實施例4用CP法轉化抗體CEM231將約5mg等分的抗體CEM231濃縮液與約50μg羧肽酶B一起于23℃下保溫5小時。羧肽酶B購自Calbiochem，P.O.Box12087，SanDiego，California92112，其酶活性為295IU/mg。因此，該反應的CPIP比例相當于約3.0。保溫5小時后，在Mono-SHR5/5柱上進行陽離子交換層析以測定樣品的不均一性，洗脫液為pH4.5的0.17M乙酸鈉緩沖液和0.0-0.2MNaCl梯度。實驗數(shù)據(jù)證明，樣品中95%以上的抗體被轉化為初級均一形式，而未處理的抗體仍保留幾乎等摩爾比例的不均一形式。
權利要求
1.一種降低產(chǎn)抗體細胞所分泌的抗體的不均一性的方法，所述方法包括在一條或兩條抗體重鏈的羧基末端除去或加入一個或多個氨基酸。
2.權利要求1所述的方法，其特征在于，選擇性地除去一條或兩條抗體重鏈羧基末端的一個或多個氨基酸。
3.權利要求2所述的方法，其特征在于(a)以足以降低所述抗體不均一性的CPIP比例，在含有分泌抗體的培養(yǎng)液中加入羧肽酶;(b)在足以降低所述抗體不均一性的溫度和pH下，將所述培養(yǎng)液保溫足以降低所述抗體不均一性的一段時間;然后從培養(yǎng)液中分離出降低了不均一性的所述抗體。
4.權利要求3所述的方法，其特征在于，CPIP比例在～0.01至～10.0之間。
5.權利要求4所述的方法，其特征在于，保溫時間在～1至～48小時之間。
6.權利要求5所述的方法，其特征在于，保溫溫度在～1℃至～42℃之間。
7.權利要求6所述的方法，其特征在于，培養(yǎng)液的pH在～6.0至～9.0之間。
8.權利要求4、5、6或7中任一項所述的方法，其特征在于，CPIP比例是～3.0，保溫時間是～5小時，保溫溫度為～23℃，培養(yǎng)液pH為～7.5。
9.權利要求2所述的方法，其特征在于(a)以足以降低所述抗體不均一性的體積，在含有分泌抗體的培養(yǎng)液中加入腹水液;(b)在足以使所述抗體不均一性降低的溫度和pH下將所述培養(yǎng)液保溫足以使所述抗體不均一性降低的一段時間;然后從培養(yǎng)液中分離降低了不均一性的所述抗體。
10.權利要求9所述的方法，其特征在于，加到培養(yǎng)液中的腹水液與培養(yǎng)液的體積比為～2∶1至～1∶20。
11.權利要求10所述的方法，其特征在于，保溫時間在～1至～72小時之間。
12.權利要求23所述的方法，其特征在于，保溫溫度在～2℃至～42℃之間。
13.權利要求12所述的方法，其特征在于，培養(yǎng)液的pH在～4.0至～9.0之間。
14.權利要求10、11、12或13中任一項所述的方法，其特征在于，將1∶1體積的腹水液加到培養(yǎng)液中，保溫時間為～16小時，保溫溫度為～37℃，培養(yǎng)液pH為～7.5。
15.權利要求2所述的方法，其特征在于，(a)將含有分泌抗體的培養(yǎng)液的pH降低至足以降低所述抗體的不均一性的pH;(b)以足以降低所述抗體不均一性的時間和溫度保溫所述培養(yǎng)液;然后從該培養(yǎng)液中分離降低了不均一性的所述抗體。
16.權利要求15所述的方法，其特征在于，將培養(yǎng)液pH降至pH～3.0至pH～5.5之間。
17.權利要求16所述的方法，其特征在于，保溫時間在～1至～72小時之間。
18.權利要求17所述的方法，其特征在于，保溫溫度在～2℃至～37℃之間。
19.權利要求16、17或18中任一項所述的方法，其特征在于，將培養(yǎng)液的pH降至pH～4.0，保溫溫度為～40℃，保溫時間為～72小時。
20.權利要求1-19中任一項所述的方法，其特征在于，分泌抗體選自嵌合的、雙功能的和人的單克隆抗體。
全文摘要
公開了降低分泌單克隆抗體的不均一性的新方法。第一個方法包括在低pH下保溫不均一抗體一段時間，使其足以將不均一形式的抗體轉化為基本均一的形式。另一方法采用腹水液得到同樣結果，再一種方法采用羧肽酶得到同樣結果。由此可以高產(chǎn)率地純化出均一抗體。
文檔編號C12N5/16GK1041392SQ89107508
公開日1990年4月18日 申請日期1989年9月28日 優(yōu)先權日1988年9月28日
發(fā)明者理查德·馬克·巴塞洛繆, 托馬斯·查爾斯·弗曼, 羅德尼·阿倫·儒, 詹姆斯·帕特里克·麥克多諾 申請人:伊萊利利公司