本申請為專利申請201180023168.9(申請日：2011年5月9日，發(fā)明創(chuàng)造名稱：源自桿菌屬微生物的還原劑及其用途)的分案申請。

本發(fā)明涉及源自桿菌屬微生物的還原劑及其用途。本發(fā)明的還原劑在改善食用肉或食用肉加工品的色調的目的方面特別有用。本申請主張于2010年5月12日申請的日本專利申請第2010-109779號的優(yōu)選權，通過參照引用該專利申請的全部內(nèi)容。

背景技術：

食用肉的顏色是消費者評價肉質時的重要因素。若為鮮紅色，則判斷是優(yōu)質的食用肉，若為褐色，則被看作是不新鮮等，肉色對消費者對于食用肉的購買意愿、評價造成很大的影響。

而且，食用肉的色調反映肉中存在的肌紅蛋白衍生物的比例。若此肌紅蛋白被氧化，則成為高鐵肌紅蛋白，色調變化為褐色，成為使食用肉制品的經(jīng)濟價值顯著下降的主要原因。

為了防止食用肉的褐變，在火腿、香腸等畜肉加工品中，一般使用硝酸鹽、亞硝酸鹽顯色劑。但是，硝酸鹽、亞硝酸鹽由于具有引起高鐵血紅蛋白血癥的急性毒性，所以使用量被限制成以殘存亞硝酸根計成為70ppm以下。另外，亞硝酸被指出與仲胺反應而形成作為致癌性物質的亞硝胺的可能性。因此，從安全性的觀點出發(fā)，進行了替代硝酸鹽、亞硝酸鹽顯色劑的具有顯色效果的物質、顯色方法的探索。例如發(fā)現(xiàn)了通過添加棉子糖而防止褐變的方法(參照專利文獻1)、通過添加金針菇提取物而防止褐變的方法(參照專利文獻2)、利用蔬菜類中含有的成分而顯色的方法(參照專利文獻3)。但是，在專利文獻1的方法或專利文獻2的方法中顯色效果不足，在專利文獻3的方法中利用蔬菜類中含有的硝酸鹽，安全性存在問題。

另一方面，還提出了通過將肌紅蛋白中的鐵置換為鋅來形成肌紅蛋白鋅原卟啉ix絡合物而維持食用肉的色調的方法(專利文獻4)、利用亞鐵螯合酶或酵母促進肌紅蛋白鋅原卟啉ix絡合物的生成而保持食用肉的鮮紅色的方法(專利文獻5、6)。在這些方法中，無法作用于已經(jīng)生成的高鐵肌紅蛋白，顯色乃至色調維持效果有限。

專利文獻

專利文獻1：日本特開2003-18976號公報

專利文獻2：日本特開2008-228702號公報

專利文獻3：日本特開2009-165445號公報

專利文獻4：日本特開2006-56908號公報

專利文獻5：日本特開2005-87058號公報

專利文獻6：日本特開2006-61016號公報

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明以提供對食用肉或食用肉加工品的色調改善有效的還原劑及其用途(不使用亞硝酸鹽等顯色劑的色調改善方法等)為課題。

本發(fā)明人為了找出改善食用肉色調的物質而以桿菌屬微生物為中心實施了篩選。篩選的結果確定了產(chǎn)生食用肉顯色效果高的物質的微生物株。進一步進行研究的結果明確了被期待高有用性的該物質對高鐵肌紅蛋白顯示還原活性。即，發(fā)現(xiàn)桿菌屬微生物產(chǎn)生通過高鐵肌紅蛋白還原活性而促進食用肉顯色的物質。該物質是對血紅素顯示還原作用的物質，不限于食用肉的顯色，在血紅素或血紅素蛋白的還原有效乃至必要的其它用途方面也可利用。例如，在還原具有與高鐵肌紅蛋白類似的結構的高鐵血紅蛋白等的目的下可利用該物質。

進一步的研究結果判明了源自桿菌屬微生物的上述物質(顯示還原作用的物質)為二氫硫辛酰胺脫氫酶和硝基還原酶。

本發(fā)明是基于上述結果而完成的，其如下所示。

[1]一種還原劑，含有源自桿菌屬微生物的血紅素還原酶。

[2]根據(jù)[1]中記載的還原劑，其特征在于，所述血紅素為高鐵肌紅蛋白的血紅素。

[3]根據(jù)[1]中記載的還原劑，其特征在于，所述血紅素為高鐵血紅蛋白的血紅素。

[4]根據(jù)[1]～[3]中任一項記載的還原劑，其特征在于，由桿菌屬微生物的菌體粉碎物構成。

[5]根據(jù)[1]～[4]中任一項記載的還原劑，其中，所述桿菌屬微生物為選自枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、納豆菌、蘇云金芽孢桿菌、及蕈狀芽胞桿菌中的微生物。

[6]根據(jù)[1]中記載的還原劑，其中，所述血紅素還原酶為二氫硫辛酰胺脫氫酶或硝基還原酶。

[7]根據(jù)[1]中記載的還原劑，其中，作為所述血紅素還原酶，含有二氫硫辛酰胺脫氫酶和硝基還原酶。

[8]根據(jù)[6]或[7]中記載的還原劑，其中，所述二氫硫辛酰胺脫氫酶的氨基酸序列含有序列號3的氨基酸序列，所述硝基還原酶的氨基酸序列含有序列號12的氨基酸序列。

[9]根據(jù)[6]～[8]的任一項中記載的還原劑，其中，所述二氫硫辛酰胺脫氫酶和所述硝基還原酶為重組蛋白質。

[10]一種色調改善劑，由[1]～[9]中任一項記載的還原劑構成。

[11]一種色調改善劑，是將[1]～[9]中任一項記載的還原劑與顯示將肌紅蛋白的血紅素基中的鐵置換成鋅的作用的物質組合而成的。

[12]根據(jù)[11]中記載的色調改善劑，其中，所述物質為亞鐵螯合酶。

[13]根據(jù)[10]～[12]中任一項記載的色調改善劑，其中，所述色調改善劑用于改善食用肉或食用肉加工品的色調。

[14]一種食用肉或食用肉加工品用的色調改善劑，含有二氫硫辛酰胺脫氫酶和/或硝基還原酶。

[15]根據(jù)[10]～[14]中任一項記載的色調改善劑，其中，所述色調改善劑通過顯色作用、顯色促進作用和/或防褪色作用來改善色調。

[16]一種醫(yī)藥品，其特征在于，含有[1]～[9]中任一項記載的還原劑。

[17]根據(jù)[16]中記載的醫(yī)藥品，其中，所述醫(yī)藥品是口服給藥制劑。

[18]根據(jù)[16]中記載的醫(yī)藥品，其中，所述醫(yī)藥品是非口服給藥制劑。

[19]一種還原劑的制造方法，所述制造方法包括以下步驟(1)和(2)：

(1)將產(chǎn)生血紅素還原酶的桿菌屬微生物在產(chǎn)生該酶的條件下培養(yǎng)的步驟；

(2)從培養(yǎng)產(chǎn)物回收所述酶的步驟。

[20]根據(jù)[19]中記載的制造方法，其中，所述步驟(2)由以下步驟構成：

(2-1)從培養(yǎng)產(chǎn)物收集菌體的步驟；

(2-2)制備菌體粉碎物的步驟。

[21]根據(jù)[19]或[20]中記載的制造方法，其特征在于，所述血紅素為高鐵肌紅蛋白的血紅素。

[22]根據(jù)[19]或[20]中記載的制造方法，其特征在于，所述血紅素為高鐵血紅蛋白的血紅素。

[23]根據(jù)[19]～[22]中任一項記載的制造方法，其中，所述桿菌屬微生物為選自枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、納豆菌、蘇云金芽孢桿菌、及蕈狀芽胞桿菌中的微生物。

[24]一種色調改善方法，其特征在于，使[10]～[15]中任一項記載的色調改善劑作用于食用肉或食用肉加工品。

[25]一種色調改善方法，其特征在于，使選自枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、納豆菌、蘇云金芽孢桿菌、及蕈狀芽胞桿菌中的桿菌屬微生物的菌體粉碎物作用于食用肉或食用肉加工品。

[26]一種使用了[1]～[9]中任一項所述的還原劑的預防或治療方法，預防或治療血液循環(huán)障礙、低氧癥或血氧減少狀態(tài)，伴有血液循環(huán)障礙、低氧癥及血氧減少狀態(tài)中的一種以上的病理乃至癥狀的疾病，或由血液循環(huán)障礙、低氧癥及血氧減少狀態(tài)中的一種以上的病理乃至癥狀所引起的疾病。

附圖說明

[圖1]示出將桿菌屬菌體粉碎提取物或其加熱處理物添加于豬腿肉凍干粉末中而成的溶液的吸收光譜的圖。

[圖2]示出將桿菌屬菌體粉碎提取物添加于豬腿肉凍干粉末中而成的溶液在保存中的580nm下吸光度(a580)經(jīng)時變化的圖。

[圖3]示出桿菌屬菌體粉碎提取物凍干粉末中的高鐵肌紅蛋白還原酶活性的圖。

[圖4]示出高鐵肌紅蛋白還原酶純化過程中的通過deae色譜法得到的溶出圖和高鐵肌紅蛋白還原酶活性的圖。

[圖5]示出高鐵肌紅蛋白還原酶純化過程中的通過羥基磷灰石色譜法得到的溶出圖和高鐵肌紅蛋白還原酶活性的圖。

[圖6]示出高鐵肌紅蛋白還原酶純化過程中的通過凝膠過濾色譜法得到的溶出圖和高鐵肌紅蛋白還原酶活性的圖。

[圖7]示出以比活性高的凝膠過濾組分為試樣的sds-page結果的圖。

[圖8]比較在各純化階段得到的試樣的比活性的圖。

[圖9]示出使用了純化酶(二氫硫辛酰胺脫氫酶：dld)的食用肉顯色試驗結果的圖。對酶量不同的試樣進行比較。

[圖10]示出使用了純化酶(dld)的食用肉顯色試驗結果的圖。按照nadh的有無進行比較。

[圖11]示出純化酶(dld)的速率法分析結果(底物飽和曲線)的圖。

[圖12]示出純化酶(dld)的速率法分析結果([s]/v～[s]標繪)的圖。

[圖13]示出純化酶(dld)的最適ph的圖。

[圖14]示出純化酶(dld)的ph穩(wěn)定性的圖。

[圖15]示出純化酶(dld)的最適溫度的圖。

[圖16]示出純化酶(dld)的熱穩(wěn)定性的圖。

[圖17]示出純化酶(dld)對nadh和nadph的反應性的圖。

[圖18]示出各種陽離子對純化酶(dld)活性所造成的影響的圖。

[圖19]示出重組dld(無his標簽)的高鐵肌紅蛋白還原活性的圖。

[圖20]示出重組dld(有his標簽)的高鐵肌紅蛋白還原活性的圖。

[圖21]示出使用了重組dld的食用肉顯色試驗結果的圖。r值、g值和b值為，陰性對照(左)為178、104和102，純化重組dld(右)為210、104和114。

[圖22]示出使用了重組dld的食用肉顯色試驗結果的圖。r值、g值和b值為，試樣1為201、117和123，試樣2為185、121和105，試樣3為217、97和93，試樣4為160、108和83，試樣5為156、84和65。

[圖23]示出使用了重組dld的食用肉顯色試驗結果的圖。r值、g值和b值為，試樣1為168、122和106，試樣2為185、152和145，試樣3為172、123和119，試樣4為187、153和144，試樣5為173、148和123。

[圖24]示出對dld以外的食用肉顯色酶的純化過程中的通過苯基色譜法得到的溶出圖和高鐵肌紅蛋白還原酶活性的圖。

[圖25]示出對dld以外的食用肉顯色酶的純化過程中的通過羥基磷灰石色譜法得到的溶出圖和高鐵肌紅蛋白還原酶活性的圖。

[圖26]示出對dld以外的食用肉顯色酶的純化過程中的通過cu親和色譜法得到的溶出圖和高鐵肌紅蛋白還原酶活性的圖。

[圖27]示出以通過羥基磷灰石色譜法得到的組分和通過cu親和色譜法得到的組分為試樣的sds-page結果的圖。

[圖28]示出重組蘋果酸脫氫酶(malatedehydrogenase：mdh)和重組硝基還原酶(putativenad(p)hnitroreductase：yodc)的活性的圖。從左側起依次為yodc/pet20b/bl21(de3plyss)(枯草芽孢桿菌)、yodc/pet20b/bl21(de3plyss)(納豆菌)、pet20b/bl21(de3plyss)(空白載體)、mdh/pet20b/bl21(de3plyss)(枯草芽孢桿菌)、mdh/pet20b/bl21(de3plyss)(納豆菌)。

[圖29]示出以重組mdh和重組yodc為試樣的sds-page的結果的圖。從左側起依次為標記物、mdh/pet20b/bl21(de3plyss)(枯草芽孢桿菌)、yodc/pet20b/bl21(de3plyss)(枯草芽孢桿菌)、pet20b/bl21(de3plyss)、mdh/pet20b/bl21(de3plyss)(納豆菌)、yodc/pet20b/bl21(de3plyss)(納豆菌)、標記物。

[圖30]示出使用了經(jīng)純化的重組yodc和重組mdh的食用肉顯色試驗的結果的圖。

[圖31]示出重組yodc的最適ph的圖。

[圖32]示出重組yodc的ph穩(wěn)定性的圖。

[圖33]示出重組yodc的最適溫度的圖。

[圖34]示出重組yodc的熱穩(wěn)定性的圖。

[圖35]示出重組yodc對nadph的反應性的圖。

[圖36]示出各種陽離子對重組yodc活性所造成的影響的圖。

[圖37]比較示出dld和yodc對鐵氰化鉀的反應性的圖。

[圖38]比較示出dld和yodc對肌紅蛋白的反應性的圖。

具體實施方式

(用語)

在本說明書中所謂“血紅素”指由鐵原子和卟啉構成的絡合物(鐵卟啉絡合物)。所謂“血紅素蛋白”是含有血紅素的蛋白質的統(tǒng)稱。另外，所謂“血紅素還原酶”是指對血紅素中的鐵原子顯示還原活性的蛋白質。該活性的強度(程度)無特殊限定。典型地表示血紅素還原酶還原血紅素蛋白的高鐵化合物的活性。在關注此活性的情況下，也可將血紅素還原酶稱為血紅素蛋白還原酶。

在本說明書中所謂“高鐵肌紅蛋白還原酶”是指顯示出還原作為肌紅蛋白衍生物的高鐵肌紅蛋白的活性的蛋白質。該活性的強度(程度)無特殊限定。因此，即使其它的酶活性占優(yōu)，只要顯示出對高鐵肌紅蛋白的還原活性，就相當于本說明書中的“高鐵肌紅蛋白還原酶”。

在本說明書中所謂“色調改善劑”指可用于改善金屬卟啉絡合物與其形成有關的“色調”的物質或組合物。作為金屬卟啉絡合物，存在銅卟啉絡合物、鈷卟啉絡合物、鐵卟啉絡合物等，但只要是該卟啉絡合物中的金屬能夠被還原的狀態(tài)下的絡合物，就無特殊限制。作為優(yōu)選的金屬卟啉絡合物，可列舉出鐵卟啉絡合物，作為含有該鐵卟啉絡合物的組合物，可列舉出血紅素蛋白。作為富含血紅素蛋白的組合物，可列舉出食用肉或食用肉加工品。

本發(fā)明的色調改善劑通過顯色作用、顯色促進作用和/或防褪色作用而改善對象的色調。例如，本發(fā)明的色調改善劑可通過還原金屬卟啉絡合物中的金屬而改善色調。或者，可通過防止由金屬卟啉絡合物構成的色素的氧化而維持該色素的色調，并且可改善色調。本發(fā)明的色調改善劑得到適用的優(yōu)選對象為食用肉或食用肉加工品。即，在優(yōu)選的一個實施方式中，本發(fā)明的色調改善劑被用于食用肉或食用肉加工品的顯色、維持色調或防止褪色。應予說明，所謂“食用肉的顯色”是指顯現(xiàn)出食用肉或食用肉加工品所特有的紅色色調。

1.源自桿菌(bacillus)屬的還原劑

本發(fā)明的第1方面涉及還原劑。本發(fā)明的還原劑以桿菌屬產(chǎn)生的血紅素還原酶為有效成分。如下述實施例所示，由本發(fā)明人所實施的大規(guī)模篩選的結果是明確了作為桿菌屬微生物的枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)、解淀粉芽孢桿菌(bacillusamiloliquefaciens)、納豆菌(bacillusnatto)、蘇云金芽孢桿菌(bacillusthuringiensis)及蕈狀芽胞桿菌(bacillusmycoides)產(chǎn)生高鐵肌紅蛋白還原活性優(yōu)異的多肽?；诖艘娊?，在本發(fā)明優(yōu)選的一個實施方式中，可使用這些微生物中的任一種產(chǎn)生的高鐵肌紅蛋白還原酶。應予說明，這些微生物例如可從公共的保藏機構(nbrc(獨立行政法人制品評價技術基盤機構生物遺傳資源部門)、jcm(理化學研究所生物資源中心)、atcc(americantypeculturecollection，美國標準菌庫)等)獲取。關于納豆菌，已有市售，可容易地獲取。另外也可從宮城野納豆菌制造所獲取。

就本發(fā)明的還原劑而言，除了有效成分(多肽)以外，還可含有賦形劑、緩沖劑、混懸劑、穩(wěn)定劑、ph調節(jié)劑、保存劑、防腐劑、香料、增稠劑、油脂、光亮劑、粘結劑、粘結增強劑、乳化穩(wěn)定劑、生理鹽水等。作為賦形劑，可使用淀粉、糊精、麥芽糖、海藻糖、乳糖、d-葡萄糖、山梨醇、d-甘露醇、白糖、甘油等。作為緩沖劑，可使用磷酸鹽、枸櫞酸鹽、乙酸鹽等。作為穩(wěn)定劑，可使用丙二醇、抗壞血酸等。作為ph調節(jié)劑，可使用衣康酸、琥珀酸、酒石酸、富馬酸、枸櫞酸、蘋果酸、己二酸、葡萄糖酸、焦磷酸、乙酸、乳酸、α-酮戊二酸、植酸等有機酸或有機酸鹽；碳酸等無機酸或無機酸鹽；天冬氨酸、谷氨酸等酸性氨基酸；精氨酸、賴氨酸、組氨酸等堿性氨基酸等。作為保存劑，可使用苯酚、苯扎氯銨、苯甲醇、氯丁醇、尼泊金甲酯等。作為防腐劑，可使用乙醇、苯扎氯銨、對羥基苯甲酸、氯丁醇等。作為香料，可使用麝香、麝貓香、海貍香、龍涎香等動物性香料；茴芹精油、當歸精油、依蘭精油、鳶尾精油、茴香精油、橙精油、卡南加精油、香菜精油、小豆蔻精油、愈創(chuàng)木精油、枯茗精油、山胡椒精油、桂皮精油、肉桂精油、天竺葵精油、苦配巴精油、芫荽精油、紫蘇精油、雪松精油、香茅精油、茉莉精油、姜草精油、杉樹精油、留蘭香精油、歐薄荷精油、大茴香精油、晚香玉精油、丁香精油、橙花精油、鹿蹄草精油、妥魯香膠精油、廣藿香精油、玫瑰精油、馬丁香精油、柏樹精油、絲柏精油、白檀精油、苦橙葉精油、月桂精油、巖石草精油、佛手柑精油、秘魯香膠精油、紫檀精油、香樟精油、蜜桔精油、桉樹精油、酸橙精油、薰衣草精油、沉香精油、檸檬草精油、檸檬精油、迷迭香精油、日本薄荷精油等植物性香料；其它合成香料等。作為增稠劑，可使用天然高分子或者淀粉系或纖維素系天然高分子衍生物等。作為天然高分子，例如可列舉出褐藻糖膠、卡拉膠等海藻提取物，瓜爾膠等種子粘出物，阿拉伯膠等樹脂樣粘著物，或黃原膠等微生物產(chǎn)生的粘著物質等。作為淀粉系或纖維素系天然高分子衍生物，例如可列舉出磷酸淀粉等淀粉系或甲基纖維素等纖維素系的天然高分子衍生物。作為油脂，例如可使用鱷梨油、亞麻籽油、杏仁油、茴香油、紫蘇油、橄欖油、橙油、橘棘鯛魚油、可可脂、母菊油、胡蘿卜油、瓢果油、椰子油、芝麻油、米糠油、紅花油、乳木果油、液態(tài)乳木果油、大豆油、山茶油、玉米油、菜籽油、桃仁油、蓖麻油、葵花籽油、葡萄籽油、棉籽油、花生油、甲魚油、水貂油、卵黃油、棕櫚油、棕櫚仁油、木蠟、椰子油、牛油、豬油等。另外，也可使用對這些油脂進行氫化、分級、酯交換等處理而改性的油脂。作為光亮劑，可使用蜂蠟、棕櫚臘、鯨蠟、羊毛脂、液體羊毛脂、還原羊毛脂、硬質羊毛脂、小燭樹蠟、蒙旦蠟、蟲膠蠟、米糠蠟、角鯊烯、角鯊烷、姥鮫烷等蠟類(植物性、動物性不限)；液體石蠟、凡士林、石蠟、地蠟、純地蠟、微晶蠟等礦物油。作為粘結劑，可使用大豆蛋白、卵蛋白、乳蛋白、血液蛋白、酪蛋白、淀粉、轉谷氨酰胺酶等。作為粘結增強劑，可使用聚磷酸鹽等。作為乳化穩(wěn)定劑，可使用酪蛋白鈉等。作為其它添加劑，還可含有月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、山崳酸、油酸、亞油酸、亞麻酸、二十二碳六烯酸、二十碳五烯酸、12-羥基硬脂酸、十一烯酸、妥爾油、羊毛脂脂肪酸等天然脂肪酸；異壬酸、己酸、2-乙基丁酸、異戊酸、2-甲基戊酸、2-乙基己酸、異戊酸等合成脂肪酸等的脂肪酸。

在一個實施方式中，本發(fā)明的還原劑由產(chǎn)生本發(fā)明所涉及的多肽的微生物的菌體粉碎物構成。即，該實施方式的還原劑含有規(guī)定的微生物的菌體粉碎物?？蓪⒕w粉碎液(通常通過由微生物的培養(yǎng)、集菌和菌體粉碎構成的一系列工序獲得)直接作為菌體粉碎物使用。另一方面，也可在將菌體粉碎液供于進一步的處理(純化處理、冷凍處理、干燥處理、其它成分的添加等)后作為菌體粉碎物使用。

通過本發(fā)明人等的研究判明了源自桿菌屬微生物的有效成分(顯示還原作用，對改善食用肉的色調特別有效的物質)為二氫硫辛酰胺脫氫酶(dld)和硝基還原酶(yodc)(參照下述的實施例)。因此，作為本發(fā)明的一個實施方式，提供含有源自桿菌屬微生物的二氫硫辛酰胺脫氫酶或硝基還原酶作為血紅素還原酶的還原劑。在優(yōu)選的一個實施方式中，含有二氫硫辛酰胺脫氫酶和硝基還原酶的兩者。應予說明，將二氫硫辛酰胺脫氫酶的氨基酸序列表示為序列號3。同樣將硝基還原酶的氨基酸序列表示為序列號12。

如上所述，由于確定了有效的血紅素還原酶，并且確認了其氨基酸序列，所以可使用通過遺傳工程學制備的酶。因此，在本發(fā)明的一個實施方式中使用通過遺傳工程學制備的酶，即由重組蛋白構成的血紅素還原酶。具體而言，提供以重組二氫硫辛酰胺脫氫酶和/或重組硝基還原酶為有效成分的還原劑。應予說明，所謂重組蛋白是指通過基因重組技術而人工制造的蛋白質。

2.還原劑的用途

本發(fā)明的第2方面涉及本發(fā)明的還原劑的用途。本發(fā)明所提供的用途大致分為色調的改善和其它用途。前者的用途，即作為色調改善劑的使用是特別重要的。金屬卟啉絡合物與其色調的形成有關的物質是利用本發(fā)明改善色調的對象。作為優(yōu)選的對象，可列舉出食用肉和食用肉加工品。食用肉的色調反映存在于肉中的肌紅蛋白衍生物的比例。如上所述，本發(fā)明的還原劑以血紅素還原酶(優(yōu)選高鐵肌紅蛋白還原酶)為有效成分。因此，若使本發(fā)明的還原劑作用于食用肉，則食用肉中的高鐵肌紅蛋白被還原，生成還原型肌紅蛋白。還原型肌紅蛋白通過氧化被轉化成顯示鮮紅色色調的氧合肌紅蛋白。若使本發(fā)明的還原劑進行作用，則食用肉或食用肉加工品中的高鐵肌紅蛋白量降低，同時生成氧合肌紅蛋白，結果色調得到改善。另外，可防止還原型肌紅蛋白或氧合肌紅蛋白的氧化，作為其結果，還可期待能夠防止食用肉褪色的效果。這樣，根據(jù)本發(fā)明的還原劑，不僅顯色，而且可發(fā)揮維持色調，即防止褪色的效果。發(fā)揮防腿色效果時的作用對象為金屬卟啉絡合物，只要是該絡合物中的金屬能夠被氧化的絡合物，就無特殊限制。優(yōu)選的金屬卟啉絡合物為鐵卟啉絡合物。因此，期待防腿色效果時的優(yōu)選對象為含有鐵卟啉絡合物的血紅素蛋白。最優(yōu)選的對象為含有還原型肌紅蛋白或氧合肌紅蛋白以及上述2種肌紅蛋白(還原型肌紅蛋白、氧合肌紅蛋白)中的任一種/或兩者的食用肉或食用肉加工品。

在將本發(fā)明的還原劑用于改善食用肉或食用肉加工品的色調時(即使用本發(fā)明的還原劑作為色調改善劑的色調改善方法)，應使用本發(fā)明的還原劑處理食用肉或食用肉加工品。處理條件原則上設為構成還原劑的肌紅蛋白還原酶良好地發(fā)揮作用的條件(優(yōu)選最適條件)即可。優(yōu)選的處理條件可通過使用了作為處理對象的食用肉或食用肉加工品的預試驗而容易地確定乃至設定。以下示出處理方法的具體實例(將菌體粉碎液用于改善食用肉的色調的情況)。首先，準備規(guī)定的微生物(產(chǎn)生高鐵肌紅蛋白還原酶的桿菌屬微生物)的菌體粉碎液，將ph調整至5.5附近。這是為了重現(xiàn)肉中的ph。接著，于4℃下與食用肉接觸。作為接觸方法，通常有對于肉塊注射混懸液進行滾揉、對于肉末混合混懸液等的方法。通過進行合適的接觸方法，混懸液浸透食用肉整體。對于處理溫度而言，雖然在40℃附近也可顯色，但若考慮食用肉的品質，則優(yōu)選在4℃或4℃附近進行。

作為處理對象的食用肉的種類無限制。如上所述，食用肉的色調反映存在于肉中的肌紅蛋白衍生物的比例。本發(fā)明的還原劑對食用肉中的肌紅蛋白衍生物的比例造成影響，促進顯色。因此，可對全部含有肌紅蛋白的食用肉或食用肉加工品應用本發(fā)明。具體而言，可將豬肉、牛肉、雞肉等畜肉或它們的加工品，或者金槍魚、鰹魚、鮭魚等魚肉或它們的加工品作為處理對象。但是，呈紅色的食用肉可以說是優(yōu)選的處理對象。作為處理對象之一的食用肉加工食品只要是以食用肉為原料制造的食品就無特殊限定。作為食用肉加工品，例如可列舉出生火腿、香腸、烤火腿。對于作為處理對象的食用肉或食用肉加工品的形狀亦無特別限制?？筛鶕?jù)用途適宜選擇肉塊、肉末等。

在本發(fā)明的一個實施方式中，將本發(fā)明的還原劑與顯示將肌紅蛋白的血紅素基中的鐵置換成鋅的作用的物質(以下稱“鐵-鋅置換物質”)合用。這樣，若將本發(fā)明的還原劑與作用不同的物質合用，則色調可因復合效果而得到進一步改善。特別是也關系到良好的色調維持、防褪色。作為鐵-鋅置換物質，例如可使用亞鐵螯合酶(詳情參照日本特開2006-61016號公報)。亞鐵螯合酶存在于動物組織(特別是內(nèi)臟)、植物組織(蘑菇類、豆芽、豌豆等)、酵母(面包酵母、啤酒酵母、清酒酵母、葡萄酒酵母、燒酒酵母等)、細菌等中?？墒褂脧倪@些天然物質提取的亞鐵螯合酶。另外，由于線粒體組分中富含亞鐵螯合酶，所以特別優(yōu)選使用線粒體組分。作為鐵-鋅置換物質，也可使用酵母菌屬酵母(啤酒酵母、面包酵母、清酒酵母、燒酒酵母等)(詳情參照日本特開2005-87058號公報)。

該實施方式的特征在于將本發(fā)明的還原劑與鐵-鋅置換物質組合使用。代表性地以混合本發(fā)明的還原劑和鐵-鋅置換物而成的配合劑的方式，提供本發(fā)明的色調改善劑。另一方面，例如也能夠以由本發(fā)明的還原劑(第1構成要素)和含有鐵-鋅置換物質的制劑(第2構成要素)構成的試劑盒的方式，提供本發(fā)明的色調改善劑。在此情況下，將處理對象(食用肉或食用肉加工品)用第1構成要素和第2構成要素同時或分別進行處理。這里的“同時”并非要求嚴密的同時性。因此，將兩種要素混合后使用等在兩種要素的使用無時間差的條件下實施的情況自不必說，使用一方后迅速使用另一方等在兩種要素的使用無實質的時間差的條件下實施的情況也包含在這里的“同時”的概念中。

在將本發(fā)明的還原劑用于色調改善劑時，除了有效成分(多肽)和上述添加劑(賦形劑、緩沖劑、混懸劑、穩(wěn)定劑、ph調節(jié)劑、保存劑、防腐劑、香料、增稠劑、油脂、光亮劑、粘結劑、粘結增強劑、乳化穩(wěn)定劑、生理鹽水等)以外，還可使用調味料、香辛料、掩蔽劑、軟化劑等。作為調味料，可使用醬油、醬、醋、酒、料酒、鹽、鰹魚或昆布等的湯汁、肉提取物、蔬菜提取物等。作為香辛料，可使用胡椒、月桂、百里香、丁香、牛至、八角、花椒、鼠尾草、歐芹、肉豆蔻、芥末、姜、肉桂、羅勒、辣椒、迷迭香、留蘭香、檸檬草、龍蒿、細葉芹、小豆蔻、枯茗、芫荽、蒔蘿、茴香、馬郁蘭、多香果等。作為掩蔽劑，可使用蔗糖、環(huán)糊精等糖類；丁香、多香果、月桂、肉桂、肉豆蔻等草本類等。作為軟化劑，可使用蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、番木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、無花果蛋白酶等蛋白分解酶等。

本發(fā)明的還原劑也可用于食用肉以外的領域。可以為了含有肌紅蛋白以外的血紅素蛋白(例如血紅蛋白)的組合物的還原或抗氧化(包括防褪色)的目的而使用本發(fā)明的還原劑。

本發(fā)明的還原劑也可期待在血紅蛋白濃度的測定、血紅蛋白血癥的治療中的應用。即，本發(fā)明的還原劑也可用作試劑或醫(yī)藥品的有效成分。目前，作為血中血紅蛋白濃度的測定方法，常用氰化高鐵血紅蛋白法。在該方法中，在使鐵氰化鉀和氰化鉀的混合物作用于高鐵血紅蛋白而制成氰化高鐵血紅蛋白的基礎上，利用比色定量法測定。若使用本發(fā)明的還原劑，則作為替代該方法的方法，可測定血中等的高鐵血紅蛋白量或總血紅蛋白量。

高鐵血紅蛋白血癥是因高鐵血紅蛋白由于某種原因在體內(nèi)過量蓄積，導致使體內(nèi)成為缺氧狀態(tài)而發(fā)病的。作為對高鐵血紅蛋白血癥的治療方法，亞甲藍的靜脈注射被認為最有效。但是，在并發(fā)氰中毒的情況下由于會促進氰中毒而無法使用亞甲藍。作為其它治療方法，包括抗壞血酸的口服給藥、靜脈注射(也可與核黃素聯(lián)合給藥)，但所有方法均效果不大。本發(fā)明的還原劑能夠提供替代以往治療方法的新的治療策略。使用了本發(fā)明的還原劑的治療方法也可對無法使用亞甲藍的患者(并發(fā)氰中毒的人員等)應用。另外，亞甲藍對葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(g6pd)缺乏者無效。g6dp缺乏癥之類的可見戊糖磷酸途徑異常的患者對該方法不應答而必須接受緊急輸血。

g6dp缺乏癥是世界上最通常的損傷之一。美國黑人男性中實際上約10％患病。另外，確認非洲人和地中海沿岸居民中也有大量的患病者。因此，相當數(shù)量的受試者存在(氧化性)藥物誘發(fā)性高鐵血紅蛋白血癥的危險性。亞甲藍本身對這樣的患者給藥無效(由于他們的g6pd缺乏癥引起nadph不足的緣故)，甚至存在反效果的可能性。本發(fā)明的還原劑還可期待對此類患者的效果。

本發(fā)明的還原劑能夠發(fā)揮因心搏數(shù)、血壓、心搏出量異常所致的心臟負荷的減輕以及各組織代謝的亢進等藥理作用以及生理作用。含有本發(fā)明的還原劑的醫(yī)藥品例如可期待在各組織的需氧量高的生理條件下，例如劇烈的勞動、運動等環(huán)境下，作為改善生物體耐久力的耐久力改善劑的用途。此外，也可將本發(fā)明的醫(yī)藥品應用于心功能不全、心肌病、心肌炎、心肌梗塞、心包炎、心包心肌炎(perimyocarditis)、一過性缺血發(fā)作、冠狀動脈性心臟病、具有左-右脈分流的先天性異常(vitia)、法樂氏四聯(lián)癥/五聯(lián)癥、艾森門格綜合征、休克、末梢缺血、動脈阻塞性疾病(aod)、末梢aod(paod)、頸動脈狹窄、腎動脈狹窄、腦的微循環(huán)系統(tǒng)障礙(小動脈硬化)、腦內(nèi)出血、腦的靜脈血栓形成和顱內(nèi)靜脈竇血栓形成、血管發(fā)育不良、蛛網(wǎng)膜下腔出血、血管性癡呆、賓斯旺格(biswanger)病、動脈硬化性皮層下腦病、伴有栓塞的多發(fā)性皮質梗死、血管炎、糖尿病性視網(wǎng)膜病、由各種原因導致的貧血(anaemia)的預后(再生障礙性貧血、骨髓發(fā)育不良綜合征、真性紅細胞增多癥、巨幼紅細胞性貧血、缺鐵性貧血、腎性貧血、球形紅細胞癥(sphaerocytosis)、溶血性(haemolytic)貧血等)、地中海貧血(thalassaemia)、異常血紅蛋白病、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥、輸血疾病、rh(rhesus)不相容性、瘧疾、瓣膜成形(valvuloplasty)、急性出血后貧血、脾功能亢進綜合征、肺纖維化、氣腫、肺水腫(oedema)：ards、irds或復發(fā)性肺氣腫、熱灼傷、心絞痛、冬眠等缺血性疾病等，血液循環(huán)障礙、低氧癥或血氧減少狀態(tài)的預防或治療，或伴有這些病理乃至癥狀或由這些病理乃至癥狀所引起的疾病的預防或治療。

為了將氧供給至缺血組織而防止缺血性細胞損傷(并且保護組織免受再灌注障礙)，也可在缺血性事件發(fā)生前、發(fā)生過程中和/或發(fā)生后給予本發(fā)明的醫(yī)藥品。也可在給予本發(fā)明的醫(yī)藥品的同時給予血管活性氧運輸體(例如基于血紅蛋白的氧運輸體)。由于因例如外科脈管重建(例如經(jīng)皮冠狀動脈脈管重建)、移植、急性心肌梗死、血管成形術(經(jīng)皮冠狀動脈血管成形術等)所引起的急性缺血以及隨后的再灌注和釋放自由基的緣故，可將本發(fā)明的醫(yī)藥品和血管活性載體(基于血紅素蛋白的氧運輸體等)與氣態(tài)一氧化氮組合，或在應用氣態(tài)一氧化氮后對哺乳動物給予本發(fā)明的醫(yī)藥品和血管活性載體，從而發(fā)揮所期望的治療效果。通過本說明書中記載的方法所治療的哺乳動物在治療前可患有缺血性心臟病，也可患有急性缺血性病理(例如心肌梗塞、腦卒中或腎缺血)，亦或臟器(腦、心臟、腎臟、肝臟、胃腸道等)可顯示血管痙攣。

為了治療作為包括在循環(huán)系統(tǒng)的一部分或整體中通過的紅細胞流量降低、貧血和腦卒中的各種原因的結果所產(chǎn)生的脊椎動物內(nèi)低氧組織，也可使用本發(fā)明的醫(yī)藥品。另外，為了防止脊椎動物體內(nèi)組織缺氧的目的，也可預防性地使用本發(fā)明的醫(yī)藥品。進而，因治療或預防由部分動脈堵塞或微循環(huán)中的部分阻斷所產(chǎn)生的低氧癥的目的，也可應用本發(fā)明的醫(yī)藥品。就血紅蛋白的給藥而言，可參考美國專利申請第08/409,337號說明書。

本發(fā)明的醫(yī)藥品的給藥量、給藥期間無特殊限制?？筛鶕?jù)給藥形態(tài)、年齡、體重、癥狀等適宜選擇。

本發(fā)明的醫(yī)藥品的給藥對象無限制。作為給藥對象，除人以外，可列舉出人以外的哺乳動物(包括寵物動物、家畜、實驗動物。具體而言例如猴、小鼠、大鼠、豚鼠、倉鼠、猴、牛、豬、山羊、綿羊、馬、雞、羊、鯨、海豚、犬、貓等)。治療對象在本發(fā)明的醫(yī)藥品給藥前、給藥過程中和/或給藥后可以是正常血液量，也可以是血液量過多，亦或可以是血液量過少。

本發(fā)明的醫(yī)藥品的給藥方式無特殊限制。可通過經(jīng)口或非經(jīng)口中的任一給藥方法給藥。本說明書中使用的通過“非經(jīng)口”的給藥無特殊限定，例如可列舉出靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、動脈內(nèi)、骨髓腔內(nèi)、囊內(nèi)、眼窩內(nèi)、心臟內(nèi)、皮內(nèi)、腹腔內(nèi)、經(jīng)皮氣管內(nèi)、皮下、表皮下、關節(jié)內(nèi)、包膜內(nèi)、蛛網(wǎng)膜下、骨髓腔內(nèi)及胸骨內(nèi)注射以及注入。作為優(yōu)選的給藥方法，可采用靜脈內(nèi)注射。

作為適合經(jīng)口給藥的制劑的實例，例如可列舉出片劑、膠囊劑、散劑、微粒劑、顆粒劑、液體制劑和糖漿劑。作為適合非經(jīng)口給藥的制劑，例如可列舉出注射劑、栓劑、吸入劑、貼劑等。本發(fā)明的醫(yī)藥品可根據(jù)需要添加藥理學、制劑學上可容許的添加劑來制造。作為藥理學、制劑學上可容許的添加劑的實例，例如可列舉出賦形劑、崩解劑乃至崩解助劑、粘結劑、潤滑劑、包衣劑、色素、稀釋劑、基質、溶解劑乃至助溶劑、等張劑、ph調節(jié)劑、穩(wěn)定劑、拋射劑和粘合劑。

適合口服給藥或非口服給藥的制劑中可添加葡萄糖、乳糖、d-山梨醇、d-甘露醇、淀粉、高嶺土、木糖醇、糊精、玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、羥丙基纖維素或結晶纖維素等賦形劑；羧甲基纖維素、淀粉或羧甲基纖維素鈣等崩解劑或崩解助劑；羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮或明膠等粘結劑；輕質無水硅酸、合成硅酸鋁、硬脂酸、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂或滑石粉等潤滑劑；羥丙基甲基纖維素、白糖、聚乙二醇或氧化鈦等包衣劑；凡士林、液體石蠟、聚乙二醇、明膠、高嶺土、甘油、純化水或硬化油脂等基質；氟利昂、乙醚或壓縮氣體等拋射劑；聚丙烯酸鈉、聚乙烯醇、甲基纖維素、聚異丁烯、聚丁烯等粘合劑；棉布或塑料片等基布等的制劑用添加劑等。適合注射用的制劑中可添加注射用蒸餾水、生理鹽水、丙二醇等水性或能夠構成用時溶解型注射劑的溶解劑或助溶劑，葡萄糖、氯化鈉、d-甘露醇、甘油等等張劑；有機酸(衣康酸、琥珀酸、酒石酸、富馬酸、枸櫞酸、蘋果酸、己二酸、葡萄糖酸、焦磷酸、乳酸、α-酮戊二酸、植酸等)或這些有機酸的鹽、無機酸(碳酸等)或這些無機酸的鹽、酸性氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸等)、堿性氨基酸(精氨酸、賴氨酸、組氨酸等)等ph調節(jié)劑；利多卡因等鎮(zhèn)痛劑等添加劑。

本發(fā)明的醫(yī)藥品的典型作用對象之一是血紅蛋白，但這里的血紅蛋白無特殊限定?？梢允翘烊?未修飾)的血紅蛋白，通過基因操作修飾的血紅蛋白，通過分子內(nèi)或分子間交聯(lián)、聚合或化學基團(例如聚烯烴氧化物、聚乙二醇、超氧化物歧化酶、或其它加成物)的加成等化學反應修飾的血紅蛋白。本發(fā)明的醫(yī)藥品也可應用于上述血紅蛋白以外的血紅素蛋白。另外，還可應用于結構與上述血紅素蛋白類似的金屬卟啉絡合物。

3.還原劑的制造方法

本發(fā)明的還一方面提供本發(fā)明的還原劑的制造方法。在本發(fā)明的制造方法中進行以下步驟：將產(chǎn)生血紅素還原酶、優(yōu)選高鐵肌紅蛋白還原酶的桿菌屬微生物在產(chǎn)生該酶的條件下培養(yǎng)的步驟(步驟(1))，和從培養(yǎng)產(chǎn)物回收上述酶的步驟(步驟(2))。

作為步驟(1)的桿菌屬微生物，可使用選自枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、納豆菌、蘇云金芽孢桿菌、蕈狀芽胞桿菌中的任一種微生物。培養(yǎng)方法和培養(yǎng)條件只要是可產(chǎn)生目標酶的方法和條件，就無特殊限定。即，可在產(chǎn)生顯示血紅素還原活性的多肽的條件下，適宜設定適合培養(yǎng)所使用的微生物的方法、培養(yǎng)條件。以下，作為培養(yǎng)條件例示出培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度及培養(yǎng)時間。

作為培養(yǎng)基，采用所使用的微生物可生長的培養(yǎng)基。例如，可使用如下培養(yǎng)基：添加了阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、果糖、半乳糖、蔗糖、龍膽二糖、可溶性淀粉、甘油、糊精、糖漿、有機酸等碳源，進而添加了硫酸銨、碳酸銨、磷酸銨、乙酸銨；或者可使用如下培養(yǎng)基：添加了玉米麩粉、大豆粉、酪蛋白氨基酸、咖啡渣、棉籽油渣、蛋白胨、酵母提取物、玉米漿、酪蛋白水解物、麥糠、肉汁等氮源，進而添加了鉀鹽、鎂鹽、鈉鹽、磷酸鹽、錳鹽、鐵鹽、鋅鹽等無機鹽。為了促進所使用的微生物的生長，可在培養(yǎng)基中添加維生素、氨基酸等。培養(yǎng)基的ph調整至例如約3～8、優(yōu)選約5～7左右，培養(yǎng)溫度通常為約10～50℃、優(yōu)選約25～35℃左右，在需氧條件下培養(yǎng)1～15日、優(yōu)選3～7日左右。作為培養(yǎng)方法，例如可利用靜置培養(yǎng)、振蕩培養(yǎng)法、使用發(fā)酵罐的需氧深部培養(yǎng)法。

在以上條件下培養(yǎng)后，從培養(yǎng)產(chǎn)物回收目標酶(步驟(2))。代表性地在從培養(yǎng)產(chǎn)物收集菌體的操作(步驟(2-1))之后，制備菌體粉碎物(步驟(2-2))。菌體的收集可利用離心處理、過濾器過濾等。在使用固體培養(yǎng)基的情況等含有菌體以外的固體成分的情況下，可預先除去該固體成分。菌體粉碎物的制備可利用使用弗氏壓碎器(frenchpress)或戴諾磨(dyno-mill)的機械粉碎處理、超聲波處理、冷凍粉碎處理等。在之后進行的冷凍處理、干燥處理、凍干處理等之際發(fā)生菌體粉碎的情況下，也可不設置菌體粉碎專用的工序。所制備的菌體粉碎物可直接(即未實施特別的處理)或經(jīng)追加處理后用作本發(fā)明的還原劑。這里的“追加處理”的實例是濃縮(利用超濾膜的濃縮等)、純化(鹽析、各種色譜法等)、添加其它成分、稀釋及干燥。作為追加處理，也進行兩種以上的處理。最終的形態(tài)可以為液體狀，也可以為固體狀(包括粉體狀)。

實施例

為了找出改善食用肉色調的物質，以桿菌屬微生物為中心實施了篩選。以下從根據(jù)篩選的結果中示出涉及被期待高有用性的微生物株的實驗的結果。

1.枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、納豆菌、蘇云金芽孢桿菌、蕈狀芽胞桿菌的凍干粉末的制備

將10ml的如表1所示的液體培養(yǎng)基分注于試管中，于120℃下滅菌20分鐘。作為預培養(yǎng)，分別在上述試管中接種1接種環(huán)的枯草芽孢桿菌(bacillussubtilisjcm1465株(＝atcc6051株、iam12118株、ifo13719株))、解淀粉芽孢桿菌(bacillusamyloliquefaciensnbrc15535株(＝atcc23350株))、納豆菌(bacillusnatto)、蘇云金芽孢桿菌(bacillusthuringiensisnbrc13865株(＝atcc13366株))、蕈狀芽胞桿菌(bacillusmycoidesiam1190株(＝ifo3039株))，于30℃、300rpm下振蕩培養(yǎng)1晚。

[表1]

接著，將100ml的如表1所示的液體培養(yǎng)基分注于300ml三角燒瓶中，于120℃下滅菌20分鐘，作為主培養(yǎng)基。作為主培養(yǎng)，接種1ml的上述預培養(yǎng)液，于30℃、200rpm下振蕩培養(yǎng)一晚。將主培養(yǎng)液于5000rpm下離心分離5分鐘，得到菌體。將得到的菌體用30ml的20mm磷酸緩沖液(ph7.5)清洗1次，混懸于30ml的20mm磷酸緩沖液(ph7.5)中。將得到的混懸液于-40℃下冷凍24小時。接著，進行凍干(20℃、24小時)，得到凍干粉末(菌體通過凍干處理被粉碎)。

2.食用肉顯色試驗1

將0.1g的上述凍干粉末用50μl的0.5m磷酸緩沖液(ph5.5)溶解。接著，將上述粉末溶解液、50μl的4％(w/v)肌紅蛋白與2g的豬腿肉末混合，脫氣密封，于4℃下放置17小時。從視覺上觀察肉的紅色變化(顯色度)。作為對照試驗，對未添加粉末溶解液的試樣和將粉末溶解液煮沸處理10分鐘而得的試樣也進行同樣的試驗。將其結果示出于表2中。應予說明，將用粉狀畢赤酵母(pichiafarinoseiam12223株(＝ifo0465株、jcm1634株))的凍干粉末溶解液進行處理時的結果(僅未處理的數(shù)據(jù))也一并示出。

[表2]

++：強顯色，+：顯色，－：未顯色

如上所述，可見供試菌株(枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、納豆菌、蘇云金芽孢桿菌、蕈狀芽胞桿菌)的凍干粉末具有食用肉顯色效果?？莶菅挎邨U菌和納豆菌的效果特別高。應予說明，對于將培養(yǎng)后的菌體用弗氏細胞壓碎器粉碎得到的試樣，也確認了同樣的食用肉顯色效果(數(shù)據(jù)未示出)。

3.食用肉的顯色試驗2

將10mg的上述冷凍粉末(枯草芽孢桿菌的菌體粉碎物)用100μl的0.5m磷酸緩沖液(ph5.5)溶解。向該溶解液中添加10mg的豬腿肉末凍干粉末、30μl的4％(w/v)肌紅蛋白、30μl的0.2mnadh、400μl的滅菌水，于室溫下放置30分鐘。接著，將反應液于15000rpm下離心分離15分鐘，回收上清。使用分光光度計測定得到的上清在700nm至400nm波長下的吸收光譜。作為對照試驗，對于將粉末溶解液煮沸處理10分鐘而得的試樣，也進行同樣的試驗。將其結果示出于圖1中。由結果可知，未處理試樣在545nm和580nm有極大吸收，呈紅色。

4.食用肉顯色試驗3

根據(jù)如3.所示的方法，使用在1.中制備的各種凍干粉末進行食用肉顯色試驗。作為對照，對未添加粉末溶解液的試樣也進行同樣的試驗。將各種試樣在580nm波長下的吸光度示出于圖2中。可知經(jīng)試驗的所有試樣在5日后均比對照顯色強。

5.高鐵肌紅蛋白還原酶活性的測定方法

高鐵肌紅蛋白還原酶活性如下測定。首先，將在1.中制備的各種凍干粉末用水溶解成10mg/ml，制成酶溶液。接著向200μl的0.1m磷酸緩沖液(ph5.5)中添加100μl的0.1％(w/v)肌紅蛋白和150μl的酶溶液，于30℃下預孵育5分鐘。然后添加50μl的1mmnadh，測定5分鐘內(nèi)的406nm波長下的吸光度變化?；钚砸詥挝?u)表示。將在本條件下于1分鐘內(nèi)使相當于1μm的高鐵肌紅蛋白還原的酶量設為1u。應予說明，為了進行比較，對粉狀畢赤酵母(pichiafarinoseiam12223株(＝ifo0465株、jcm1634株))的凍干粉末也調查酶活性。

將測定結果示出于圖3中。顯示食用肉顯色效果的凍干粉末均顯示出高的高鐵肌紅蛋白還原酶活性。由該結果啟示，供試菌株(枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、納豆菌、蘇云金芽孢桿菌、蕈狀芽胞桿菌)產(chǎn)生高鐵肌紅蛋白還原酶，以及顯色效果是由該酶的作用產(chǎn)生的效果。

6.高鐵肌紅蛋白還原酶的純化

高鐵肌紅蛋白還原酶如下純化。將在1.中培養(yǎng)得到的枯草芽孢桿菌菌體用弗氏細胞壓碎器粉碎離心后，將上清用硫酸銨鹽析。在30％的飽和狀態(tài)下進行處理，取上清，在70％的飽和狀態(tài)下進行處理，離心后，回收沉淀物。使其溶于20mm的kpb(ph6.0)溶液中，將透析而得的成分作為硫酸銨鹽析試樣。

將5ml的得到的硫酸銨鹽析試樣提供給以下條件的deae色譜法(deae柱(hitraptmdeaeff(5ml)，gehealthcare))。其結果是，蛋白收率為45.4％。

擔體：deaehp(5ml)

進樣：硫酸銨鹽析試樣(5ml)

bufa：20mmkpb(ph6)

bufb：20mmkpb(ph6)，1mnacl

流速：5ml/分鐘

分級：5ml

程序：(1)bufa清洗8cv，(2)bufb10％清洗8cv，(3)bufb梯度30％/25cv，(4)bufb100％8cv

將通過上述deae色譜法得到的溶出圖和高鐵肌紅蛋白還原酶活性示出于圖4中。應予說明，就活性而言,確認作為高鐵肌紅蛋白的極大吸收的a406減少。jiang在圖4的組分中活性特別高的deaefr.no.61-63經(jīng)以下條件的羥基磷灰石色譜法(羥基磷灰石柱(1×5cm)(typel20μm，bio-rad))分別純化。通過羥基磷灰石色譜法得到的deaefr.no.61-63的蛋白收率為98.5％。

(羥基磷灰石色譜法條件)

擔體：羥基磷灰石(5ml)

進樣：deae純化fr.no.61-63

bufa：5mmkpb，0.3mnacl(ph6)

bufb：400mmkpb，0.3mnacl(ph6)

流速：1ml/分鐘

分級：4ml

程序：(1)bufa清洗7cv，(2)bufb梯度100％/20cv，(3)bufb100％10cv

將deaefr.no.61-63提供給羥基磷灰石色譜法而得到的溶出圖和高鐵肌紅蛋白還原酶活性示出于圖5中。將在圖5中比活性特別高的hyapafr.no.19用20mmkpb(ph6)透析后，提供給以下條件的凝膠過濾色譜法(凝膠過濾柱(superdextm75，gehealthcare))。

(凝膠過濾色譜法條件)

擔體：superdex200(120ml)

進樣：hyapafr.no.19

bufa：20mmkpb(ph6)

流速：1ml/min

分級：5ml

將hyapafr.no.19提供給凝膠過濾色譜法而得到的溶出圖和高鐵肌紅蛋白還原酶活性示出于圖6中。進而，將在圖6中比活性特別高的包括凝膠過濾fr.no.13-15的凝膠過濾fr.no.12-16提供給sds-page，確認條帶(圖7：凝膠過濾fr.no.12-16)。關于圖7的凝膠過濾fr.no.13-15，得到單條帶。

對于通過上述純化工序(deae色譜法、羥基磷灰石色譜法、凝膠過濾色譜法)得到的各種組分，將比活性示出于圖8中。deae.fr.no.61-63進行至凝膠過濾為止，比活性提高至約20.7倍。

7.高鐵肌紅蛋白還原酶的氨基酸序列的確定

對于通過圖7的sds-page得到的單條帶，轉印于pdvf膜上，用麗春紅試劑染色后，進行切出，用蛋白測序儀進行n末端氨基酸序列分析。結果發(fā)現(xiàn)n末端氨基酸序列為vvgdfpietdtlvig(序列號1)。進而，基于該氨基酸序列，從blast內(nèi)的枯草芽孢桿菌數(shù)據(jù)庫檢索該基因。結果發(fā)現(xiàn)與編碼二氫硫辛酰胺脫氫酶(dehydrolipoyldehydrogenase，以下記為dld)的pdhd(序列號2)具有100％的同源性。應予說明，將dld的氨基酸序列示出于序列號3。

8.利用dld的食用肉顯色試驗

對純化過的dld進行食用肉顯色試驗。使用純化過的dld的冷凍粉末試樣，如下制備食用肉試樣(表3)，于4℃下保存一晚后進行比較(圖9、圖10)

[表3]

在圖9中一并示出酶量不同的食用肉試樣(食用肉試樣1～4)。這樣可知dld有助于改善食用肉的色調。圖10是比較因nadh的有無導致的食用肉色調的圖(從左側起為無冷凍粉末(食用肉試樣1)、有nadh(食用肉試樣2)、無nadh(食用肉試樣5))。確認即使無nadh，也可充分顯色。認為是由于食用肉中含有足夠的nadh的緣故。

9.dld的酶學性質

使用與本酶具有高親和性的鐵氰化鉀作為底物，研究各種性質。首先確認dld的底物反應性。將酶添加量設定為15μl，使底物濃度(終濃度)達到0.025、0.05、0.075、0.1、0.15、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、1.0、1.25、1.5、1.75、2.0、2.5(mm)，在30秒鐘的測定時間下進行速率法分析(rateassay)(ph＝6.0)。鐵氰化鉀的摩爾吸光系數(shù)為1.02×10³(m^-1·cm^-1)，速率(v)的單位使用μm/分。將結果示出于圖11、圖12中。由圖11的底物飽和曲線上升來制作[s]/v～[s]標繪(圖12)，算出動力學參數(shù)(kineticparameter)(km＝0.19(mm)，vmax＝26.2(μm/分))。作為比較，將與鐵氰化鉀的親和性高的其它來源的黃遞酶(diapholase)的km值示出于表4中。由表4可知，由枯草芽孢桿菌得到的dld對鐵氰化鉀的親和性高于源自梭狀芽孢桿菌(c.kluyveri)的dld。

[表4]

如下測定dld的最適ph。使用將0.5m的各種ph緩沖液(枸櫞酸緩沖液(ph＝3.0～6.0)、磷酸鉀緩沖液(kpb)(ph＝6.0～8.0)、tris-鹽酸緩沖液(ph＝8.0～10.0))50μl稀釋10倍(50mm)而成的稀釋液、將4mm鐵氰化鉀溶液稀釋10倍(400μm)而成的稀釋液50μl、50μl的酶試樣、250μl的milliq水，于30℃下孵育5分鐘后，添加100μl的1mmnadh溶液，確認a420下的吸光度變化。將結果示出于圖13中。

接著，如下研究dld的ph穩(wěn)定性。將20μl的酶試樣、20mm的各種ph緩沖液(枸櫞酸緩沖液(ph＝3.0～6.0)、磷酸鉀緩沖液(kpb)(ph＝6.0～8.0)、tris-鹽酸緩沖液(ph＝8.0～10.0))180μl混合，放置30分鐘，使之反應，將得到的反應物作為ph處理試液。將150μl的如此得到的ph處理試液、100μl的0.5m枸櫞酸緩沖液(ph＝6.0)、100μl的milliq水混合，在冰中保存一晚。向350μl的如此得到的保存液中添加50μl的4mm鐵氰化鉀，于30℃孵育5分鐘后，添加100μl的1mmnadh溶液，每秒測定a420下的吸光度變化，測定30秒(應予說明，將未進行ph處理的試樣設為活性100％)。將結果示出于圖14中。雖然低ph側的穩(wěn)定性不足，但由于肉中的ph為ph5～6，所以認為即使在肉中也有足夠的活性。

如下測定dld的最適溫度。將50μl的0.5m枸櫞酸緩沖液(ph6)、50μl的2mm鐵氰化鉀、100μl的milliq水和100μl的1mmnadh混合，向于各種溫度下預孵育5分鐘而得到的混合物中添加200μl的酶試樣，測定5分鐘內(nèi)的a420下的吸光度變化，從而對反應進行確認。將結果示出于圖15中。由此可以確認最適溫度為40℃，于50℃下失活。

進而，對熱穩(wěn)定性進行如下測定。對預先將酶試樣于各種溫度(30℃、40℃、60℃)下處理30分鐘而得的處理物進行冰冷卻，制備處理試樣。向30μl的此處理試樣中加入50μl的0.5m枸櫞酸緩沖液(ph6.0)、50μl的2mm鐵氰化鉀和270μl的milliq水，于30℃孵育5分鐘后，添加100μl的1mmnadh溶液，每隔1秒測定30秒內(nèi)的a420下的吸光度變化。通過圖16的結果可以確認即使在60℃下仍有高的殘存活性。

接著，對與nadh和nadph的反應性進行比較。將50μl的0.5mkpb(ph5.5)、100μl的純化dld和100μl的0.1％mb混合后，用milliq水制成400μl，于30℃下預孵育5分鐘。然后，添加50μl的1mmnadh或nadph，監(jiān)測5分鐘內(nèi)的a406。在將nadh的相對活性設為100(％)的情況下的反應性如圖17所示?？芍猟ld相對于nadph的反應性低。

另外，驗證金屬鹽(金屬陽離子)對dld活性所造成的影響。將100μl的500mmkpb(ph5.5)、200μl的0.1％(＝13.4μm)mb、150μl的純化dld、10μl的100mm陽離子(cacl2、mgcl2、fecl3、sncl2、cuso4、fecl2、mnso4、cdcl2、zncl2、nacl、kcl、sds、edta)和100μl的1mmnadh，將向其中加入純化水至達到1ml而得的混合物作為試樣，求出相對活性。在ca⁺、mg²⁺和k⁺方面可見活性提高(圖18)。

10.dld的大量表達系統(tǒng)

由枯草芽孢桿菌取得dld基因，為了用大腸桿菌構建大量表達系統(tǒng)而進行研究。

10-1.由枯草芽孢桿菌7417株開始的基因組提取

由枯草芽孢桿菌7417株開始的基因組提取如下進行。將枯草芽孢桿菌7417株接種于含有0.5％蛋白胨、1.0％酵母提取物、1.0％葡萄糖的液體培養(yǎng)基(ph6.5)中，于30℃、300rpm下振蕩培養(yǎng)一晚。使用qiaquick^tmgelextractiontestkit(qiagen公司制造)來從得到的培養(yǎng)物進行基因組dna的提取。

10-2.基于pcr的dld基因的擴增

基于pcr的dld基因擴增如下進行。將5μl的10×緩沖液、4μl的dtnp、1μl的枯草芽孢桿菌基因組、各5μl的以下10μm引物(2種)、0.1μl的ex.taq(dna聚合酶，takarabio公司制造)混合，向其中加入純化水，制成50μl。應予說明，作為引物的組合，準備2種模式(模式1、模式2)。pcr反應通過2步進行。首先，作為步驟1，于98℃下進行30秒的熱變性。接著，作為步驟2，將下列循環(huán)(熱變性：98℃、10秒，退火：46℃、30秒，延伸反應：72℃、90秒)進行25次循環(huán)，得到pcr產(chǎn)物。

(引物的序列)

模式1

dld-nde1-fw：ggcgtaatcatatggtagtaggag(序列號4)

dld-bamh1-rv：gataggatccttattttacgatg(序列號5)

模式2

dld-ned1-fw：ggcgtaatcatatggtagtaggag(序列號6)

dld-bamh1-histag-rv：gataggatccttagtggtggtggtggtggtgttttacgatg(序列號7)

10-3.dld基因的ta克隆

接著，如下進行dld基因的ta克隆。向3μl的通過pcr得到的pcr產(chǎn)物中添加5μl的2×liation緩沖液、1μl的pgem-teasy載體、1μl的t4連接酶，于4℃下反應一晚后，將其全量添加于感受態(tài)細胞dh5α中，于42℃下實施30秒的熱休克，冰冷卻2分鐘。向其中添加150μl的soc培養(yǎng)基，于37℃下孵育20分鐘。進而，將全量用lb/amp培養(yǎng)板培養(yǎng)，得到菌落。

10-4.dld的轉化

接著，將dld如下克隆于載體。使用genelute^tm質粒小量提取試劑盒(genelute^tmplasmidminiprepkit，sigma公司制造)，對通過ta克隆而得到的培養(yǎng)物進行質粒提取。向得到的質粒提取物中添加10×緩沖液、ndei，于37℃下處理2小時。進而，向其中添加1μl的bamhi，于37℃下處理1小時，將得到的產(chǎn)物作為插入基因。另一方面，對于pet20b載體，也準備添加1μl的bamhi并于37℃下處理1小時而得的產(chǎn)物。為了確認基于his-標簽有無的dld酶活性，分別如下所示制備試樣(單位為μl)，于16℃下孵育30分鐘。然后，將全量添加于感受態(tài)細胞dh5α中，在冰上溶解1小時，對得到的產(chǎn)物實施熱休克(42℃，30秒)，添加soc培養(yǎng)基，于37℃孵育20分鐘，鋪板于lb/amp培養(yǎng)基上。

10-5.轉化體的酶活性測定

如下進行如上得到的轉化體的活性測定。取5個菌落的dld(+)his標簽/pet20b/bl21和4個菌落的dld(－)his標簽/pet20b/bl21，用lb/amp培養(yǎng)基于30℃下振蕩培養(yǎng)一晚(預培養(yǎng))。將60μl的此預培養(yǎng)液接種于3ml的lb/amp培養(yǎng)基，于37℃下振蕩培養(yǎng)一晚(主培養(yǎng))。一旦達到od600＝0.4～0.5，則加入iptg，使終濃度達到0.1mm，于30℃下振蕩培養(yǎng)4小時。收集如此得到的菌體，混懸于50mmtris-hcl(ph＝7.0)中。將其用多珠搖床(multi-beadsshocker，安井器械公司制造)粉碎離心后，將上清作為試樣。

如下進行酶反應(高鐵肌紅蛋白還原反應)。向50μl的通過上述方法得到的酶試樣中添加0.5mkpb緩沖液(ph＝5.5)、50μl的0.1％高鐵肌紅蛋白溶液，對其加入純化水至達到225μl。然后，加入25μl的1mmnadh溶液，開始反應，確認10分鐘內(nèi)的a406下的吸光度變化。同時，對于蛋白量，也通過bradford法進行定量。將結果示出于圖19、圖20中。

圖19是示出無his-標簽的轉化體的高鐵肌紅蛋白還原活性的圖，圖20是示出有his-標簽的轉化體的高鐵肌紅蛋白還原活性的圖。為了進行比較，對pet20b的空白載體、iptg載體數(shù)據(jù)也進行了表示。與空白載體相比，均顯示10倍以上的高鐵肌紅蛋白還原活性。另外，如將圖19和圖20進行比較可知，認為不受iptg的調控。

11.重組dld的食用肉顯色活性

將通過上述方法得到的重組dld用珠粉碎，在以下條件下用ni-sepharose柱純化，用20mmkpb(ph6)進行透析。以將其凍干而得的凍干物為試樣，進行食用肉顯色試驗1、食用肉顯色試驗2。

(色譜法條件)

擔體：nisepharose(25ml)

試樣：粉碎物上清約20ml

bindbuf：20mmkpb、0.3mnacl(ph6)

elutebuf：20mmkpb、0.3mnacl、0.4m咪唑(ph6)

流速：進樣：5ml/分鐘，其它：10ml/分鐘

分級：10ml

程序：(1)bindbuf清洗6cv，(2)elutebuf10％清洗10cv，(3)elutebuf100％/20cv梯度，(4)elutebuf清洗10cv

在食用肉顯色試驗1中，向2g的豬肉末中加入37.5μl的40mg/ml(4％)肌紅蛋白(sigma公司制造)、37.5μl的0.5mkpb(ph＝5.5)、37.5μl的20mmnadh、66mg的冷凍粉末品酶試樣，于4℃下反應一晚。另外，為了進行比較，制備不含冷凍粉末的試樣(陰性對照)。將結果示出于圖21中。左側為陰性對照，右側為含有冷凍粉末的食用肉。不僅通過目測，還根據(jù)圖像的rgb值驗證色調的變化，但可知食用肉的色調因重組dld而更加泛紅。

在食用肉顯色試驗2中，向2g的豬肉末中加入37.5μl的0.5mkpb(ph＝5.5)、37.5μl的40mg/ml(4％)肌紅蛋白(sigma公司制造)、37.5μl的20mmnadh、試樣((1)僅純化dld(60mg)、(2)僅食品添加劑級亞硝酸鈉(0.4％(w/w)＝8mg)、(3)純化dld+亞硝酸鈉((1)和(2))、(4)向(2)中加入葡萄糖酸鋅(15mg)而得的試樣、(5)無)，于4℃下反應一晚(圖22)。進而將，于65℃下對其進行85分鐘的熱處理而得的試樣示出于圖23中。對于上述圖22、圖23的試樣，不僅通過目測，還基于圖像的rgb值進行驗證。

以下對圖21中的無熱處理的食用肉色調進行說明。在加入了dld的試樣(試樣(1)和試樣(3))中可見良好的紅色色調。特別是加入了dld和亞硝酸鈉的試樣(3)的色調良好。加入了亞硝酸鈉和葡萄糖酸鋅的試樣(4)變?yōu)楹稚H加入了亞硝酸鈉的試樣(2)可見與無添加的試樣(5)同樣的色調。

以下對圖22中的熱處理后的食用肉色調進行說明。在加入了亞硝酸鈉的試樣(試樣(2)、試樣(3)、試樣(4))中可見良好的紅色色調(白桃色)。特別是加入了dld和亞硝酸鈉的試樣(3)，突出其紅色，顯示良好的色調?？梢妰H加入了dld的試樣(1)若與無添加的試樣(5)相比，則殘留紅色，但是若與試樣(2)～試樣(4)相比，則褐色大大加重。

12.食用肉顯色酶的純化

在源自枯草芽孢桿菌菌體的食用肉顯色酶中，對dld以外的食用肉顯色酶進行純化。純化工序以deae色譜的前半峰(圖4的deae.fr.no.27-35)為起始材料，進行苯基色譜法、羥基磷石灰色譜法、cu親和色譜法。

將10ml的deae前半部分(圖4的deae.fr.no.27-35)提供給以下條件的苯基色譜法(苯基柱(hitraptmphenylhp(5ml)，gehealthcare))。將通過上述苯基色譜法得到的溶出圖和高鐵肌紅蛋白還原酶活性示出于圖24中。在這些組分中，將活性特別高的phenyl.fr.no.26-31用5mmkpb(ph6)透析，提供給羥基磷石灰色譜法。

(苯基色譜法條件)

擔體：phenylhp(5ml)

試樣：deae前半fr.(100210)uf10ml

bufa：20mmkpb、30％飽和硫酸銨(ph6)

bufb：20mmkpb(ph6)

流速：5ml/分鐘

分級：5ml

程序：(1)bufa清洗5cv，(2)bufb梯度100％/20cv，(3)bufb100％清洗5cv

將通過上述苯基色譜法得到的phenyl.fr.no.26-31提供給以下條件的羥基磷石灰色譜法。將通過上述羥基磷石灰色譜法得到的溶出圖和高鐵肌紅蛋白還原酶活性示出于圖25中。

(羥基磷石灰色譜法條件)

擔體：羥基磷石灰(5ml)

進樣：苯基純化fr.no.26-31

bufa：5mmkpb、0.3mnacl(ph6)

bufb：400mmkpb、0.3mnacl(ph6)

流速：2ml/分鐘

分級：5ml

程序：(1)bufa清洗5cv，(2)bufb梯度100％/25cv，(3)bufb100％6cv

在通過上述羥基磷石灰色譜法得到的組分中，將活性特別高的hyapafr.no.16用20mmkpb、0.3mnacl(ph6)透析，提供給以下條件的cu親和色譜柱，進行cu親和色譜法。將通過cu親和色譜法得到的溶出圖和高鐵肌紅蛋白還原酶活性示出于圖26中。在通過cu親和色譜法得到的這些組分中，對活性特別高的cu.fr.no.10、13進行sds-page。將結果示出于圖27中。

(cu親和色譜法條件)

擔體：cu²⁺hp(1ml)

進樣：hyapa-fr.16

bufa：20mmkpb、0.3mnacl(ph6)

bufb：20mmkpb、0.3mnacl、0.4m咪唑(ph6)

流速：1ml/分鐘

分級：2ml

程序：(1)bufa清洗6cv，(2)bufb梯度10％/20cv，(3)bufb清洗10cv

圖27是對通過上述羥基磷石灰色譜法得到的hyapafr.no.13-17和通過cu親和色譜法得到的cu.fr.no.8-15進行sds-page而得的圖。其中，由于在通過cu親和色譜法得到的cu.fr.no.10中確認2個主條帶，所以當通過上述方法進行n末端氨基酸序列分析時，分子量大的蛋白質為mgntrkkvsvi(序列號8)，分子量小的蛋白質為mtntldvlka(序列號9)。當基于n末端氨基酸序列而進行分子量大的蛋白質的blast檢索時，顯示出與編碼蘋果酸脫氫酶(malatedehydrogenase：mdh)的mdh(序列號10)100％的同源性。另外，關于分子量小的蛋白質，顯示出與編碼推定nad(p)h硝基還原酶(putativenad(p)hnitroreductase：yodc)的yodc(序列號11)100％的同源性。應予說明，yodc的氨基酸序列如序列號12所示。對于cu.fr.no.13，由分子量推測與二氫硫辛酰胺脫氫酶相同。

16.食用肉顯色酶(mdh、yodc)的大量表達系統(tǒng)的構建

從枯草芽孢桿菌和納豆菌取得基因，構建mdh和yodc的大量表達系統(tǒng)。根據(jù)枯草芽孢桿菌和納豆菌的遺傳信息來制作引物，實施pcr，進行該基因的切出。將pet20b用于載體，將bl21(de3plyss)用于宿主，在各種酶的c末端加成6×his-標簽，使之表達。表達確認培養(yǎng)如下進行。取各種酶(mdh或yodc)(+)his標簽/pet20b/bl21的菌落，于30℃、300rpm下振蕩培養(yǎng)一晚(預培養(yǎng))。將2％當量的此預培養(yǎng)液接種于10ml的lb/amp培養(yǎng)基，一旦od達到約0.5～0.7，則加入iptg使終濃度達到0.5mm，于37℃、300rpm下振蕩培養(yǎng)4小時(主培養(yǎng))。收集如此得到的菌體，混懸于50mmtris-hcl(ph＝7.0)中。在將其用珠粉碎并離心后，將上清作為試樣。

對通過上述方法得到的試樣進行活性確認。向150μl的酶試樣中加入50μl的0.1％(w/w)高鐵肌紅蛋白、0.5mkpb(ph＝5.5)，向其中加入25μl的1mmnadh，開始反應，確認10分鐘內(nèi)的a406下的吸光度變化。根據(jù)圖28，雖然可對yodc確認活性，但無法對mdh確認活性。因此，為了確認有無表達，通過sds-page確認條帶(圖29)。mdh和yodc均可在該尺寸確認深色條帶。

17.純化過的食用肉顯色酶(mdh、yodc)的顯色試驗

將通過上述方法得到的重組yodc(枯草芽孢桿菌)和mdh(枯草芽孢桿菌)在下列條件下用ni-sepharose柱純化，用20mmkpb(ph6)透析。將透析過的試樣凍干，得到重組yodc和mdh的酶粉末。

(色譜法條件)

擔體：nisepharose(25ml)

試樣：粉碎物上清約20ml

bindbuf：20mmkpb、0.3mnacl(ph6)

elutebuf：20mmkpb、0.3mnacl、0.4m咪唑(ph6)

流速：進樣：5ml/分鐘，其它：10ml/分鐘

組分：10ml

程序：(1)bindbuf清洗6cv，(2)elutebuf10％清洗10cv，(3)elutebuf100％/20cv梯度，(4)elutebuf清洗10cv

使用得到的酶粉末，如下進行食用肉顯色試驗。在食用肉顯色試驗中，向2g的豬肉末中加入37.5μl的40mg/ml(4％)肌紅蛋白(sigma公司制造)、37.5μl的0.5mkpb(ph＝5.5)、37.5μl的20mmnadh、試樣((1)對照(無添加)、(2)yodc(16mg＝20u)、(3)經(jīng)煮沸的yodc、(4)mdh(16mg)、(5)經(jīng)煮沸的mdh)，于4℃下反應一晚。應予說明，為了通過熱處理(100℃、30分鐘)而確認失活，準備試樣(3)和試樣(5)。將結果示出于圖30中。雖然在yodc中可確認食用肉顯色效果，但對于mdh，完全未確認到食用肉顯色效果。

18.yodc的酶學性質研究

研究yodc的酶學性質。與dld同樣地調查最適ph(圖31)、ph穩(wěn)定性(圖32)、最適溫度(圖33)、熱穩(wěn)定性(圖34)、對nadph的反應性(圖35)、金屬鹽(金屬陽離子)對活性所造成的影響(圖36)。對于最適ph而言，由于與dld同樣地為ph6.0附近，所以認為在食用肉的應用方面沒有障礙。另外，在寬泛的ph條件下穩(wěn)定。即使考慮最適溫度，從在20℃附近的低溫條件下良好地發(fā)揮作用的方面出發(fā)，也可以說在食用肉的應用方面是優(yōu)選的。在熱穩(wěn)定性試驗中也可確認至40℃為止可維持活性。在輔酶特異性試驗中，與使用nadh的情況相比，在使用nadph的情況下可得到良好的活性。對于金屬陽離子而言，在加入mg、na或k的情況下可見酶活性的提高。此外，對底物反應性也進行驗證。在與dld相同條件下，對于對鐵氰化鉀的反應性以及對肌紅蛋白的反應性進行了調查。與dld的結果一并分別示出于圖37、圖38中。與dld相比，對鐵氰化鉀顯示約2.6倍的反應性，對肌紅蛋白顯示約22倍的反應性。

產(chǎn)業(yè)上的可利用性

本發(fā)明的還原劑作為食用肉或食用肉加工品的色調改善劑特別有用。根據(jù)本發(fā)明的還原劑，由于可不使用亞硝酸鹽等顯色劑而使食用肉顯色，所以使制造商品價值高的食用肉加工品成為可能。

本發(fā)明絲毫不受上述發(fā)明的實施方式和實施例的說明所限定。在不偏離專利請求范圍的記載且本領域技術人員可容易想到的范圍內(nèi)的各種變型方式也包含于本發(fā)明中。

對于本說明書中明示的論文、公開專利公報和專利公報等內(nèi)容，通過援引其全部內(nèi)容而進行引用。

序列表自由文本

序列號4：人工序列的說明：引物dld-nde1-fw

序列號5：人工序列的說明：引物dld-bamh1-rv

序列號6：人工序列的說明：引物dld-nde1-fw

序列號7：人工序列的說明：引物dld-bamh1-his標簽-rv