本發(fā)明屬于食品領(lǐng)域，特別涉及一種富含可溶性多酚以及黃酮苷元的番石榴葉及制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

番石榴葉作為一種藥食兩用的物質(zhì)，有著多年的使用歷史，具有抗氧化、抑制dna損傷，降血糖、抗炎、抑菌、降血壓，保護(hù)心臟等多種療效。不少研究表明番石榴葉中主要的生物活性功能成分包括多酚類物質(zhì)，這些活性物質(zhì)能夠消除由體內(nèi)過(guò)剩氧或者氮自由基引起的抗氧化防御系統(tǒng)受損引起的機(jī)體傷害。由于植物多酚類物質(zhì)主要以三種形式(自由態(tài)，共軛態(tài)以及綁定態(tài))存在于植物體內(nèi)，而綁定態(tài)多酚通常與植物細(xì)胞壁上的多糖，蛋白質(zhì)以化學(xué)鍵形式結(jié)合，很難被提取，造成番石榴葉多酚類活性物質(zhì)利用率低。

因此，有必要促進(jìn)番石榴葉的可溶性多酚和黃酮苷元的釋放，從而充分利用番石榴葉多酚類活性物質(zhì)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的首要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，提供一種富含可溶性多酚以及黃酮苷元的番石榴葉的制備方法。

本發(fā)明的另一目的在于提供通過(guò)上述制備方法得到的番石榴葉產(chǎn)品。

本發(fā)明的再一目的在于提供所述的番石榴葉產(chǎn)品的應(yīng)用。

本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：一種富含可溶性多酚以及黃酮苷元的番石榴葉的制備方法，包括如下步驟：

(1)將清洗干凈的番石榴葉瀝干、烘干、揉碎，將揉碎的番石榴葉過(guò)篩，去除番石榴葉莖干部位，獲得大小基本一致的番石榴葉部位；

(2)將步驟(1)最終得到的番石榴葉部位與水混合后，調(diào)節(jié)好ph值，再加入酶，進(jìn)行酶解反應(yīng)；

(3)將步驟(2)進(jìn)行酶解反應(yīng)后的體系烘干，得到富含可溶性多酚以及黃酮苷元的番石榴葉產(chǎn)品。

步驟(1)中所述的烘干的條件優(yōu)選為于50～80℃烘干至恒重；更優(yōu)選為于60℃烘干至恒重。

步驟(1)中所述的過(guò)篩優(yōu)先選過(guò)孔徑為4目的篩。

步驟(2)中所述的水的用量為將步驟(1)最終得到的番石榴葉分散為宜，以有利于進(jìn)行酶解反應(yīng)；優(yōu)選為相當(dāng)于步驟(1)最終得到的番石榴葉質(zhì)量的4倍。

步驟(2)中所述的ph值為4.5～6.0；優(yōu)選為5～5.5。

步驟(2)中所述的酶解反應(yīng)的溫度為45～55℃；優(yōu)選為50℃。

步驟(2)中所述的酶解反應(yīng)的時(shí)間優(yōu)選為按每一種酶反應(yīng)5～8h計(jì)；更優(yōu)選為每一種酶反應(yīng)6h計(jì)。

步驟(2)中所述的酶為纖維素酶、半纖維素酶、β-葡萄糖苷酶和木聚糖酶中的至少一種；優(yōu)選為纖維素酶、半纖維素酶和β-葡萄糖苷酶的組合使用。

所述的纖維素酶優(yōu)選為酶活力是8000u/g的纖維素酶。

所述的半纖維素酶優(yōu)選為酶活力是8000u/g的半纖維素酶。

所述的β-葡萄糖苷酶優(yōu)選為酶活力是8000u/g的β-葡萄糖苷酶。

所述的木聚糖酶優(yōu)選為酶活力是8000u/g的木聚糖酶。

所述的纖維素酶的質(zhì)量用量?jī)?yōu)選為相當(dāng)于番石榴葉部位質(zhì)量的0.5％。

所述的半纖維素酶的質(zhì)量用量?jī)?yōu)選為相當(dāng)于番石榴葉部位質(zhì)量的0.5％。

所述的β-葡萄糖苷酶的質(zhì)量用量?jī)?yōu)選為相當(dāng)于番石榴葉部位質(zhì)量的0.5％。

所述的木聚糖酶的質(zhì)量用量?jī)?yōu)選為相當(dāng)于番石榴葉部位質(zhì)量的0.5％。

所述的酶解反應(yīng)的具體過(guò)程優(yōu)選如步驟1)、2)或3)所示，最優(yōu)選為步驟1)：

1)先加入纖維素酶進(jìn)行第一次酶解，滅活纖維素酶；再加入半纖維素酶進(jìn)行第二次酶解，滅活半纖維素酶；最后加入β-葡萄糖苷酶進(jìn)行第三次酶解，滅活β-葡萄糖苷酶；

2)先加入半纖維素酶進(jìn)行第一次酶解，滅活半纖維素酶；再加入纖維素酶進(jìn)行第二次酶解，滅活纖維素酶；最后加入β-葡萄糖苷酶進(jìn)行第三次酶解，滅活β-葡萄糖苷酶；

3)先加入β-葡萄糖苷酶進(jìn)行第一次酶解，滅活β-葡萄糖苷酶；再加入纖維素酶進(jìn)行第二次酶解，滅活纖維素酶；最后加入半纖維素酶進(jìn)行第三次酶解，滅活半纖維素酶。

步驟1)、2)和3)中，

所述的第一次酶解、第二次酶解和第三次酶解的反應(yīng)條件分別優(yōu)選為于50℃反應(yīng)6h；

所述的滅活的條件優(yōu)選為80℃處理10min；

所述的纖維素酶的質(zhì)量用量?jī)?yōu)選為相當(dāng)于番石榴葉部位質(zhì)量的0.5％；

所述的半纖維素酶的質(zhì)量用量?jī)?yōu)選為相當(dāng)于番石榴葉部位質(zhì)量的0.5％；

所述的β-葡萄糖苷酶的質(zhì)量用量?jī)?yōu)選為相當(dāng)于番石榴葉部位質(zhì)量的0.5％。

步驟(3)中所述的烘干的溫度優(yōu)選為50～70℃；更優(yōu)選為60℃。

步驟(3)中所述的烘干的時(shí)間優(yōu)選至少12h；更優(yōu)選為16h。

一種富含可溶性多酚以及黃酮苷元的番石榴葉產(chǎn)品，通過(guò)上述制備方法得到。

所述的富含可溶性多酚以及黃酮苷元的番石榴葉產(chǎn)品在食品領(lǐng)域和/或保健品領(lǐng)域中進(jìn)行應(yīng)用；其可直接食用；也可進(jìn)一步加工成各類食品，如富含可溶性多酚及黃酮苷元的番石榴葉茶飲料、富含可溶性多酚及黃酮苷元的番石榴葉餅干，營(yíng)養(yǎng)餐條等。

本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果：

本發(fā)明提供的制備方法，是通過(guò)多種酶水解將番石榴葉中不易提取的，不可溶的綁定態(tài)多酚釋放，轉(zhuǎn)變?yōu)橐滋崛?，可溶性多酚；并將番石榴葉的大分子功能成分降解為吸收能力更強(qiáng)，功能活性更高的小分子槲皮素及山奈酚等苷元含量；而且酶解反應(yīng)時(shí)間短，條件溫和，效率高，可以用于藥用植物加工增效。該制備方法提升番石榴葉產(chǎn)品抗氧化能力，抑制dna損傷能力，降低血糖，膽固醇，預(yù)防心腦血管疾病等作用。

附圖說(shuō)明

圖1是不同實(shí)施例中番石榴葉總可溶性多酚與不可溶性多酚含量的測(cè)定結(jié)果圖。

圖2是不同實(shí)施例中番石榴葉總可溶性黃酮與不可溶性黃酮含量的測(cè)定結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。

實(shí)施例1

(1)番石榴葉基質(zhì)的制備：將清洗干凈的番石榴葉放入60℃烘箱烘干16h，揉碎過(guò)孔徑為4目的篩，過(guò)篩的番石榴葉即為酶促水解基質(zhì)；在酶促反應(yīng)基質(zhì)中加入水，水的用量(用檸檬酸調(diào)ph＝5.5)是總重量的80％；

(2)酶水解反應(yīng)：接著將纖維素酶(8000u/g，下同)和步驟(1)最終得到的番石榴葉混合均勻置于三角瓶中，在50℃水浴下，酶處理6h后，置于80℃烘箱10min(滅活纖維素酶)，冷卻至室溫；然后加入半纖維素酶(8000u/g，下同)，混合均勻，在50℃水浴下，酶解6h，置于80℃烘箱10min(滅活半纖維素酶)，冷卻至室溫；繼續(xù)再加入β-葡萄糖苷酶(8000u/g，下同)，混合均勻，在50℃水浴下，酶解6h，置于80℃烘箱10min(滅活β-葡萄糖苷酶)；其中，纖維素酶、半纖維素酶、β-葡萄糖苷酶的質(zhì)量用量分別是相當(dāng)于步驟(1)得到的過(guò)篩的番石榴葉(即酶促水解基質(zhì))質(zhì)量的0.5％。

(3)酶水解后番石榴葉產(chǎn)品處理：將多種酶水解后的番石榴葉置于烘箱60℃烘干16h，得到富含可溶性多酚與黃酮苷元的番石榴葉產(chǎn)品。

實(shí)施例2

(1)番石榴葉基質(zhì)的制備：基本與實(shí)施例1步驟(1)相同，區(qū)別在于，用檸檬酸調(diào)ph＝5.5。

(2)多酶水解反應(yīng)：接著將半纖維素酶和步驟(1)最終得到的番石榴葉混合均勻置于三角瓶中，在50℃水浴下，酶處理6h后，置于80℃烘箱10min(滅活半纖維素酶)，冷卻至室溫；然后加入纖維素酶，混合均勻，在50℃水浴下，酶解6h，置于80℃烘箱10min(滅活纖維素酶)，冷卻至室溫；繼續(xù)再加入β-葡萄糖苷酶，混合均勻，在50℃水浴下，酶解6h，置于80℃烘箱10min(滅活β-葡萄糖苷酶)；其中，半纖維素酶、纖維素酶、β-葡萄糖苷酶的質(zhì)量用量分別是相當(dāng)于步驟(1)得到的過(guò)篩的番石榴葉(即酶促水解基質(zhì))質(zhì)量的0.5％。

(3)酶水解后番石榴葉產(chǎn)品處理：將多種酶水解后的番石榴葉置于烘箱60℃烘干16h，得到富含可溶性多酚與黃酮苷元的番石榴葉產(chǎn)品。

實(shí)施例3

(1)番石榴葉基質(zhì)的制備：與實(shí)施例2步驟(1)相同。

(2)多種酶水解反應(yīng)：接著將木聚糖酶(8000u/g)和步驟(1)最終得到的番石榴葉混合均勻置于三角瓶中，在50℃水浴下，酶處理6h后，置于80℃烘箱10min(滅活木聚糖酶)，冷卻至室溫；然后加入纖維素酶，混合均勻，在50℃水浴下，酶解6h，置于80℃烘箱10min(滅活纖維素酶)，冷卻至室溫；繼續(xù)再加入半纖維素酶，混合均勻，在50℃水浴下，酶解6h，置于80℃烘箱10min(滅活半纖維素酶)；其中，木聚糖酶、纖維素酶、半纖維素酶的質(zhì)量用量分別是相當(dāng)于步驟(1)得到的過(guò)篩的番石榴葉(即酶促水解基質(zhì))質(zhì)量的0.5％。

(3)酶水解后番石榴葉產(chǎn)品處理：將多種酶水解后的番石榴葉置于烘箱60℃烘干16h，得到富含可溶性多酚與黃酮苷元的番石榴葉產(chǎn)品。

實(shí)施例4

(1)番石榴葉基質(zhì)的制備：與實(shí)施例2步驟(1)相同。

(2)多種酶水解反應(yīng)：接著將β-葡萄糖苷酶和步驟(1)最終得到的番石榴葉混合均勻置于三角瓶中，在50℃水浴下，酶處理6h后，置于80℃烘箱10min(滅活β-葡萄糖苷酶)，冷卻至室溫；然后加入纖維素酶，混合均勻，在50℃水浴下，酶解6h，置于80℃烘箱10min(滅活纖維素酶)，冷卻至室溫；繼續(xù)再加入半纖維素酶，混合均勻，在50℃水浴下，酶解6h，置于80℃烘箱10min(滅活半纖維素酶)；其中，β-葡萄糖苷酶、纖維素酶、半纖維素酶的質(zhì)量用量分別是相當(dāng)于步驟(1)得到的過(guò)篩的番石榴葉(即酶促水解基質(zhì))質(zhì)量的0.5％。

(3)酶水解后番石榴葉產(chǎn)品處理：將多種酶水解后的番石榴葉置于烘箱60℃烘干16h，得到富含可溶性多酚與黃酮苷元的番石榴葉產(chǎn)品。

效果實(shí)施例

一、檢測(cè)方法

將實(shí)施例1～4制備的番石榴葉產(chǎn)品以及未經(jīng)處理的番石榴葉用磨粉機(jī)粉碎，通過(guò)40目篩，用于如下成分的提取與檢測(cè)：

①可溶性多酚提?。悍謩e取1.0g實(shí)施例1～4制備的番石榴葉產(chǎn)品于50ml比色管中，加入25ml50％(v/v)甲醇溶液，在45℃水浴浸提1h后，用0.45μm濾紙過(guò)濾，濾液通過(guò)真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在37℃下，旋蒸30min，去除甲醇，獲得濃縮液，向濃縮液中加入40ml蒸餾水，然后加入10ml己烷脫脂，再用70ml乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，在35℃下，真空旋干，去除乙酸乙酯。最后加入5ml50％(v/v)甲醇溶解，即為可溶性多酚提取液。置于-20℃保存，用于多酚含量分析以及hplc定量分析。

②不可溶綁定態(tài)多酚提取：將步驟①中提取可溶性多酚后剩余的番石榴葉殘?jiān)尤?0ml蒸餾水去除有機(jī)溶劑，濾干，于60℃烘干至恒重，記錄殘?jiān)闹亓?。加?0ml4mnaoh溶液，室溫下提取4h，然后用濃鹽酸(濃度為37％)調(diào)整ph至2左右，加入70ml乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，在35℃下，真空旋干，去除乙酸乙酯，最后加入5ml50％甲醇溶解，即為不可溶綁定態(tài)多酚提取液。置于-20℃保存，用于多酚含量分析以及hplc定量分析。

③多酚含量的檢測(cè)：分別吸取100μl上述提取的可溶性多酚與不可溶性綁定態(tài)多酚提取液，稀釋至合適濃度。取1ml稀釋樣液或者沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)液(10-100μg/ml)，依次加入0.5ml福林酚試劑混勻，反應(yīng)3-8min，再加入1.5ml20％(w/v)na2co3溶液，加水定容至10ml，充分振蕩混勻，靜置30min。以空白試劑做對(duì)照，測(cè)定760nm下的吸光值。

④黃酮含量的的測(cè)定：分別吸取100μl上述提取的可溶性多酚與不可溶性綁定態(tài)多酚提取液，稀釋至合適濃度。取1ml稀釋樣液或者蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液(10-100μg/ml)，依次加入0.3ml5％(w/v)nano2溶液混勻，靜置5min。加入0.3ml10％(w/v)alcl3溶液混勻，靜置6min。再加入2ml4％(w/v)naoh溶液混勻，加70％(v/v)乙醇溶液定容至10ml，充分振蕩，靜置10min。以空白試劑做對(duì)照，測(cè)定510nm下的吸光值。

⑤黃酮苷元(槲皮素與山萘酚)檢測(cè)：分別吸取將上述提取的可溶性多酚與不可溶性綁定態(tài)多酚提取液用0.45μm濾紙過(guò)濾，取清液過(guò)0.22μm有機(jī)微孔濾膜，濾液進(jìn)行hplc分析。具體分析條件為：紫外檢測(cè)器(waters2998)的高效液相色譜系統(tǒng)(waters2695)，檢測(cè)波長(zhǎng)350nm，柱溫30℃，c18色譜柱。所用的流動(dòng)相為：a-0.1％(v/v)甲酸水溶液，b-乙腈溶液，流速為0.8ml/min，進(jìn)樣量10μl。檢測(cè)條件：梯度洗脫—0min、85％a+15％b，5min、85％a+15％b，10min、80％a+20％b，20min、65％a+35％b，30min、50％a+50％b，31min、20％a+80％b，40min、20％a+80％b，45min、85％a+15％b，50min、85％a+15％b(均為體積比)。分析時(shí)間為50min。

⑤抗氧化能力檢測(cè)：

a：dpph自由基清除能力

分別吸取100μl上述提取的可溶性多酚與不可溶性綁定態(tài)多酚提取液，稀釋至合適濃度。取100μl稀釋樣液或者維生素c標(biāo)準(zhǔn)液(5-30μg/ml)，加入400μldpph-甲醇試劑，于30℃，黑暗處?kù)o置30min。以水做陰性對(duì)照，vc作為陽(yáng)性對(duì)照，測(cè)定510nm下的吸光值。樣品的dpph自由基清除能力用vc表示，即每g番石榴葉樣品相當(dāng)于vc的mmol/l數(shù)。

b：abts⁺自由基清除能力

分別吸取100μl上述提取的可溶性多酚與不可溶性綁定態(tài)多酚提取液，稀釋至合適濃度。取50μl稀釋樣液或者維生素c標(biāo)準(zhǔn)液(5-30μg/ml)，加入400μlabts⁺(7mmabts與2.45mmk2s2o8以2:1體積比混合，黑暗靜置16h)試劑，于30℃，黑暗處?kù)o置30min。以水做陰性對(duì)照，vc作為陽(yáng)性對(duì)照，測(cè)定510nm下的吸光值。樣品的abts⁺自由基清除能力用vc表示，即每g番石榴葉樣品相當(dāng)于vc的mmol/l數(shù)。

⑥抗氧化能力檢測(cè)：

分別取上述2μl稀釋可溶性多酚與不可溶性綁定態(tài)多酚提取液樣液(2mg/ml)以及槲皮素標(biāo)準(zhǔn)液(2mg/ml)，加入5μlpmd18-t質(zhì)粒dna(200ng/μl)，10μlfenton試劑(50mmvc、80mmfecl3、以及30mmh2o2)，用移液槍混勻，在37℃下黑暗靜置30min。以pbs緩沖液做空白對(duì)照，槲皮素作為陽(yáng)性對(duì)照，然后將混合液加樣于1％瓊脂糖凝膠電泳，電泳后的dna膠于紫外條件下觀察，計(jì)算螺旋狀dna占總dna的比例。dna損傷抑制率計(jì)算公式如下：

二、檢測(cè)結(jié)果

結(jié)果如圖1和2所示，發(fā)現(xiàn)按照實(shí)施例1和2順序添加酶處理后的番石榴葉產(chǎn)品可溶性多酚含量均明顯增加，可溶性黃酮含量也明顯增加。而實(shí)施例1酶反應(yīng)順序按照纖維素酶、半纖維素酶和β-葡萄糖苷酶處理后番石榴葉可溶性多酚含量最高(實(shí)施例1處理過(guò)的番石榴葉相對(duì)于未處理組可溶性多酚含量提高94.74％，可溶性黃酮提高89.48％，而不可溶的綁定態(tài)多酚含量明顯降低。這說(shuō)明多種酶處理可以促進(jìn)番石榴葉可溶性多酚釋放)。而用實(shí)施例3順序添加木聚糖酶、纖維素酶、半纖維素酶多種酶后多酚釋放效率最差；然而按照實(shí)施例4先用β-葡萄糖苷酶處理，再用處理過(guò)的番石榴葉相對(duì)于未處理組獲得可溶性多酚效率較實(shí)施例1，2要差，但好于實(shí)施例3。

采用高效液相色譜法檢測(cè)黃酮苷元(槲皮素及山奈酚)含量。采用實(shí)施例1順序添加多種酶共同水解后，槲皮素及山奈酚的含量最高，分別為248.95mg/100gdm，11.35mg/100gdm，相對(duì)于未處理組，分別提高1.97倍，1.82倍。而實(shí)施例1、2多種酶處理后番石榴葉可溶性多酚提取液總抗氧化活性以及對(duì)dna損傷抑制作用明顯提高，其中實(shí)施例1經(jīng)過(guò)多種酶(0.5％纖維素酶，0.5％半纖維素酶，以及0.5％β-葡萄糖苷酶)處理后的番石榴葉生物活性最高。dpph、abts⁺自由基清除能力相當(dāng)于74.29mmolvc/gdm、77.41mmolvc/gdm。對(duì)dna損傷的抑制率達(dá)到了81.23％。而實(shí)施例3方法處理后的番石榴葉活性最低。檢測(cè)數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。

表1

上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。