本發(fā)明涉及利用生物技術(shù)進(jìn)行農(nóng)產(chǎn)品深加工領(lǐng)域，特別是涉及一種通過固體發(fā)酵過程中添加輔料來增加青稞紅曲中天然γ-氨基丁酸含量的食品工藝學(xué)方法。

背景技術(shù)：

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyricacid，簡稱gaba)是一種非蛋白氨基酸，在人和哺乳動物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，gaba是一種重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，它具有抗驚厥、抗癲癇、降血壓、鎮(zhèn)靜安神、改善腦機(jī)能等功效(林親錄,王婧,陳海軍.γ-氨基丁酸的研究進(jìn)展.現(xiàn)代食品科技,2008,05:496-500)。中國衛(wèi)生部2009年批準(zhǔn)gaba為新資源食品。γ-氨基丁酸主要通過三種方法獲取，即化學(xué)合成法、植物富集法以及微生物發(fā)酵法。微生物發(fā)酵合成gaba安全、成本低，又不會對環(huán)境造成危害，因此具有廣闊的發(fā)展前景。目前，gaba已經(jīng)被用于軟飲料、調(diào)味品、乳制品等食品中(王輝，項(xiàng)麗麗，張鋒華，γ-氨基丁酸(gaba)的功能性及在食品中的應(yīng)用，食品工業(yè)[j]，2013，34(6)：186-189)。在低等生物和高等生物的γ-氨基丁酸的生物合成過程中，關(guān)鍵酶谷氨酸脫羧酶(glutamatedecarboxylase，簡稱gad)可催化谷氨酸脫去α-羧基產(chǎn)生gaba。目前已經(jīng)在乳酸菌、大腸桿菌、曲霉菌等多種細(xì)菌和真菌中都發(fā)現(xiàn)有可催化谷氨酸脫羧生產(chǎn)gaba的谷氨酸脫羧酶存在(范杰，孫君社，張曉杰，等，高產(chǎn)γ-氨基丁酸乳酸菌的篩選及鑒定，中國釀造，2011，4：39-41)。選擇其中對人體有益的微生物進(jìn)行發(fā)酵，生產(chǎn)富含gaba的產(chǎn)品，不僅安全又環(huán)保，而且成本低，在gaba的開發(fā)利用方面前景廣闊。

紅曲霉(monascuspurpureus)是廣泛使用的食品發(fā)酵微生物，我國早在明朝就利用它培制紅曲，并將其用于釀酒、制醋、做豆腐乳的著色劑、食品染色劑和調(diào)味劑或藥用等(郭寶禹，郝林.紅曲霉產(chǎn)物的功能及研究進(jìn)展,釀酒科技，2010，(6)：89-91)。近年來，隨著人們對合成食品添加劑及化學(xué)藥物對人體毒副作用的認(rèn)識的加深；世界各國掀起了食用綠色食品和天然藥物的熱潮，紅曲作為藥食兼用的天然制品，同樣也引起了消費(fèi)者和研究者的極大關(guān)注，其中紅曲gaba、洛伐他汀(lovastatin)、天然色素是紅曲霉的次生代謝產(chǎn)物，也是目前人們在食品開發(fā)和研究中關(guān)注的焦點(diǎn)shiyc,pantm,beneficialeffectsofmonascuspurpureusntu568-fermentedproducts:areview.appliedmicrobiologyandbiotechnology,2011,90(4):1207-1217)。青稞(hordeumvulgarel.var.nudumhook.f.)屬于禾本科大麥屬，在植物上屬于栽培大麥的變種，主要種植于青藏高原地區(qū)，并且是唯一可在海拔4200米以上種植的作物。青稞中含有豐富的蛋白質(zhì)、β-葡聚糖、維生素e等營養(yǎng)和活性成分。尤其是，青稞中含有8種人體必需氨基酸，且賴氨酸含量達(dá)0.36％，而賴氨酸正是其他谷物所缺乏的。隨著育種以及生產(chǎn)技術(shù)的進(jìn)步，青稞產(chǎn)量大大增加，對于青稞深加工的研究逐漸深入開展，在青稞酒、青稞面包、青稞飲料等新食品的研發(fā)上都取得了一定進(jìn)展(高汪磊，龔凌霄，張英，青稞作為我國高原特色谷物資源在功能食品領(lǐng)域的開發(fā)潛力，糧食與油脂[j]，2015，28(2)：1-4)。在先前紅曲霉發(fā)酵青稞的研究和開發(fā)中，大部分研究者均把注意力集中在活性成分monacolink和紅曲色素上，甚至從中分離新的化合物，而gaba在紅曲發(fā)酵青稞發(fā)酵過程中的積累則很少有人關(guān)注。

在現(xiàn)有技術(shù)中，專利cn201210417066.1公布了一種高母育酚含量青稞紅曲的生產(chǎn)工藝，主要利用cgmcc編號3.2666紅曲霉發(fā)酵青稞。專利cn201210380011.8公布了一種高色價青稞紅曲及其制備方法。上述兩個專利的重點(diǎn)分別是母育酚和色素，并非在于紅曲中γ-氨基丁酸含量。專利cn201210379855.0公布了一種高含量γ-氨基丁酸青稞紅曲及其制備方法，該方法在生產(chǎn)過程中涉及到了青稞發(fā)芽操作過程，以及在發(fā)酵過程中添加了外源谷氨酸鈉(谷氨酸脫羧酶催化產(chǎn)γ-氨基丁酸酶促反應(yīng)的底物)，其操作流程復(fù)雜、所得的γ-氨基丁酸是否為純粹由青稞紅曲產(chǎn)出的天然產(chǎn)品，實(shí)施例中并未給出測定gaba的具體方法，因而結(jié)果存疑。專利cn201110069270.4與專利cn201610383978.x所公布的提高γ-氨基丁酸產(chǎn)量的方式都是通過青稞籽粒的發(fā)芽實(shí)現(xiàn)的，與本發(fā)明有著本質(zhì)的區(qū)別。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下明顯的優(yōu)點(diǎn)：

(1)紅曲霉發(fā)酵青稞中，發(fā)酵基質(zhì)中洛伐他汀類物質(zhì)和γ-氨基丁酸共存。

(2)青稞原料前處理簡單，不經(jīng)過發(fā)芽過程，因此發(fā)酵工藝簡單，成本低。

(3)發(fā)酵使用的添加輔料均為常見的農(nóng)副產(chǎn)品，來源廣泛，安全可靠。

(4)發(fā)酵過程不使用任何其它化學(xué)物質(zhì)，沒有食品安全隱患。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種增加青稞紅曲中天然γ-氨基丁酸含量的方法，通過在青稞中添加其它農(nóng)副產(chǎn)品輔料制作固體發(fā)酵培養(yǎng)基，青稞與輔料中的營養(yǎng)成分可提供紅曲霉發(fā)酵所需營養(yǎng)物質(zhì)，接種紅曲霉(cgmcc編號：3.0972)后在25-35℃條件下發(fā)酵7-10天，得到發(fā)酵基質(zhì)中洛伐他汀和天然γ-氨基丁酸共存，經(jīng)干燥、粉碎、滅菌、包裝得到富含洛伐他汀和γ-氨基丁酸的青稞紅曲營養(yǎng)食品添加劑。該青稞紅曲霉的固體發(fā)酵，原輔料組成簡單、來源廣泛、發(fā)酵條件要求不高，具有極大的實(shí)際推廣價值與應(yīng)用價值，是一種極具潛力的提高青稞產(chǎn)品附加值的有效方法。

為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明提供了一種增加青稞紅曲中天然γ-氨基丁酸含量的方法，在青稞中添加黑豆粉、玉米粉、米粉三種輔料，與青稞共同制成用于固體發(fā)酵的底物，接種紅曲霉(monascuspurpureus，cgmcc編號：3.0972)，發(fā)酵后得到的基質(zhì)中，在既保持洛伐他汀類物質(zhì)的基礎(chǔ)上，又增加了天然γ-氨基丁酸的含量。

優(yōu)選地，包括以下幾個步驟：

(1)菌種活化與復(fù)壯

配制菌種活化培養(yǎng)基，高溫滅菌，冷卻至室溫后倒入培養(yǎng)皿中，在無菌條件下接種紅曲霉(monascuspurpureus，cgmcc編號：3.0972)，培養(yǎng)；

(2)液體菌種制備

配制液體種子培養(yǎng)基，高溫滅菌，冷卻至室溫后將活化的紅曲霉菌絲在無菌條件下接入；

(3)青稞篩選

篩選出飽滿、無蟲害、無霉變的青稞籽粒；

(4)添加輔料并制備發(fā)酵培養(yǎng)基

取適量青稞用自來水清洗3-5次，沸水水煮1-2h至青稞籽粒捏開后無“白心”為度；過濾控干多余水分后添加適量玉米粉，黑豆粉，米粉，再分別加入葡萄糖、mgso4·7h2o、caco3，混合均勻，高壓滅菌，自然冷卻至室溫；

(5)發(fā)酵生產(chǎn)

將上述制作好的紅曲霉種子液接入固體發(fā)酵培養(yǎng)基，進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)；

(6)干燥

將青稞發(fā)酵基質(zhì)置于55-60℃烘箱中烘干；

(7)粉碎、滅菌與包裝

烘干后的青稞用粉碎機(jī)粉碎，過30-50目篩網(wǎng)。滅菌后包裝，即得商業(yè)化產(chǎn)品。

需要說明的是，所述菌種活化與復(fù)壯是指將紅曲霉從母種斜面上接種至菌種活化培養(yǎng)基中并培養(yǎng)。

所述液體菌種制備是指將活化的紅曲霉菌絲接種至配制的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，完成液體菌種的制備過程。

所述青稞篩選是指選出飽滿，無蟲害，無霉變的青稞籽粒。

所述添加輔料并制備發(fā)酵培養(yǎng)基是指按照一定的比例加入玉米粉(8％-12％(w/w))、黑豆粉(13％-17％(w/w))，米粉(13％-17％(w/w))，與青稞共同制成固體發(fā)酵培養(yǎng)基。

所述接種與發(fā)酵生產(chǎn)是指在無菌條件下將制備好的紅曲液體菌種接種到上述固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，液體菌種的接種量為5-10％(v/w)。發(fā)酵溫度為25-35℃，發(fā)酵時間為7-10天。

所述干燥是指將青稞發(fā)酵基質(zhì)置于55-60℃烘箱中烘干。

所述粉碎、滅菌與包裝是指將烘干后的青稞用粉碎機(jī)粉碎，過30-50目篩。滅菌后包裝，得商業(yè)化產(chǎn)品。

優(yōu)選地，在步驟(1)中，菌種活化培養(yǎng)基滅菌溫度為121℃，滅菌時間為20min，接種紅曲霉后在25℃-30℃恒溫培養(yǎng)4-5天。

優(yōu)選地，在步驟(2)中，液體菌種培養(yǎng)基滅菌溫度為121℃，滅菌時間為20min，接種后在28℃，220r/min的搖床中培養(yǎng)為約5天。

優(yōu)選地，在步驟(4)中，玉米粉添加量為8％-12％(w/w)，黑豆粉添加量為13％-17％(w/w)，米粉添加量為13％-17％(w/w)，所加入的其他物質(zhì)的質(zhì)量分別是：每100g青稞中添加葡萄糖2.4g、kh2po40.375g、mgso4·7h2o0.25g、caco31g，培養(yǎng)基滅菌溫度為121℃，滅菌時間為60min。

優(yōu)選地，在步驟(5)中，液體菌種的接種量為5-10％(v/w)，且需要無菌操作，發(fā)酵溫度為25-35℃，發(fā)酵時間為7-10天。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為，

1.添加玉米粉，黑豆粉，米粉三種輔料，使用任何一種輔料與青稞制成固體發(fā)酵的培養(yǎng)基，接種紅曲霉后固體發(fā)酵，其發(fā)酵基質(zhì)中同時具有洛伐他汀和γ-氨基丁酸兩種活性成分。

2.同時使用三種輔料，篩選出三種輔料的最佳組合，與青稞制成固體發(fā)酵的培養(yǎng)基，接種紅曲霉后固體發(fā)酵，在保持培養(yǎng)基質(zhì)中洛伐他汀含量不變的前提下，發(fā)酵過程產(chǎn)γ-氨基丁酸效率高、產(chǎn)量大。且所得γ-氨基丁酸完全由紅曲發(fā)酵過程中紅曲霉代謝所產(chǎn)生，天然又安全。

3.三種輔料均為日常生活中食品原料，廉價易得，降低了青稞固體發(fā)酵的生產(chǎn)成本，同時又保證生活中食用的安全性，可直接作為食品添加劑使用。

4.工藝流程簡單、易操作，發(fā)酵條件要求不苛刻，易于大規(guī)模推廣使用。，便于在產(chǎn)業(yè)上推廣和應(yīng)用。

附圖說明

圖1所示為一種添加輔料提高青稞紅曲天然γ-氨基丁酸產(chǎn)量的方法的工藝流程圖；

圖2所示為添加不同輔料對紅曲霉發(fā)酵青稞基質(zhì)中γ-氨基丁酸含量的影響圖；其中，系列1-玉米粉；系列2-黑豆粉；系列3-米粉。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)驗(yàn)室具體的試驗(yàn)數(shù)據(jù)和結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件。

實(shí)施例1：紅曲霉(紅曲霉monascuspurpureus-3.0972)液體菌種的制作

(1)培養(yǎng)基準(zhǔn)備：①復(fù)壯培養(yǎng)基配方如下(g/l)：葡萄糖5，蛋白胨5，酵母提取物2.5，瓊脂10，水500ml，ph自然，用于轉(zhuǎn)接紅曲霉保藏菌種并復(fù)壯。②液體培養(yǎng)基配方如下(g/l)：葡萄糖35；蛋白胨5；酵母提取物5；kh2po4·h2o1；mgso4·7h2o0.5；vb1，0.05；121℃滅菌20min，用于發(fā)酵培養(yǎng)。

制作方法：按照配方要求，分別稱取各營養(yǎng)成分后置于1l試劑瓶，加入去離子水1l，置于高壓滅菌鍋121℃滅菌20min。冷卻后置于4℃冰箱待用。

(2)預(yù)培養(yǎng)：由試管斜面或培養(yǎng)皿平板固體培養(yǎng)基上的菌絲接至固體復(fù)壯培養(yǎng)基平板上，28℃恒溫培養(yǎng)3～4天,菌絲長滿培養(yǎng)皿2/3面積后，停止培養(yǎng)，備用。

用接種產(chǎn)將1cm²左右的平板菌種接至裝有20～40ml液體預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基的150ml三角瓶中，并搗碎。靜置2～3天活化后，將三角瓶放入28℃恒溫?fù)u床中120rpm培養(yǎng)4～6天。

(3)擴(kuò)大培養(yǎng)：將150ml三角瓶中的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入500ml或1l三角瓶中(前者加入100ml,后者加入200ml液體培養(yǎng)基)放入28℃恒溫?fù)u床中120rpm培養(yǎng)5～7天。

(4)結(jié)果：由試管斜面或培養(yǎng)皿平板固體培養(yǎng)基上的菌絲接至固體培養(yǎng)基平板上，28℃恒溫培養(yǎng)3～天后，霉菌菌絲濃密、生長旺盛、氣生菌絲多。擴(kuò)大培養(yǎng)后培養(yǎng)液清亮、菌絲球密度大，符合液體菌種的要求。

實(shí)施例2：固體發(fā)酵培養(yǎng)基中不同輔料添加量對γ-氨基丁酸含量的影響

(1)輔料的種類和用量：以青稞的總量(100g)為基準(zhǔn)，在配方中增加其他輔料，制作固體發(fā)酵培養(yǎng)基?？疾斓奶砑虞o料的種類和用量分別為：①黑豆粉，用量分別為1％、5％、10％、15％、20％；②玉米粉，用量分別為1％、5％、10％、15％、20％；③米粉，用量分別為1％、5％、10％、15％、20％。

(2)固體培養(yǎng)基的制作：取適量青稞用自來水清洗3～5次，沸水水煮1～2h至青稞籽粒捏開后無“白心”為度，過濾。分別添加玉米粉、黑豆粉、米粉等在青稞浸泡后的青稞中，再分別加入(g/100g)葡萄糖2.4、kh2po40.375、mgso4·7h2o0.25、caco31，混合均勻，隨后裝入廣口塑料瓶至瓶肩，封口后121℃高壓滅菌60min，自然冷卻至室溫，待用。

(3)發(fā)酵生產(chǎn)：將上述制作好的種子液按照5％(v/w)的接種量，在無菌操作臺用移液管(槍)接入固體發(fā)酵培養(yǎng)基，進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)。發(fā)酵溫度為30℃，發(fā)酵時間為8天，待菌絲長滿至瓶肩，用于進(jìn)一步分析。

(4)γ-氨基丁酸含量測定：將青稞發(fā)酵基質(zhì)置于58℃烘箱中烘干，烘干后的青稞用粉碎機(jī)粉碎，過30～50目篩網(wǎng)。γ-氨基丁酸含量測定參照趙大偉等人的文獻(xiàn)(趙大偉，普曉英，曽亞文，等，大麥籽粒γ-氨基丁酸含量的測定分析，麥類作物學(xué)報，2009年第1期，69-72頁)。

(5)試驗(yàn)結(jié)果：三種農(nóng)副產(chǎn)品添加對紅曲發(fā)酵青稞基質(zhì)中γ-氨基丁酸含量的影響如圖2所示。由圖2分析可見，gaba的產(chǎn)量隨輔料玉米粉的添加量增加而增加，當(dāng)添加量到達(dá)10％時，gaba的產(chǎn)量最高，為19.62±0.23mg/100g，繼續(xù)加量，gaba產(chǎn)量趨于平穩(wěn)呈微微下降趨勢。當(dāng)黑豆粉添加量到達(dá)15％時，gaba的產(chǎn)量最高，為22.96±0.11mg/100g，繼續(xù)加量，gaba產(chǎn)量趨于平穩(wěn)呈微微下降趨勢。當(dāng)米粉添加量到達(dá)15％時，gaba的產(chǎn)量最高，為19.15±0.04mg/100g，繼續(xù)加量，gaba產(chǎn)量趨于平穩(wěn)呈微微下降趨勢。為了盡可能提高gaba產(chǎn)量，以輔料玉米粉10％、黑豆粉15％、米粉15％添加量為最佳。

實(shí)施例3：三種輔料組合配方對紅曲霉發(fā)酵青稞培養(yǎng)基質(zhì)中γ-氨基丁酸含量的影響

(1)配方的設(shè)計(jì)：選用輔料黑豆粉、玉米粉、米粉的添加量為因素，設(shè)計(jì)l9(3³)三因素三水平正交實(shí)驗(yàn)，以產(chǎn)gaba量為指標(biāo)，優(yōu)化出添加輔料的最佳培養(yǎng)基配方條件。

正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1正交試驗(yàn)因子水平

(2)固體培養(yǎng)基的制作、發(fā)酵生產(chǎn)、γ-氨基丁酸含量測定等同實(shí)施例2。

(3)試驗(yàn)結(jié)果：正交實(shí)驗(yàn)的結(jié)果如表2所示。

由表2，極差分析可得出3個因素中影響青稞產(chǎn)gaba主要因素是黑豆粉添加量，其次是玉米粉添加量、米粉添加量。進(jìn)一步的方差分析可得出添加玉米粉、黑豆粉、米粉3個因素對紅曲霉發(fā)酵青稞產(chǎn)gaba影響均達(dá)顯著水平。

(4)結(jié)果分析：對試驗(yàn)結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，在所采用的3種輔料中，黑豆粉是主要因素，其次是玉米粉和米粉，以各因素不同水平下的gaba量對各水平作圖分析(圖略)發(fā)現(xiàn)：因素a、c隨著水平的增加，gaba量均值呈先上升后下降，隨著因素b水平的增加gaba量呈直線上升，比較發(fā)現(xiàn)a2、b3、c2在每一個因素的水平下對青稞產(chǎn)gaba的效果最好，由此確定最佳工藝配方的組合為a2b3c2。

表2正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

實(shí)施例4：三種輔料最佳組合配方固體發(fā)酵培養(yǎng)基質(zhì)中活性成分分析

(1)培養(yǎng)基配方為a2b3c2，即玉米粉輔料添加量10％，黑豆粉添加量為17％，米粉添加量為15％。按照此配方，添加48％青稞，制成固體培養(yǎng)基，進(jìn)行驗(yàn)證發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，共設(shè)3個平行組。

(2)固體培養(yǎng)基的制作：取適量青稞用自來水清洗3-5次，沸水水煮1-2h至青稞籽粒捏開后無“白心”為度，過濾。分別添加玉米粉10％、黑豆粉17％、米粉15％，再按照配方要求(g/100g)加入葡萄糖2.4、kh2po40.375、mgso4·7h2o0.25、caco31，混合均勻，隨后裝入廣口塑料瓶至瓶肩，封口后121℃高壓滅菌60min，自然冷卻至室溫，待用。

(3)發(fā)酵生產(chǎn)：將上述制作好的種子液按照5％～10％(v/w)的接種量，在無菌操作臺用移液管(槍)接入固體發(fā)酵培養(yǎng)基，進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)。發(fā)酵溫度為30℃，發(fā)酵時間為8～10天，待菌絲長滿至瓶肩，用于進(jìn)一步分析。

(4)γ-氨基丁酸含量測定：將青稞發(fā)酵基質(zhì)置于58℃烘箱中烘干，烘干后的青稞用粉碎機(jī)粉碎，過30-50目篩網(wǎng)。γ-氨基丁酸含量測定參照趙大偉等人的文獻(xiàn)(趙大偉，普曉英，曽亞文，等，大麥籽粒γ-氨基丁酸含量的測定分析，麥類作物學(xué)報，2009年第1期，69-72頁)。

(5)洛伐他汀成分含量測定：洛伐他汀含量測定參照宋洪濤等的文獻(xiàn)描述的方法，采用hplc法測定分析。(宋洪濤等，hplc法對不同來源紅曲中洛伐他汀的定量分析，中草藥，1999年第02期100-101頁。)

(6)結(jié)果：①3組平行實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，gaba產(chǎn)量約為24.62±0.18mg/100g。②洛伐他汀的含量約為3.63±12g/100g。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出的是，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。