專利名稱：具有第八因子活性的新蛋白質(zhì)，便用遺傳工程細胞制備該蛋白的方法以及含這些蛋白的 ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及到一些具有第8因子活性的新的蛋白質(zhì)以及使用遺傳工程細胞系感微生物來制備它們的方法。
第8因子是一種醫(yī)學(xué)上重要的蛋白質(zhì)，因為它是血液凝固機制中的一種方要成分。它在健康人血漿中的濃度大約為100ng/ml。第8因子缺乏導(dǎo)致稱為血友病A的一種出血性疾病，它主要見于男性，因為第8因子基因位于X-染色體上。本病是一種重要的遺傳性出血性疾病，男性人群發(fā)病率約0.01%。
血友病A可以通過輸入自健康人獲得的含第8因子的血漿來治療。然而該療法有幾種缺點。首先，第8因子的來源有限且價格昂貴，因為它在供者血中的濃度很低。其次，現(xiàn)行的血漿分級分離方法產(chǎn)率較低，第8因子的實際含量不足。第三，每一例血友病A患者接受了采自許多供血者的血液制品，從而獲得傳染病的危險性升高，這些傳染病包括例如由存在于供血中的非甲、非乙型肝炎病毒，乙型肝炎病毒，艾滋病(AIDS)病毒引起的各種疾病。另一問題是所謂抑制因子的出現(xiàn)，它是接受外源性，同種基因性第8因子制品治療的血友病患者所產(chǎn)生的抗第8因子抗體。
這些問題已促使人們?nèi)フJ真研究用重組DNA技術(shù)的方法來獲得第8因子，以代替自供者血液中的分離方法。幾組學(xué)者已報道了由人類mRNA所獲的第8因子cDNA分子克隆和在哺乳類，酵母菌，或細菌細胞中生產(chǎn)具有第8因子活性的蛋白質(zhì)(WO85/01961，EP0160457，EP150735，EP0253455)。
歐洲專利申請0253455介紹了一種使用轉(zhuǎn)化微生物生產(chǎn)具有第8因子活性蛋白質(zhì)的方法。該種蛋白適于制備具有第8因子活性的藥學(xué)制品并可激發(fā)能識別具有第8因子活性蛋白的抗體。
另一組研究者的目標是發(fā)現(xiàn)具有第8因子活性并能糾正血友病A患者凝血缺陷的其它種蛋白質(zhì)。歐洲專利申請EP150735，EP123945，和Brinkhous等(1985)指出，第8因子活性不僅取決于第8因子蛋白本身，而且還決定于它的某些蛋白水解產(chǎn)物。蛋白水解酶作為凝血鏈式反應(yīng)的一環(huán)見于血液之中，并部分降解第8因子為分子量92KDa和80KDa的兩個亞單位多肽。據(jù)認為，當(dāng)這兩個亞單位的復(fù)合體或其一部分在血中出現(xiàn)時，第8因子活性增強(Fay等，1986，Eaton等1986a)。
與其它血漿蛋白不同，當(dāng)以已知的重組DNA方法制備時，第8因子是一種不盡理想的低產(chǎn)蛋白質(zhì)。甚至該蛋白并不以完整肽鏈的形式出現(xiàn)，因此制品很難進一步分離和純化，費用也高。
Eaton等(1986b)發(fā)現(xiàn)，從第8因子蛋白的中心區(qū)去除第797-1562之間的766個氨基酸之后，余下的蛋白仍保有第8因子活性。而且，用含有編碼該縮短的蛋白質(zhì)的DNA的載體轉(zhuǎn)化的哺乳類細胞比帶有編碼全部長度蛋白的密碼的易感細胞表現(xiàn)出更高的產(chǎn)率。
PCT專利申請WO86/06101透露，既使將第8因子蛋白刪除到僅離中心區(qū)880個氨基酸仍顯示第8因子活性。最多的缺失延伸達Thr-760到Asn-1639(按表4計數(shù))。已提及的從Thr-760到Lys-1674的更大的缺失顯然對其并無影響。這些蛋白可以用含編碼這些蛋白質(zhì)的cDNA的一個載體轉(zhuǎn)化得到的哺乳類細胞系體外培養(yǎng)來制備。對所有天然的或制備的第8因子蛋白來講，缺失絕不能延伸到中心區(qū)邊界以外，因為該分子的余下部分是維持凝血活性的基礎(chǔ)。
第8因子是糾正象血友病A那樣的凝血缺陷的蛋白質(zhì)，其特性即第8因子活性。第8因子以與一種蛋白質(zhì)，VonWillebrand因子(VWf)，結(jié)合狀態(tài)循環(huán)于血液中，該蛋白防止第8因子過旱衰變。
第8因子由表4所述的氨基酸順序所定性。順序的編號開始于Ala-1，它為含19個氨基酸的信號序列后的第一個氨基酸，末端為Tyr-2332。該編號用于本專利說明書。
“具有第8因子活性的蛋白質(zhì)”“第8因子蛋白質(zhì)”或“類第8因子化合物”包括在天然第8因子之內(nèi)的各種大小的蛋白質(zhì)，它們均具有經(jīng)確定的氨基酸順序的核心部分或與第8因子的一部分氨基酸順序是同質(zhì)的，當(dāng)輸給血友病A患者時，它們具有第8因子活性以糾正凝血缺陷。該凝血缺陷的糾正可能受到已被破壞的凝血機能中直接干擾的影響或上述抑制因子患者體內(nèi)的抗第8因子蛋白抗體中和作用的影響從而隨后輸入的凝血第8因子蛋白能顯示其全部活性。
作為激活蛋白對全長第8因子蛋白作用的結(jié)果，形成了亞單位蛋白質(zhì)，它們的分子量分別為92KDa和80KDa。92KDa-亞單位自全長第8因子蛋白的氨基末端始而向下延伸，80KDa-亞單位自羧基末端始而向上延伸。
為本發(fā)明的需要，92KDa-多肽規(guī)定為全長第8因子的自Ala-1至Arg-740的氨基酸序列，80KDa-多肽定為自Gln-1649至TYR-2332氨基酸序列，這些順序是經(jīng)蛋白水解位點標明的。第8因子蛋白的其余部分為中心區(qū)，它與所謂的B-區(qū)間非常適應(yīng)，B-區(qū)間的邊界氨基酸是Ser-741和Arg-1648。
“具有第8因子活性蛋白質(zhì)”的概念包括92KDa和80KDa多肽及其一部分，它們可能本身不具有活性，但當(dāng)一起輸入或與另一種適當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)結(jié)合時，顯示出第8因子的活性，該后一種蛋白可能存在于血友病A患者體內(nèi)。
“具有第8因子活性的蛋白質(zhì)”的概念還包括含有既與80KDa又與92KDa-蛋白質(zhì)或它們的片段相對應(yīng)的氨基酸順序的蛋白質(zhì)。據(jù)認為它們來自于缺失了在上述92KDa和80KDa亞單位之間的中心區(qū)的第8因子蛋白或缺失了92KDa-和80KDa-亞單位界限以外部分。它們一般被稱為缺失突變蛋白。
該概念包括在人體外用如重組DNA技術(shù)生產(chǎn)的具有第8因子活性的蛋白質(zhì)。它包括在體內(nèi)顯示出天然的第8因子生物學(xué)特性以及具有其主要部分已確定或與第8因子的一部分氨基酸順序同質(zhì)的任何蛋白質(zhì)。
由遺傳工程得到的“具有第8因子活性的蛋白”可能與天然存在的產(chǎn)品一致，它還可以是象80KDa-或92-KDa片段那樣的一個片段或是有同樣活性但勿需具備同樣的氨基酸順序或分子量的一個片段。
“具有第8因子活性的藥物制品”意指輸入哺乳類體內(nèi)后能糾正與第8因子缺乏有關(guān)的凝血缺陷的任何制品。
為方便起見，名詞“蛋白質(zhì)”常包括蛋白質(zhì)和更小的多肽鏈。至于“來自另一順序的一個順序”指的是與另一順序一致或是天然形成、經(jīng)遺傳工程所得變種、或化學(xué)合成的一個順序，該順序維持或增強所需功能。
“信號順序”指的是蛋白質(zhì)氨基端的一部分，在細胞膜運輸時往往由成熟蛋白上被清除。
所用縮寫Ug＝微克，Kb千鹼基對，bp＝鹼基對，KDa＝千道爾頓已發(fā)現(xiàn)，能從全長第8因子蛋白制備它的缺失突變。雖然它具有目前普遍認為有損于其生物活性的超長缺失，但表現(xiàn)出第8因子活性。
這種新型蛋白質(zhì)顯示出未曾預(yù)料到的令人滿意的特性，能使它適于有規(guī)律地生產(chǎn)。它們在遺傳工程的宿主細胞中被生產(chǎn)，該細胞作為含有偏碼全長第8因子或已知缺失突變體的DNA的易感態(tài)細胞，大量分泌該蛋白。該突變體系已在PCT專利申請WO86/06101所述。
該新蛋白可以用N-L-C式表示。N代表從第8因子蛋白氨基端伸展的氨基酸順序，C代表由羧基端伸展的順序。中間連接體L代表一個連接肽鍵或一個1-20個氨基的連接順序。
按本發(fā)明的蛋白的特征在于N區(qū)本質(zhì)上是第8因子丙-1到脯-740氨基酸序列的復(fù)制品或在該序列羧基末端每次截掉一個氨基酸直到最短的丙-1-到天冬-712序列的一個較短序列復(fù)制品。C區(qū)本質(zhì)上是第8因子谷酰1638到酪-2332氨基酸序列的復(fù)制品或在該序列氨基末端每次截掉一個氨基酸直到最短的絲-1690到酪-2332C序列的一個較短序列的復(fù)制品。第8因子氨基酸順序見表4。
優(yōu)先的蛋白包括順序3，3b，7，8和9(如表1所示)。順序1涉及全部長度的第8因子，順序2系缺失695個氨基酸活化的第8因子蛋白。
本發(fā)明還包括兩種分離蛋白的混合物，其一以順序N為特征，另一以順序C為特征，順序N和C的含義如前文所述。
本發(fā)明還提供了由PSV2衍生的通用克隆載體，它能被重組到一種表達載體之中，該表達載體含有至少一種偏碼上述蛋白質(zhì)之一的結(jié)構(gòu)基因DNA。它還能在轉(zhuǎn)化的宿主細胞內(nèi)表達至少一種上述可分離形式的蛋白質(zhì)。當(dāng)使用與編碼信號順序的DNA結(jié)合的載體時，該蛋白可以被分泌于介質(zhì)之中。需被表達的DNA可被整合到宿主染色體上，也可使用一個隨體復(fù)制子而使其在染色體外保存和復(fù)制。
按照本發(fā)明的表達載體可以特別包括適于在哺乳類細胞中以5′-3′的轉(zhuǎn)錄方向被表達的下列DNA順序一個轉(zhuǎn)錄和翻譯起始調(diào)節(jié)區(qū)，具有信號順序的為第8因子多肽編碼的開啟讀碼結(jié)構(gòu)，和轉(zhuǎn)錄及翻譯終止調(diào)節(jié)區(qū)。
對COS細胞較理想是用可被哺乳類細胞轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)識別的SV40早期轉(zhuǎn)錄單位的轉(zhuǎn)錄啟動子(SVEP)。最好是，將啟動子SVep與Rous肉瘤病毒長末端重復(fù)啟動子(RSV-LTR)按一前一后串接方式結(jié)合，二者按正確方向表達。見圖1。
然而，在另一些特殊的細胞系中，更適于使用其它啟動子，如脊椎動物、哺乳類、病毒的啟動子，包括SV40后期啟動子，腺病毒啟動子，金屬巰基組氨酸三甲基內(nèi)鹽啟動子(metallothionenpromoter)，βactine病毒，或巨細胞病毒啟動子。
成帽位點定位于cDNA插入段之前，并確定了來自表達載體上的轉(zhuǎn)錄單位的mRNA的開端。
為了適宜的基因表達，已發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)譯起始密碼ATG周圍的核苷酸順序在動物細胞中是重要的。例如，KOZaK(1983)已深入研究了這些區(qū)域?qū)τ谠贑OS-細胞中胰島素的表達的影響。因此，修飾起始密碼ATG周圍的核苷酸順序可能是重要的。這一工作可經(jīng)點突變或?qū)⑼庠椿蛉诤嫌谝粋€高效表達基因的起始區(qū)來完成。
象許多可從細胞中正常地分泌到周圍培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)一樣，成熟的第8因子蛋白也以信號肽為先導(dǎo)。一般來說，普遍認為信號肽具有能使蛋白穿過細胞膜的特性。對于第8因子多肽鏈的分泌，寧可使用天然形成的第8因子先導(dǎo)順序，但其它可能是衍生于天然第8因子信號順序的信號順序也同樣適用。
信號順序之后接著含cDNA插入段的片段，該插入段編碼既可以是全長蛋白，也可以是按本發(fā)明提供的一種新的缺失突變蛋白的成熟第8因子蛋白質(zhì)。
能以幾種方式完成對結(jié)構(gòu)基因有目的的刪除，如對全長第8因子cDNA的切割、再修飾和連接，純化片段，或直接點突變，特別是如Kramer等(1984)(GeneralMethodssection，z)所介紹的圈出突變(loopout)。
終止區(qū)可來源于獲得起始區(qū)的同一基因的3′末端區(qū)，也可來自于另一不同的基因。迄今已知和已發(fā)現(xiàn)的許多終止區(qū)均令同一或不同屬和種的宿主細胞滿意地接受。終止區(qū)可以包括將哺乳類細胞mRNA適當(dāng)處理所得順序，即一個小的內(nèi)含子和多聚腺苷信號。
在組建表達暗盒時，通常將DNA的各種片段克隆于一個適合的克隆載體之中，該載體考慮到了DNA的擴展和修飾，或?qū)樞虻倪B接和移除等操作。正常情況下，該載體應(yīng)能夠在大腸桿菌中至少以相當(dāng)高的拷貝數(shù)來復(fù)制。許多載體很易于供克隆使用，包括PBR322，PML2，PUC7-PUC19，PSP64，PSP65，PSP18，PSP19，PTZ18，PTZ18R，PTZ19，PTZ19R，等載體。
克隆載體以在大腸桿菌中帶有一個至少在功能上是有效的復(fù)制原點為特征。該克隆載體將有至少一個特定的限制酶切點，而通常是很多特定的限制酶切點，并可包括多種限制點，特別是兩個同樣酶的限制點供置換。此外，克隆載體將有一個以上的標記以供選擇轉(zhuǎn)化體時用。這些標記一般表現(xiàn)為抗細胞毒試劑，如抗菌素，重金屬和毒素等，也可是對營養(yǎng)缺陷型宿主的補充，或?qū)κ删w具有免疫性，載體或暗盒通過適當(dāng)?shù)南拗泼缸饔?，適宜的末端修飾，反復(fù)處理，或填平突出部分等方法來得到平鈍末端。再經(jīng)過加入連接體，或加尾等方法。為連接和載體與表達暗盒或其它成分的結(jié)合提供互補末端。
某些情況下，需使用一個穿梭載體，它能在需要不同的復(fù)制系統(tǒng)的不同宿主體內(nèi)復(fù)制。本發(fā)明更愿意使用Simian病毒(SV40)復(fù)制原點，它使質(zhì)粒在COS-1-細胞內(nèi)增殖(Glu-zman，1981)。
牛多瘤病毒(BPV-1)用于表達載體在C127細胞中的隨體維持和增殖(見Howley等，1983)。
為微生物生產(chǎn)選用的建株細胞系或宿主微生物最好是宿主系統(tǒng)。來源于培養(yǎng)的原始組織的正常初級細胞或細胞系適于選用。宿主細胞最好是哺乳類細胞系，如猴COS-細胞，倉鼠CHO細胞或鼠C127-細胞，但某些微生物細胞，如酵母菌，最好是Kluyveromyces，或細菌，最好是枯草桿菌。
為使這些細胞系或帶有第8因子密碼順序的表達載體的宿主穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化，以及隨后能使插入宿主染色體中的載體擴增，CHO(中國倉鼠卵巢)細胞適于選用。轉(zhuǎn)化必須包括與一種選擇標記基因，如dhfr(雙氫葉酸還原酶)基因或G418(neo-)抗藥基因等，連在一起的表達載體對宿主細胞的轉(zhuǎn)染，以及它在染色體上的整合和對穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體的選擇。獲得穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化體之后，用標準方法選擇第8因子活性和第8因子抗原性。
使宿主細胞系穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的另一方法使用了含有BPV-1-順序的表達載體。C127細胞是達此目的理想選擇。轉(zhuǎn)化包括表達載體對宿主細胞的轉(zhuǎn)染。用中心點(foci)的形成來識別轉(zhuǎn)化體。用標準方法確定穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化體和選擇第8因子活性。反之，當(dāng)表達實現(xiàn)于PSV-2來源的表達載體向COS-1細胞的過渡轉(zhuǎn)化系統(tǒng)時，沒有選擇步驟。
按照本發(fā)明更進一步的內(nèi)容，提供了按本發(fā)明使用培養(yǎng)的轉(zhuǎn)化哺乳類細胞或微生物宿主生產(chǎn)蛋白質(zhì)的方法，該微生物宿主按照本發(fā)明存在于營養(yǎng)培養(yǎng)基中而產(chǎn)生含該蛋白的培養(yǎng)物，由此分離出蛋白質(zhì)。
本發(fā)明更進一步的優(yōu)點在于所表達的蛋白能從完整的細胞膜或宿主細胞壁分泌到培養(yǎng)基之中。
使用常規(guī)技術(shù)從培養(yǎng)基中分離和純化表達蛋白，如使用固相抗體的親和層析，氨基己基瓊脂糖層析，或混合電解質(zhì)法。
本發(fā)明的主要優(yōu)點是所需蛋白以未斷裂的糖基化單鏈分子形式分泌。經(jīng)凝膠電泳分離后，它們表現(xiàn)為預(yù)計大小的完整單鏈。沒發(fā)現(xiàn)象80KDA多肽的降解鏈，見表3和圖3。該現(xiàn)象在制備缺失后的或熟蛋白中是新出現(xiàn)的，并對第8因子蛋白的成功分離與純化至關(guān)重要。
本發(fā)明進一步證實，當(dāng)與缺失的蛋白比較，該蛋白質(zhì)溶液顯示出未曾估計到的很高的第8因子活性(見表2)。還發(fā)現(xiàn)較大的缺失導(dǎo)致較高的蛋白產(chǎn)量。隨之獲得具有較高第8因子活性的溶液。從對抗原決定簇試驗的評價(該試驗是用以測定第8因子蛋白量)中可以看出培養(yǎng)基中第8因子活性的增加與第8因子蛋白量的增加呈正比。結(jié)論是新的第8因子蛋白有與全部長度的第8因子同樣的單位蛋白重量活性(比活性)。
按照本發(fā)明，表達蛋白適于作為藥物學(xué)制品，當(dāng)將其輸給哺乳類，包括患有第8因子缺乏癥的病人和作為對含該因子抑制體病人的治療時，它可對抗血友病A的凝血缺陷。該蛋白在生產(chǎn)工藝中通常要與非腸道吸收的賦形劑和其它適宜的賦形劑相混合。
為了適于非腸道吸收，本發(fā)明的藥物學(xué)制品可以常規(guī)包括該蛋白的滅菌冷凍干燥制品，使用時加入與受者血液等滲的無菌溶劑而制成溶液。該制劑可以單位容量或大劑量分裝，如密封安瓿或小瓶，它們的用法與已知的人第8因子蛋白類似，為增效可加入適宜的佐劑。
按本發(fā)明得到的具有第8因子活性的蛋白質(zhì)，比帶有相應(yīng)較少抗原決定簇的全部長度天然第8因子蛋白更小，所以預(yù)期抗原性更弱，從而受者更少誘發(fā)抑制體。它們也更少被存在于血友病人體內(nèi)的抑制因子識別。
一般方法1.克隆技術(shù)常規(guī)克隆技術(shù)參見Maniatis等人的手冊(1982)限制酶按制造者的推薦使用，它們可分別從新英格蘭生物學(xué)試驗室(Biolabs)，貝塞斯達研究實驗室(BRL)，或貝林格，曼海姆(Boehringer)實驗室獲取。一般來說處理1μgDNA需要1-5單位的酶。
連接步驟，DNA片段混于瓊脂糖凝膠，電泳抽提，過NACS柱(BRL見制造者的介紹)純化，乙醇沉淀，于含50mM和Tris-HCl緩沖液PH7.4;10mM氯化鎂，10mM二硫蘇糖醇，1mMATP和T4DNA連接酶(Biolads)中溫育。
填充5′末端突出部限制性位點使用DNA聚合酶Ⅰ的大的Klenow片段(Biolabs)。在含10mMTris-HCl緩沖液PH7.7;50mMNaCL，10，mM二硫蘇糖醇和20mM未標記核苷酸中溫育30℃，15分鐘。
3′末端突出部限制性片段末端的降解如Maniatis等(1982)所述，用T4DNA聚合酶來完成。
大腸桿菌的轉(zhuǎn)化可以按經(jīng)典的氯化鈣法(Maniatis等，1982)或Hanahan(1983)法進行。轉(zhuǎn)化體的選擇和所需質(zhì)粒的確定按Maniatis等(1982)方法實行。
從限制性片段的連接體或自制寡核苷酸連接順序得到的全部組建體均經(jīng)序列分析檢查，以便證實讀碼結(jié)構(gòu)的完整性和在第8因子編碼順序或表達載體的必須的調(diào)節(jié)順序中已排斥在外的核苷酸取代結(jié)構(gòu)。序列分析可以用Maxam和Gilbert(1980)技術(shù)或Sanger等人(1977)的雙脫氧核苷酸法進行。
寡核苷酸的人工合成可在一種應(yīng)用生物系統(tǒng)308B型DNA人工合成器內(nèi)完成。該寡核苷酸經(jīng)乙醇沉淀法純化。
2.圈出突變由寡核苷酸指引的圈出突變按雙缺口技術(shù)(Kramer等，1984)進行。
M13mp8和M13mp9基因組在主要的M13基因上包括兩個amber突變，并僅能在大腸桿菌抑制菌株，如JM101(Yanisch-Perron等，1985)中繁殖。取自不含amber突變的M13mp18或M13mp19的重復(fù)形式DNA被分離和用EcoRⅠ和HindⅢ限制酶作用以去除多聚連接體區(qū)。用瓊脂糖凝膠電泳分離出近7.2Kb的限制性M13mp18片段。純化后的M13mp187.2Kb片段加入含靶片段的單股M13mp8(或M13mp9)DNA和適量的突變誘導(dǎo)劑(1.25nmol/ml)?；旌弦杭訜嶂?0℃，10分鐘，隨后在55℃下退火30分鐘。所獲雙缺口通過用Klenow-片段DNA聚全酶加三磷酸脫氧核苷酸的溫育而被填充，再用T4DNA連接酶連接。所獲閉環(huán)雙股DNA通常轉(zhuǎn)染非抑制性大腸桿菌菌株HB2154(mut1+)及其HB2151(Carter1985)。由于噬菌體基因中有琥珀突變使得含靶片段的M13mp18(+)DNA鏈不能增殖。反之，含突變片段的M13mp8(-)互補DNA鏈能夠?qū)κ删w繁殖起到模板作用，所致噬斑應(yīng)該全部或至少富含突變片段。取自認定為突變體的單股DNA被分離，再用適當(dāng)?shù)囊飳⑵漤樈佑谕蛔兿掠蔚?0-100個鹼基對區(qū)。
3.轉(zhuǎn)染，過渡表達，代謝標記和凝膠電泳以COS-1細胞和PSV2衍生表達載體為基礎(chǔ)的一個類第8因子組分過渡表達系統(tǒng)分泌于轉(zhuǎn)染細胞培養(yǎng)基之中。按Lopata等(1984)和Luthman與Magnusson(1983)所述，轉(zhuǎn)染原本使用載體DNA的DEAE-右旋糖2小時內(nèi)沉淀物，隨后2小時內(nèi)經(jīng)氯喹休克以加強轉(zhuǎn)化。用于COS-1-細胞生長和維持的培養(yǎng)基是添加了熱滅活10%(v/v)小牛血清的Iscove氏DMEM培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染后將培養(yǎng)基吸水保鮮48小時，再過48小時后進行收獲。
轉(zhuǎn)染細胞中的蛋白質(zhì)代謝標記過程使用無血清的RPM1培養(yǎng)基完成。轉(zhuǎn)染后兩天用50u Ci/ml的L-35S-蛋氨酸(Amersham，1985;370M Beq/330μl特異活性1000ci/mmol以上)溫育1小時，接著在收獲控制條件培養(yǎng)物之前再用1mML-蛋氨酸溫育過夜。為了抑制蛋白質(zhì)降解衰變，通常是在收獲后將蛋白酶抑制劑，如PMSF加入到控制條件培養(yǎng)基中。當(dāng)需抑制蛋白糖基化時，向控制條件培養(yǎng)基中加入終濃度0.001mg/ml的tunicamycin。
4.免疫沉淀分析為確定制造出的第8因子蛋白質(zhì)分子大小，使用由血漿來源第8因子誘發(fā)得到的單克隆和多克隆血清抗體，先結(jié)合于蛋白A-瓊脂糖(每10mg蛋白A-sepharose對10μl血清)。接著與從轉(zhuǎn)化的COS-1細胞分泌的類第8因子樣組分代謝標記物共同溫育。按Laommli(1972)法在5%聚丙烯酰胺凝膠電泳上用10%β-巰基乙醇還原后分離沉淀的類第8因子分子。
5.第8因子的生物學(xué)活性按制造者Kabi-vitrum所述進行產(chǎn)色素活性或Kabicoatest試驗，除了全部容量分為四份和每次檢查維持培養(yǎng)基25μl以外。第8因子類蛋白在15分鐘內(nèi)被活化，接著加入產(chǎn)色底物(S2222)。
標準凝集或血凝試驗(所謂activatedpartialthromboplastintime試驗)按Veltkamp等(1968)所述使用血友病人血漿進行。檢查前維持培養(yǎng)基被檸檬酸化抗凝處理。
按標準的貝塞斯達方法(Kasperc.k等，1975)測定抑制作用，所用免疫球蛋白經(jīng)離子交換和蛋白A-瓊脂糖層析純化獲得。
第8因子生物學(xué)活性試驗的標準品是檸檬酸化血漿庫(經(jīng)濃度0.5mM)假定它每毫升含1個單位的第8因子活性或抗原性。
6.抗原性的決定，以便確定第8因子的存在為了確認培養(yǎng)基中的第8因子抗原，使用了Riethorst，w等人建立的新的ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗)。
以適當(dāng)稀釋的特異性單克隆抗體αCagA(5mg/L)(溶于0.05M碳酸鹽緩沖液PH9.8)200μl/每孔包被ELISA塑料板孔。封好后在4℃溫育過夜。每兩次溫育之間，反應(yīng)板都應(yīng)用含0.05%吐溫20的磷酸鹽緩沖液沖洗三次，每次至少一分鐘。
試驗樣品(正常血漿)系列稀釋后加入反應(yīng)孔內(nèi)(200μl/每孔)。反應(yīng)板封好后37℃溫育2小時，勿震蕩。稀釋抗原所用緩沖液含50mMTris-HCl，2%牛血清白蛋白和1.0MNaCl，PH7.4。
αCag117-辣根過氧化物酶結(jié)合物用含50mMTris-HCl緩沖液，0.2%吐溫20，和1.0NaClPH7.4緩沖液稀釋10000倍(依據(jù)敏感度的需要)。每孔加入該稀釋液200μl;反應(yīng)板封好后在37℃暗處溫育2小時。
沖洗反應(yīng)板后，每孔加入150μl用0.1M醋酸/拘椽酸緩沖液PH5.5新配制的四甲基聯(lián)苯胺(TMB)液(0.1g/l)和過氧化氫(0.006%)，室溫下暗處溫育30分鐘。加入150μ12N硫酸終止酶反應(yīng)，用ELISA微量測定儀在光波450nm下測定吸光率。
7.抗第8因子單克隆和多克隆抗體的制備以其定性以純化的人類第8因子-VonWillebrand因子復(fù)合物免疫Balb/c品系小鼠來制備單克隆抗體。按VanMourik和Mochtar(1970)所述，純化過程經(jīng)對結(jié)晶沉淀物的瓊脂糖凝膠過濾法或用于治療目的的第8因子濃縮制品(由荷蘭紅十字輸血服務(wù)中心實驗室提供，阿姆斯特丹，荷蘭)來完成。按Galfre′等(1977)所述進行淋巴細胞雜交。用以分離產(chǎn)生抗第8因子單克隆抗體克隆的技術(shù)細節(jié)另有提供(Stel，1984)?？沟?因子單克隆抗體與第8因子多肽的反應(yīng)按英國專利申請GB8617594所述鑒定。
要得到抗第8因子多肽的多克隆抗體，根據(jù)標準步驟用層析法純化的第8因子制劑免疫家兔(見stel，1984)。再根據(jù)以前的專利申請GB8617594所述的免疫吸印法鑒定所得抗體，該方法用純化的第8因子-VonWillebrand因子或由SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離純化的多肽進行。然后將該抗體轉(zhuǎn)移到硝酸纖維紙上作為靶蛋白。分析結(jié)果表明產(chǎn)生了三個明顯不同的多克隆抗血清(RH63271，RH63272，RH63275)。這些抗血清與80KDa雙帶，92KDa多肽及更大的多肽反應(yīng)，它們也與較小的肽反應(yīng)。


圖1表示為全長第8因子蛋白編碼的表達載體(PCLB201)的結(jié)構(gòu)。
環(huán)形質(zhì)粒PCLB201顯示了在從質(zhì)粒PSV2(Gorman，1985;Mulligan和Berg，1981)衍生的4217對鹼基的HindⅢ-BglⅡ片段中EcoRⅠ位置有斷裂。圖還指明了旱期SV40啟動子區(qū)SVep。該載體也含有從質(zhì)粒PRSV-neo(Gorman，C，1985)衍生的NdeⅠ-HindⅢ片段，質(zhì)粒PRSV-neo帶有插入SalⅠ點的Rous肉瘤病毒長末端重復(fù)區(qū)(LTR)。全長第8因子是由7440對鹼基的SalⅠ-HpaⅠ片段編碼。
該片段用第8因子cDNA表示(H＝HindⅢ，Sal＝SalⅠ)。組建PCLB201時失去的限制性內(nèi)切酶切點在括號內(nèi)。質(zhì)粒大小用千對鹼基(Kb)表示。
圖2過濾表達第8因子蛋白缺失突變的載體a.PSV2衍生的載體的標志兩個位置隨機的啟動子SV40旱期轉(zhuǎn)錄啟動子(SVep)和Rous肉瘤病毒長末端重復(fù)區(qū)(RSV-LTR);帶帽位點(Capsite)和信息RNA的5′端;攜帶具有起始密碼(ATG)，開鏈讀碼和終止密碼(TGA)的全長第8因子編碼區(qū)的cDNA插入體;具有短內(nèi)含子和從SV40DNA衍生多腺苷信號(polyA)的信息RNA3′端非編碼區(qū)b.表示攜帶全長第8因子編碼cDNA的7440對堿基片段SalⅠ-HpaⅠ。也指出了讀碼的起始和終止密碼。還顯示了在全長cDNA內(nèi)限制內(nèi)切酶切點涉及組建PCLB202和PCLB203的突變。
c.第8因子蛋白的氨基酸順序圖。顯示了19氨基酸長信號肽和血漿第8因子的顯性或重復(fù)結(jié)構(gòu)，A1，A2和A3是同質(zhì)氨基酸序列。B是一個單一區(qū)，而C1和C2又是同質(zhì)序列(Vebar等，1984)。給出了靠近A和C重復(fù)區(qū)的氨基酸位置。圖下端的蛋白酶切點，這些切點剪接第8因子，已用箭頭標出了活化的蛋白質(zhì)c(APC)，凝血因子(Ⅱa)，活化的凝血因子X(Xa)和類胰蛋白酶(用？表示)。還說明Xa也一直切到Ⅱa-和APC切點(Eaton等人，1986a;Fay等人，1986)圖中都給出了它們的切點，B區(qū)含有多個切點。
d.活化第8因子的亞單位結(jié)構(gòu)92KDa和80KDa的第8因子亞單位分別用92K和80K表示。還給出了全長順序內(nèi)氨基端和羧基端氨基酸的位置。
e.表示cDNA和在B中提及PstⅠ和BamHⅠ點間含有直接融合的PCLB202蛋白的結(jié)構(gòu)。顯示所得蛋白在丙-867和天門-1563間含有一個肽鍵。該蛋白全長為1637個氨基酸。
f.表示cDNA和含為4個額外氨基酸編碼的MluⅠ連接子序列的PCLB203蛋白的結(jié)構(gòu)，這四個氨基酸橋接著b所示的MaeⅢ點和HgiAⅠ點。該蛋白全長為1411個氨基酸。
e，f，g給出了重復(fù)區(qū)邊界位置的界碑和特異蛋白酶切點，其解釋見上面。
圖3用免疫沉淀法及電泳法測定n種缺失突變的第8因子蛋白分子量(見一般方法3)。
出現(xiàn)的放射自顯影表明是載體PCLB202(2道)和PCLB203(1道)產(chǎn)生蛋白的泳道，還指出了分子量的參照標志物(見表3)。
例1組建PCLB201以前的申請GB8617594和GB8630699中已敘述內(nèi)容，如從人肝臟中提取第8因子的mRNA，制備，純化和鑒定其cDNA，以及質(zhì)粒PEP121中組建質(zhì)粒PCLB99均包括在本申請中。
為在細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中表達，已組建和修飾了從Mulligan和Berg(1981)的PSV2載體衍生的一個載體。質(zhì)粒PSV2.tPA(VanZonneveld等，1986)的單一HindⅢ點修飾成SalⅠ位點。為此，將HindⅢ粘性未端變成平鈍端，SalⅠ-連接子(5′-CGTCGACG-3′);連接到這些末端，篩選含SalⅠ位點的質(zhì)粒PCLB91。這個質(zhì)粒與PSVtpA的不同僅在于它含插入HindⅢ點中的一個SalⅠ連接子。
純化來自PCLB89含有第8因子cDNA(見表4)的長7440堿基對的SalⅠ-HpaⅠ片段(見Maniatis等人，1982)，用SalⅠ和BglⅡ酶解，將其插入PSV2衍生的載體PCLB91中。篩選出的表達載體PCLB200含有完整的SalⅠ切點，其HpaⅠ點連接到BglⅡ點，恰好吻合。
將一個額外的Rous肉瘤病毒長末端重復(fù)區(qū)序列作為一個附加轉(zhuǎn)錄啟動子接到質(zhì)粒PCLB200上。用NdeⅠ和HindⅢ酶解質(zhì)粒PRSVneo(Gorman，1985)，再與DNA聚合酶的Klenow片段一起溫育，制造平鈍端，提取0.6千對堿基片段，插入到同樣被變成平鈍端的PCLB200的SalⅠ位點中。所得表達載體PCLB201，在轉(zhuǎn)錄起始點右邊含RSV-LTR，再提取全長第8因子的cDNA(見圖1)。
例2組建PCLB202如專利申請GB86175-94和GB8630699中所述，在質(zhì)粒PGB860中組建一個突變體，該突變體在第8因子序列的第2660個核苷酸(見表4)到4749個核苷酸一段缺失。PGB860中第8因子的編碼DNA在中心區(qū)含有一段為695個氨基酸編碼的缺失。表達載體PCLB202是從PGB860和PCLB201衍生的。兩種質(zhì)粒均用KpnⅠ和XbaⅠ限制酶酶解。在PGB860中第8因子中心區(qū)含有缺失的3.1千對堿基KpnⅠ-XbaⅠ片段被連接到來自PelB201的7千對堿基的KpnⅠ-XbaⅠ片段上。所得質(zhì)粒PCLB202具有完整的KpnⅠ和XbaⅠ切點。圖2e圖解了它的結(jié)構(gòu)。
例3組建PCLB203將來自PCLB897440對堿基的SalⅠ-HpaⅠ片段(圖1)插入用SalⅠ和SmaⅠ酶切的質(zhì)粒PsP64中(見Melton等人，1984)。所得質(zhì)粒含一個完整SalⅠ點，并將HpaⅠ端連接到SmaⅠ端。
PCLB101的組建包括下列步驟(括號中數(shù)字參照表Ⅳ)步驟1.用KpnⅠ和TthlllⅠ酶解質(zhì)粒PCLB100，得到一個631對堿基的片段從KpnⅠ(1817)到TthlllⅠ(2447)。用MaeⅢ(切點在2199)切純化的631對堿基長的片段，填平所得MaeⅢ粘性端，得到383對堿基片段。
步驟2.用ApaⅠ和BanⅠ酶解質(zhì)粒PCLB100，提取669對堿基的ApaⅠ(6200)-BanⅠ(5532)片段。
步驟3.用HgiAⅠ酶解質(zhì)粒PCLB100，產(chǎn)生634對堿基的HgiAⅠ片段，將其與T4DNA聚合酶溫育，使其變成平鈍端。再用BamⅠ酶解該片段，得到565對堿基的片段。
步驟4.用ApaⅠ和KpnⅠ酶解質(zhì)粒PCLB100，制造一個含5.9千對堿基長的片段ApaⅠ(6200)-KpnⅠ(1817)的載體序列，保存并在大腸桿菌中增殖。
步驟5.純化步驟1-4所得片段，將等量的各片段與10倍摩爾數(shù)的過量MlnⅠ連接子(CCACGCGTGG)連接，得到質(zhì)粒PCLB101。
鑒定在MaeⅢ和HgiAⅠ點間(見圖26)含MluⅠ-連接子的質(zhì)粒PCLB101。證實了KpnⅠ，BamⅠ和ApaⅠ點均是完整的。圖2f圖解天冬-712和谷氨酰-1638間(見表4)的四個額外氨基酸(脯-精-纈-丙)。
質(zhì)粒PCLB203是直接從PCLB101和PCLB201衍生的。兩種質(zhì)粒均用KpnⅠ和XbaⅠ酶解。將來自含有缺失的PCLB101的2.4千對堿基片段KpnⅠ-XbaⅠ連接到PCLB200衍生的7.0千對鹼基長KpnⅠ-XbaⅠ片段。篩選的質(zhì)粒PCLB203具有完整的KpnⅠ和XbaⅠ切點，它們的結(jié)構(gòu)圖解在圖2f中。
例3a組建PCLB212用Kranser等人所述圈出突變技術(shù)(loop-outmutagenesis)(見一般方法2)組建PCLB212。用下列寡核苷酸使第8因子cDNA中心區(qū)缺失突變3′TTCCAAAGATCAACACTGGTT引物DTTGGGTGGTCAGAAC5′在第8因子cDNA內(nèi)發(fā)生為第713(賴)到1674(絲)氨基酸編碼的序列(引物D)的缺失。
其相應(yīng)的蛋白質(zhì)與全長第8因子蛋白比較含有925個氨基酸的內(nèi)缺失部分。
為得到圈出突變的靶片段。選用來源于PCLB203(見例3)的1.4千對堿基的HindⅢ-PstⅠ片段。HindⅢ點的核苷酸位置(見表4)在全長第8因子序列的1025核苷酸處，恰好在欲飾區(qū)的上游;PstⅠ點在5165核苷酸處，恰好在該區(qū)下游。圖1指出了這些點。將1.4千對堿基片段亞克隆到M13mp9中，然后進行圈出突變。篩選具有準確缺失的片段后再將含所需缺失的HindⅢ-PstⅠ片段的KpnⅠ-PstⅠ部分插入到合適的表達載體中，插入是通過制備具粘性單一限制酶末端(數(shù)字參照表4)的片段完成的，步驟如下步驟1為表達突變第8因子分子，組建一個新質(zhì)粒PCLB211。因此，從PCLB89衍生有7440對堿基(見圖1)的SalⅠ-HpaⅠ片段插入表達載體PSVL(pharmacia，N，27-4507-01，Uppsala，Sweden)，使其能在哺乳動物細胞中從晚期SV40啟動子轉(zhuǎn)錄。用XhoⅠ和SmaⅠ酶解質(zhì)粒PSVL，所得質(zhì)粒PCLB211含連接到SalⅠ端的XhoⅠ端，因為這些酶的5′端突起端是相同的，SmaⅠ端連接到HpaⅠ端。
步驟2用ApaⅠ和SalⅠ酶解質(zhì)粒PCLB211，提取長1.4千對堿基的ApaⅠ(6200)-SalⅠ(該點在PCLB211的PSVL部分中是唯一的)片段。
步驟3用NdeⅠ，PstⅠ和ApaⅠ酶解質(zhì)粒PCLB100，提取363對堿基的PstⅠ(5165)-NdeⅠ(5527)片段和674對堿基的NdeⅠ(5527)-ApaⅠ(6200)片段。
步驟4用KpnⅠ和SacⅠ酶解質(zhì)粒PCLB100，產(chǎn)生一個1799對堿基的KpnⅠ(1817)-SacⅠ(19)片段，提取之。
步驟5用SalⅠ和SacⅠ酶解質(zhì)粒PCLB211。得到一個4.5千對堿基的SalⅠ(在PSVL載體中的唯一切點)-SalⅠ(19)片段。
步驟6用KpnⅠ和PstⅠ酶解具有含序列分析證實有所需缺失的Hind(1025)-PstⅠ(5165)片段的M13噬菌體。得到并純化584對鹼基的PstⅠ(5165)-KpnⅠ(1819)片段。
步驟7將步驟2到6分離所得6種片段等量混合及連接。篩選含所有片段的質(zhì)粒。質(zhì)粒PCLB212表達典型化合物3b(見表2)，化合物3b不同于化合物3(見圖3f)，由于它失去MluⅠ連接子和因而失去相應(yīng)的四種氨基酸。
例4組建PCLB208，PCLB209，和PCLB210用Kramer等人(1984)所述(一般方法2)圈出突變技術(shù)組建PCLB208，PCLB209，和PCLB210。用下列寡核苷酸進行第8因子cDNA中央?yún)^(qū)的缺失突變3′TTACGGTAACTT-GGTTCTCTT引物a
TATTGAGCATGATGA5′3′TTACGGTAACTTGGTTCTAGT引物bCAACTTTACTTCTTC5′3′TTACGGTAACTTGGTTCTTCG引物cAAAGTTTTCTTTTGT5′由于在第8因子cDNA產(chǎn)生了為絲-747到精1648(引物a)，絲-741到異亮-1668(引物b)，及絲-741到精1689(引物c)編碼序列的內(nèi)部缺失，相應(yīng)的蛋白質(zhì)分別含有908，928，和949個氨基酸殘基的內(nèi)部缺失。
為得到一個圈出突變的靶片段，由PCLB101衍生的0.8千對堿基的片段組建如下用EcoRⅠ酶解質(zhì)粒PCLB101，將EcoRⅠ切點填平，再用KpnⅠ進一步酶解。分離479個堿基對的由KpnⅠ(在表4的核苷酸號為1819)開始到EcoRⅠ(2279)平端片段。用BamHⅠ酶解質(zhì)粒PCLB101，填平粘性末端，用PstⅠ進一步酶解。第二個長416個堿基對的從BamHⅠ(4746)(末端已填平)到PstⅠ(5165)的片段被分離出來。將這些片段等摩爾連接，亞克隆到M13mp19amber中。含有從欲修飾區(qū)上游的1819核苷酸到該區(qū)下游5165核苷酸的895對堿基的KpnⅠ-PstⅠ片段并具有第8因子區(qū)編碼序列大缺失區(qū)的M13噬菌體被選用于圈出突變。選擇在M13噬菌體中的引物a，b和c得到準確缺失的片段后，將含所需缺失的KpnⅠ-PstⅠ片段插入來源于PCLB211的合適表達載體，見例36，其步驟如下，制備具有單一限制酶粘性末端的片段(核苷酸號參見表4)步驟1用ApaⅠ和SalⅠ酶解質(zhì)粒PCLB211。分離1.4千對堿基的ApaⅠ(6200)-SalⅠ(PCLB211質(zhì)粒中PSVL部分的唯一切點)片段。
步驟2用NdeⅠ，PstⅠ和ApaⅠ酶解質(zhì)粒PCLB100，分離363對堿基的PstⅠ(5165)-NdeⅠ(5527)片段和另一個674對堿基的NdeⅠ(5527)-ApaⅠ(6200)片段。
步驟3用KpnⅠ和SacⅠ酶解質(zhì)粒PCLB100，分離產(chǎn)生的1799對堿基的KpnⅠ(1817)-SacⅠ(19)片段。
步驟4用SalⅠ和SacⅠ和酶解質(zhì)粒PCLB211。得到4.5千對堿基的SalⅠ(PSVL載體的唯一切點)-SacⅠ(19)片段。
步驟5用KpnⅠ和PstⅠ酶解含有所需突變片段的M13噬菌體。分離含有三種所需突變的KpnⅠ-PstⅠ片段。
步驟6分離步驟1-5所得6種片段，等摩爾數(shù)混合并連接。篩選含所需片段的質(zhì)粒。用上面所示的引物a，b，或c組建表達表Ⅰ所示舉例化合物的新表達載體1.用引物a組建的表達化合物7的PCLB208。
2.用引物b組建的表達化合物8的PCLB209。
3.用引物c組建的表達化合物9的PCLB210。
用不同啟動子和細胞株可提高表達的水平。
例5組建生產(chǎn)具有第8因子活性蛋白的穩(wěn)定細胞株，a.在CHO細胞中表達用磷酸鈣沉淀技術(shù)(GramanVanderEb，1973)將質(zhì)粒PCLB203(10μg)和PAdD26sv(A)-3(1μg，kaufman和sharp，1982)引入DHFR缺陷型CHO細胞中(chasin和Urlaub，1980)。如Kaufman和Sharp(1982a)所述，用逐滴加入增加氨甲喋呤(MTX)濃度的方法使第8因子和DHFR編碼序列擴增。將抗200nM氨甲喋呤的轉(zhuǎn)化體取出，建立穩(wěn)定的在宿主基因組含為第8因子編碼DNA的細胞株。這些細胞株可使每毫升培養(yǎng)基產(chǎn)生約95毫單位的第8因子活性。通過增加氨甲喋呤濃度進一步擴增第8因子編碼序列，從而使分泌到培養(yǎng)基中第8因子的量進一步增加。
建立生產(chǎn)具有第8因子活性蛋白質(zhì)的細胞株是合適的。
為大量生產(chǎn)這種凝血因子，也可用其它啟動子(如巨細胞病毒啟動子或腺病毒啟動子)和/或細胞株(如人293細胞，骨髓瘤細胞或諸如肝細胞的特異分化細胞)。
b.在C127細胞株中表達如上所述，表達載體可被引入真核細胞中，它們整合到宿主細胞的基因組中。隨后再擴增表達暗盒(表達序列)。對表達載體整合的補充是作為隨體穩(wěn)定地保存在細胞內(nèi)，例如用隨體BPV系統(tǒng)(Howley等人，1983)表達一種突變第8因子蛋白。BPV-1基因組(BamHⅠ切的)首先被引入PTZ18R(來自Pharmacia公司)用BamHⅠ切的衍生物，PTZ18R在BamHⅠ切點的兩處含有XhoⅠ點。隨后用XhoⅠ酶切所得PTZX-BPV質(zhì)粒，得到2.9千對堿基的PTZ片段和具有Xho-Ⅰ突端的8千對堿基的BPV片段。后一個片段連接到質(zhì)粒PCLB212，該質(zhì)粒在它唯一的SalⅠ切點處被切(即在原始PSVL載體的2040位置)。所得表達載體PGB881含有SV40晚期啟動子，為缺失925個氨基酸的第8因子編碼的cDNA(主要為B-部分)和SV40晚期聚腺苷信號。由于有BPV-基因組存在，這個載體在合適宿主細胞，如小鼠C127細胞中可以隨體形式保存下來。用磷酸鈣沉淀技術(shù)(Graham和VanderEb，Supra)將質(zhì)粒PGB881(10μg)轉(zhuǎn)染到C127細胞中。轉(zhuǎn)染后14天分離Foci，隨后建立穩(wěn)定的細胞株。一些細胞株可在每毫升培養(yǎng)基中產(chǎn)生40個毫單位的第8因子活性。
一般在本發(fā)明范圍內(nèi)可改變表達載體，特別是啟動子和/或啟動子/加強子組合(Hurwitz1987)以及宿主，目的是提高本發(fā)明第8因子活性蛋白的水平。
例6表達重組第8因子DNA和測試產(chǎn)生的蛋白將根據(jù)上述例子得到的表達載體用DEAE轉(zhuǎn)染技術(shù)(見一般方法3)引入Cos-1細胞。轉(zhuǎn)染后4天收集控制條件的培養(yǎng)物。測試產(chǎn)生的蛋白。
根據(jù)一般方法部分(第5章)用(1)標準凝血或成血塊試驗和(2)成色活性試驗(Kabicoatest)測定控制條件培養(yǎng)物中第8因子的活性。加入已知是從血漿衍生具有第8因子活照泳道出現(xiàn)一個較小的帶。
同樣從表3看出，似乎第8因子是糖蛋白，與天然第8因子相似。因為在有或無已知是天冬氨酸連接的糖化抑不同蛋白的結(jié)果均收集在表2A和ⅡB，表明缺失突變蛋白質(zhì)甚至影響92KDa區(qū)，顯示第8因子的凝血活性。
用ELISA試驗(見一般方法6)確定第8因子蛋白量。從表2A和ⅡB可看出培養(yǎng)液中第8因子活性是隨著其中第8因子蛋白的含量增加而增加的。
用一般方法部分第3章所述的凝膠電泳確定產(chǎn)生的第8因子蛋白的大小。從圖3及表3資料可推導(dǎo)出新的第8因子蛋白分子大小與糖蛋白分子相仿。對照泳道出現(xiàn)一個較小的帶。
同樣從表3看出，似乎第8因子是糖蛋白，與天然第8因子相似。因為在有或無已知是天冬氨酸連接的糖化抑制劑時，形成的蛋白大小有明顯的區(qū)別。



表4第八因子CDNA插入到pCLB89中。第八因子從丙-1到酪-2332的氨基酸順序和它的信號序列蛋(-19)到絲(-1)。下面對應(yīng)有其編碼的核苷酸序列。苯丙-973是由TTC編碼。










權(quán)利要求
1.其氨基酸序列如下式，具有第8因子活性的蛋白質(zhì)N--L--C其中N代表的區(qū)包括蛋白氨基末端伸展的氨基酸序列，C代表的區(qū)包括蛋白羧基末端伸展的氨基酸序列，而L代表一個連接的肽鍵或1到20個氨基酸的序列，其特征在于N區(qū)本質(zhì)上是第8因子丙-1到脯-740氨基酸序列的復(fù)制品或在該序列羧基末端每次截掉一個氨基酸直至最短的丙-1到天冬-712序列的一個較短序列復(fù)制品，C區(qū)本質(zhì)上是第8因子谷酰-1638到酪-2332氨基酸序列的復(fù)制品或在該序列氨基末端每次截掉一個氨基酸直至最短的絲-1690到酪-2332 C序列的一個較短序列的復(fù)制品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述蛋白，其中N和C分別代表表Ⅳ所示順序的本質(zhì)上為丙-1到天冬-712序列和谷酰-1638到酪-2332序列復(fù)制品的氨基酸序列，而L是脯-精-纈-丙序列或一個肽鍵。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述蛋白，其中N和C分別代表Ⅳ所示順序的本質(zhì)上為丙-1到天冬-740和絲-1649到酪-2332或丙-1到精-740和絲-1669到酪2330或丙-1到精740和絲1690到酪-2332序列復(fù)制品的氨基酸序列，而L是一個肽鍵。
4.為權(quán)利要求1到3中任一種蛋白質(zhì)編碼的DNA分子。
5.表達載體，它含有調(diào)節(jié)序列和為根據(jù)權(quán)利要求1到3中任一種具有第8因子活性的蛋白編碼的插入DNA，能轉(zhuǎn)化哺乳動物細胞和微生物宿主使其表達至少一種可分離形式的具第8因子活性的蛋白質(zhì)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的載體，其特征在于其調(diào)節(jié)序列含有SV40旱期啟動子和RSV-LTR啟動子，前者隨機位于后者的上游。
7.本質(zhì)上是PCLB202，PCLB203，PCLB208，PCLB209，PCLB210，PCLB212中任一個的表達載體的復(fù)制品。
8.用權(quán)利要求5-7中任一種表達載體轉(zhuǎn)化的哺乳動物細胞。
9.用權(quán)利要求5的表達載體轉(zhuǎn)化的微生物宿主。
10.由權(quán)利要求5-7中任一種表達載體轉(zhuǎn)化的COS細胞，CHO細胞或小鼠C127細胞衍生的哺乳動物細胞培養(yǎng)物。
11.制備具有第8因子活性蛋白的方法，包括將權(quán)利要求8-10中任一種哺乳動物細胞或微生物宿主細胞培養(yǎng)在營養(yǎng)物培養(yǎng)基中，產(chǎn)生含有該蛋白的培養(yǎng)物，然后從中分離出該蛋白。
12.用于治療第8因子缺陷病的藥物組合物，包括權(quán)利要求1-3中任一項的蛋白及藥物學(xué)可接受的載體或稀釋劑，如果需要的話，可加一種或多種佐劑。
13.藥物組合物，包括一種無菌冷凍干燥的權(quán)利要求1-3中任一項的蛋白質(zhì)，它可重新制成治療第8因子缺陷病的與血液等滲的無菌溶液。
14.無菌的具有權(quán)利要求13組合物的容器。
全文摘要
本發(fā)明提供通過908-949氨基酸缺失制備突變第8因子cDNA的方法。cDNA在轉(zhuǎn)化的COS細胞中表達，得到在賴-338到谷酰-1638間氨基酸有相應(yīng)缺失的第8因子蛋白。所得蛋白似乎能糾正血友病A病人的凝血缺陷，該蛋白具有完整的鏈，表現(xiàn)出相對高的表達水平。
文檔編號C12N15/12GK1030609SQ8810348
公開日1989年1月25日 申請日期1988年6月11日 優(yōu)先權(quán)日1987年6月12日
發(fā)明者瓦·奧耶·阿爾伯特·約翰森·約瑟夫, 帕尼科克·漢森, 弗比特·馬蒂尼·菲利浦斯, 瓦利·羅伯特·威廉姆 申請人:吉斯特-布羅卡迪斯公司