本發(fā)明涉及環(huán)保型酸化劑技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，涉及一種抑菌組合物及其在制備酸化劑中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
1964年，moore(1946)等將抗生素添加到肉雞飼料中，發(fā)現(xiàn)顯著提高肉雞的平均日增重。1951年，美國食品與藥物管理局(foodanddrugadministration，fda)首次批準(zhǔn)在飼料中添加非處方型抗生素，稱之為“抗生素促生長劑(antibioticsgrowthpromoter，agp)”(杜銀峰，2013)。目前，有20多種抗生素及十幾種合成抗菌藥物被應(yīng)用到飼料添加劑中。它們在控制動(dòng)物細(xì)菌性疾病的發(fā)生，促進(jìn)畜禽生長、發(fā)育，提高飼料轉(zhuǎn)化率方面對畜牧業(yè)的發(fā)展做出了巨大的貢獻(xiàn)。但從一開始對應(yīng)用抗生素合理性就爭論不休，爭論的焦點(diǎn)主要是其在食品(肉蛋奶)中的殘留，對人體健康的危害，以及對環(huán)境的污染。而且有大量的證據(jù)表明，在飼料中添加亞治療劑量的抗生素促生長劑，一定會(huì)在食品、糞污中殘留；并且會(huì)加速耐藥菌株的出現(xiàn)。正因?yàn)槿绱?，對于抗生素作為飼料添加劑，許多國家和地區(qū)作出了明確的限定，而一些國家和地區(qū)甚至全面禁用。美國于2000年，宣布禁用兩種喳諾酮類抗茵藥物在飼料中添加。歐盟也于2006年1月1日起全面停止使用抗生素飼料添加劑。我國農(nóng)業(yè)部于2016年7月26日的第2428號(hào)公告：決定停止硫酸粘菌素用于動(dòng)物促生長(佚名，2016)。在飼料中限制甚至禁用抗生素是消費(fèi)者的要求，是全球大趨勢，為適應(yīng)這一需求，積極開發(fā)可替代抗生素的綠色飼料添加劑具有積極的意義。
目前可作為抗生素促生長劑(agp)的替代品包括益生菌、益生元、酶制劑、酸化劑、中草藥以及植物精油等。
其中，針對飼料酸化劑已有大量的研究，但是，由于單一有機(jī)酸或植物精油的抗菌性能差，如果要達(dá)到抗生素一樣的抑菌效果，必需大劑量使用，從而導(dǎo)致使用成本高，對飼料的誘食性有負(fù)面影響。因此，如何降低在單一有機(jī)酸或植物精油中出現(xiàn)的上述問題，以便有效利用現(xiàn)有資源、降低成本，還能擴(kuò)大其抗菌譜，改善抑菌性能，降低使用劑量，不但不影響采食，甚至可能提高采食量，是目前急需解決的問題。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明針對上述缺陷，提供了一種抑菌組合物，該抑菌組合物由中鏈脂肪酸與植物精油復(fù)合形成，具有抑菌高效、安全的效果，可應(yīng)用于制備替代抗生素的飼料添加劑。
本發(fā)明通過以下方案獲得上述技術(shù)目的：
本發(fā)明提供了一種抑菌組合物，由植物精油和中鏈脂肪酸復(fù)合形成，所述植物精油為香芹酚、肉桂醛和丁香酚，所述中鏈脂肪酸為辛酸、癸酸和己酸。
優(yōu)選地，按質(zhì)量百分比計(jì)，所述抑菌組合物由如下組分組成：
辛酸10％～20％、香芹酚5％～20％、癸酸5％～25％、肉桂醛25％～40％、丁香酚5％～20％、己酸10％～20％。
更優(yōu)選地，辛酸、香芹酚、癸酸、肉桂醛、丁香酚、己酸的質(zhì)量比為2:3:4:5:1:2。
更優(yōu)選地，辛酸、香芹酚、癸酸、肉桂醛、丁香酚、己酸的質(zhì)量比為2:1:1:5:2:2。
優(yōu)選地，將所述抑菌組合物按照質(zhì)量百分比為0.5～2％的比例制備成溶液。
本發(fā)明還保護(hù)所述的抑菌組合物在制備飼料添加劑中的應(yīng)用。
進(jìn)一步地，是在保護(hù)所述的抑菌組合物在制備酸化劑中的應(yīng)用。
優(yōu)選地，抑菌組合物抑制金黃色葡萄球菌、沙門氏菌或大腸桿菌中的一種或多種。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)及有益效果：
本發(fā)明提供的抑菌組合物克服了單一使用有機(jī)酸或植物精油中存在的問題，抑菌效果好，使用劑量小，能夠有效利用現(xiàn)有資源、降低成本，還能擴(kuò)大其抗菌譜，可應(yīng)用于制備飼料添加劑，例如酸化劑等，是一種安全的可替代抗生素的產(chǎn)品，在飼料領(lǐng)域中具備極大的應(yīng)用前景。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施方式對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
實(shí)施例1
將辛酸、香芹酚、癸酸、肉桂醛、丁香酚、己酸按照質(zhì)量比為2:1:1:5:2:2混合成抑菌組合物，然后溶于0.5％(v/v)無水乙醇，再加入含0.5％(w/v)吐溫-80的無菌液體，將抑菌組合物配置成0.5％(w/w)的濃度，邊倒邊攪拌，震蕩均勻。以含0.5％(v/v)乙醇和0.5％(w/v)吐溫-80的無菌液體為對照(上述對照經(jīng)過預(yù)實(shí)驗(yàn)證明無抑菌性)。吸取100μl107cfu/ml菌懸液于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)皿中，涂布均勻，放置4-6小時(shí)，使得菌體穩(wěn)定附著于固體培養(yǎng)基表面。將培養(yǎng)皿平均分成4區(qū)，在每區(qū)的中央位置用直徑為8mm的無菌槍頭打孔，利用酒精燈火焰對小孔進(jìn)行密封處理，然后在每個(gè)孔中分別加入100μl的對應(yīng)濃度的抑菌組合物溶液。做好標(biāo)識(shí)，將培養(yǎng)皿水平放置在37℃恒溫培養(yǎng)箱中，靜置培養(yǎng)24h后取出，用游標(biāo)卡尺測定抑菌圈的大小。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算平均值。
實(shí)施例2
將辛酸、香芹酚、癸酸、肉桂醛、丁香酚、己酸的質(zhì)量比為2:3:4:5:1:2混合成抑菌組合物，然后溶于0.5％(v/v)無水乙醇，再加入含0.5％(w/v)吐溫-80的無菌液體，將抑菌組合物配置成0.5％(w/w)的濃度，邊倒邊攪拌，震蕩均勻。以含0.5％(v/v)乙醇和0.5％(w/v)吐溫-80的無菌液體為對照(上述對照經(jīng)過預(yù)實(shí)驗(yàn)證明無抑菌性)。吸取100μl107cfu/ml菌懸液于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)皿中，涂布均勻，放置4-6小時(shí)，使得菌體穩(wěn)定附著于固體培養(yǎng)基表面。將培養(yǎng)皿平均分成4區(qū)，在每區(qū)的中央位置用直徑為8mm的無菌槍頭打孔，利用酒精燈火焰對小孔進(jìn)行密封處理，然后在每個(gè)孔中分別加入100μl的對應(yīng)濃度的抑菌組合物溶液。做好標(biāo)識(shí)，將培養(yǎng)皿水平放置在37℃恒溫培養(yǎng)箱中，靜置培養(yǎng)24h后取出，用游標(biāo)卡尺測定抑菌圈的大小。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算平均值。其中，表1為實(shí)施例1和2對指示菌抑菌圈測定結(jié)果，表1中采用了單獨(dú)的植物精油或中鏈脂肪酸進(jìn)行對比試驗(yàn)。
表1中鏈脂肪酸、植物精油及實(shí)施例1、2對指示菌抑菌圈測定結(jié)果
由表1可知，中鏈脂肪酸中的己酸、辛酸和癸酸以及植物精油中的肉桂醛、丁香酚和香芹酚對大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球均具有一定的抑制作用。實(shí)施例1和2的抑菌組合物，對革蘭氏陰性菌(g-)中的大腸桿菌和沙門氏菌的抑菌效力相對各單體組分提升，對革蘭氏陽性菌中的金黃色葡萄球菌抑菌效力相對各單體組分顯著提升。
實(shí)施例3中鏈脂肪酸、植物精油以及實(shí)施例1和2對三種指示菌的mic
參考nccls略有改動(dòng)，采用瓊脂平板稀釋法：分別取表2中單一的中鏈脂肪酸、植物精油、抑菌組合物和黃霉素，將不同濃度的上述物質(zhì)10ml(同樣溶解于0.5％(v/v)無水乙醇，再加入含0.5％(w/v)吐溫-80的無菌液體)，再加入融化并冷至50℃左右的定量(10ml)牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基中，震蕩均勻，迅速傾倒平板，制成含不同遞減濃度的樣品平板。用無菌接種器，接種指示菌，最終每點(diǎn)菌數(shù)約為104cfu，形成直徑為5～8mm的菌斑。接種好后，在超凈工作臺(tái)靜止放置1-2h，然后將平板置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24h，觀察。觀察結(jié)果的時(shí)候，將平板置于暗色、無反光物體表面上判斷，以抑制細(xì)菌生長的瓊脂平板所含最低樣品濃度為mic。以不含樣品的固體瓊脂平板為陰性對照，以含不同濃度的抗生素的固體瓊脂平板為陽性對照，其它操作都相同。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。
表2中鏈脂肪酸、植物精油及實(shí)施例1、2對指示菌的mic(μg/ml)
由表2可知，實(shí)施例1和2相對于單一組分提高了其抑菌效果。單一的植物精油、中鏈脂肪酸的效果均不如實(shí)施例1和2的抑菌劑效果，實(shí)施例1和2的配方在兼具更好的抑菌性能的同時(shí)，由于實(shí)施例1和2中的中鏈脂肪酸和植物精油的用量有所降低，因此，降低了大劑量的單一組分對動(dòng)物誘食性的不利影響，能夠更好的對動(dòng)物產(chǎn)生誘食性，且其安全、無毒。
實(shí)施例4實(shí)施例1的抑菌組合物在人工模擬胃液環(huán)境中抑菌特性
人工胃液：參照2010年《中國藥典》二部附錄xa中方法配制人工胃液。略微修改。取濃鹽酸23.4ml加水100ml配制成稀鹽酸。取上述稀hcl1.64ml，加去離子水約80ml，調(diào)節(jié)ph值至4.0，去離子水定容至100ml，121℃高壓滅菌15min后，冷卻至室溫，加入胃蛋白酶1g，混合使其充分溶解，該液為人工胃液(王慧娟，2013)。
在人工胃液環(huán)境中分別加入實(shí)施例1的配方組成溶液和指示菌液，使指示菌最終濃度是105cfu/ml，實(shí)施例1抑菌組合物溶液的最終濃度為500μg/ml，37℃，90rpm(張媛媛，2013)處理4h，然后采用十倍稀釋法涂布計(jì)數(shù)。同時(shí)做指示菌純培養(yǎng)4h后的活菌計(jì)數(shù)，然后計(jì)算殺菌率。按上述同樣操作，測定指示菌在非人工胃液的配方試劑環(huán)境中(即ph7.0，用生理鹽水配置的最優(yōu)組合配方液)的殺菌率，并進(jìn)行比較。
殺菌率的計(jì)算公式如下：
表3實(shí)施例1在人工模擬胃液環(huán)境中抑菌效能評價(jià)
由實(shí)施例4可知，實(shí)施例1在模擬胃液環(huán)境中對指示菌作用4h后，仍能將金黃色葡萄球菌和沙門氏菌全部殺死，而其在此環(huán)境中對大腸桿菌的抑菌效果有所下降，但是其殺菌率仍能達(dá)到95.6％，仍具有較好的抑菌性能，實(shí)施例1在胃液環(huán)境中仍具有良好的抑菌、殺菌穩(wěn)定性。
實(shí)施例5實(shí)施例1在人工模擬腸液環(huán)境中抑菌特性
人工腸液：參照2010年《中國藥典》二部附錄xvd中方法配制人工腸液。取0.68g磷酸二氫鉀，加50ml水溶解，用濃度為0.1mol/l的氫氧化鈉溶液調(diào)成ph＝6.8的溶液，去離子水定容至100ml，121℃高壓滅菌15min后，冷卻至室溫，外取1g胰蛋白酶，0.3％的牛膽鹽(豬膽鹽0.1g)，混合使其充分溶解，即得人工腸液，人工腸液的ph約為6.8，該液為人工腸液(王慧娟，2013)。
在人工腸液環(huán)境中，分別加入實(shí)施例1抑菌組合物配方和指示菌，指示菌最終濃度是105cfu/ml，配方試劑的最終濃度為500μg/ml，37℃，120rpm((張媛媛，2013))處理4h，然后十倍稀釋法涂布計(jì)數(shù)，同時(shí)做指示菌純培養(yǎng)4h后的活菌數(shù)，然后計(jì)算殺菌率。同時(shí)按上述同樣操作，測定在非人工腸液的配方試劑環(huán)境中(ph7.0，用生理鹽水配置的最優(yōu)組合配方)指示菌的殺菌率，并進(jìn)行比較，公式如下所示。
殺菌率的計(jì)算公式如下：
表4實(shí)施例1在模擬腸液環(huán)境中抑菌效能評價(jià)
由實(shí)施例5可知，實(shí)施例1在人工模擬腸液環(huán)境中對指示菌作用4h后，仍能將金黃色葡萄球菌全部殺死，而其在此環(huán)境中對沙門氏菌、大腸桿菌的抑菌能力有所下降，但是其殺菌率仍分別能達(dá)到93.8％、98.24％，仍具有較好的抑菌性能。實(shí)施例1在腸液環(huán)境中仍具有良好的抑菌、殺菌穩(wěn)定性。