本發(fā)明屬于活性物質(zhì)篩選技術(shù)領(lǐng)域，涉及n-3PUFA磷脂在改善慢性疲勞綜合征制品中的應(yīng)用，具體涉及海參磷脂和魷魚卵磷脂在預(yù)防、改善或治療慢性疲勞綜合征失調(diào)制品中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

慢性疲勞綜合征(chronic fatigue syndrome，CFS)，又稱為慢性疲勞免疫功能障礙綜合征，是亞健康狀態(tài)的一種特殊表現(xiàn)。以長(zhǎng)期嚴(yán)重的疲勞感(至少半年以上)為突出臨床表現(xiàn)，并伴有失眠、記憶力下降、骨豁肌疼痛及多種精神神經(jīng)癥狀，但無(wú)其他器質(zhì)性及精神性疾病為特征的一組復(fù)雜的功能紊亂證候群。國(guó)內(nèi)調(diào)查顯示CFS人群發(fā)病率約在0.007％～2.8%，大部分患者年齡在30～50歲。本病已經(jīng)被美國(guó)疾病控制與預(yù)防中心預(yù)測(cè)為21世紀(jì)影響人類健康的主要問(wèn)題之一，雖然沒有近期生命危險(xiǎn)，但是嚴(yán)重影響患者的身心健康，造成生活質(zhì)量下降，繼而影響社會(huì)生產(chǎn)力和勞動(dòng)力，占用醫(yī)療資源，因此已引起全社會(huì)的廣泛關(guān)注。

目前治療慢性疲勞綜合征的藥物的治療效果有限，且治標(biāo)不治本，還可能引起副作用，人們傾向于選擇服用具有預(yù)防、減緩或治療慢性疲勞綜合征的功能成分或功能食品來(lái)達(dá)到減緩運(yùn)動(dòng)失調(diào)的目的，因此開發(fā)安全有效的具有預(yù)防、減緩或治療慢性疲勞綜合征的功能成分成為迫切要求。

DHA和EPA是兩種常見的n-3系列不飽和脂肪酸，目前市場(chǎng)上的EPA/DHA產(chǎn)品主要為乙酯型和甘油酯型，而乙酯型EPA/DHA在人體中不僅消化和吸收比較困難，且可能存在安全隱患，因此甘油酯型EPA/DHA備受消費(fèi)者歡迎。近年有研究表明，存在于磷脂中的不飽和脂肪酸相對(duì)于甘油酯型不飽和脂肪酸，不僅氧化穩(wěn)定性更好，而且消化吸收速度更快，再加上磷脂本身具有改善脂肪代謝、增強(qiáng)免疫力等活性，因此富含EPA/DHA的磷脂可能成為代替甘油酯型EPA/DHA的新型脂質(zhì)保健產(chǎn)品。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種n-3PUFA磷脂在改善慢性疲勞綜合征制品中的應(yīng)用。具體從海參中提取EPA磷脂，從魷魚卵中提取DHA磷脂，并對(duì)EPA和DHA磷脂進(jìn)行各組分的具體制備，最后對(duì)各組分的EPA和DHA磷脂進(jìn)行抗疲勞試驗(yàn)驗(yàn)證。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采取的具體技術(shù)方案為：

n-3PUFA磷脂在改善慢性疲勞綜合征制品中的應(yīng)用。

進(jìn)一步的，所述的n-3PUFA磷脂包括EPA磷脂和DHA磷脂。

進(jìn)一步的，所述EPA磷脂為EPA磷脂酰膽堿（EPA-PC）、EPA磷脂酰乙醇胺（EPA-PE）、EPA磷脂酰絲氨酸（EPA-PS）、EPA磷脂酰肌醇（EPA-PI）的一種或多種混合。

進(jìn)一步的，所述DHA磷脂為DHA磷脂酰膽堿（DHA-PC）、DHA磷脂酰乙醇胺（DHA-PE）、DHA磷脂酰絲氨酸（DHA-PS）和DHA磷脂酰肌醇（DHA-PI）中的一種或多種混合。

進(jìn)一步的，所述EPA磷脂的制備方法包括以下步驟：

1）海參經(jīng)真空冷凍干燥粉碎后，制成粉末；

2）取海參干粉，在氯仿和甲醇的混合溶液中抽提過(guò)夜，過(guò)濾后，用氯化鉀溶液抽提，靜置分層，收集氯仿層，經(jīng)減壓濃縮得到海參脂質(zhì)粗提取物；

3）將硅膠經(jīng)活化裝柱后，用氯仿平衡硅膠柱 ；再將步驟 2）得到的海參脂質(zhì)粗提物用氯仿溶解后，緩慢倒入硅膠柱中，依次用氯仿、氯仿-甲醇混合液、丙酮和甲醇進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，洗脫液進(jìn)行薄層硅膠板層析 (TLC)，并用碘和Dittmer試劑顯色確認(rèn)后減壓濃縮去除殘留有機(jī)溶劑即得到海參磷脂；

其中，收集氯仿-甲醇的洗脫液為EPA磷脂酰乙醇胺（EPA -PE），收集甲醇的洗脫液為EPA磷脂酰膽堿（EPA-PC）；

4）將醋酸/醋酸鈉溶液緩沖液放入集熱式恒溫加熱磁力攪拌器中預(yù)熱，將 L-絲氨酸溶于其中，加入上述步驟3）中的EPA -PC，最后加入PLD，在 40 ℃下攪拌反應(yīng)，加入 HCl、滅活酶，反應(yīng)終止，用正己烷-異丙醇提取反應(yīng)產(chǎn)物，即得到EPA磷脂酰絲氨酸（EPA -PS）；

5）將步驟 2）中海參脂質(zhì)粗提取物，加入丙酮、三甲胺和乙酸酐，冷卻過(guò)濾后，用丙酮洗脫，得到EPA磷脂酰肌醇（EPA-PI）。

進(jìn)一步的，所述DHA磷脂的制備方法包括以下步驟：

1）魷魚卵經(jīng)真空冷凍干燥粉碎后，制成粉末；

2）取魷魚卵干粉，在氯仿和甲醇混合溶液中抽提過(guò)夜，過(guò)濾后，用氯化鉀溶液抽提，靜置分層，收集氯仿層，經(jīng)減壓濃縮得到魷魚卵脂質(zhì)粗提取物；

3）將硅膠經(jīng)活化裝柱后，用氯仿平衡硅膠柱 ；再將步驟 2）得到的魷魚卵的脂質(zhì)粗提物用氯仿溶解后，緩慢倒入硅膠柱中，依次用氯仿、氯仿-甲醇混合液、丙酮和甲醇進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，洗脫液進(jìn)行薄層硅膠板層析 (TLC)，并用碘和Dittmer試劑顯色確認(rèn)后減壓濃縮去除殘留有機(jī)溶劑即得到魷魚卵磷脂；

其中，收集氯仿-甲醇的洗脫液為DHA磷脂酰乙醇胺（DHA-PE），收集甲醇的洗脫液為DHA磷脂酰膽堿（DHA-PC）；

4）將醋酸/醋酸鈉溶液緩沖液放入集熱式恒溫加熱磁力攪拌器中預(yù)熱，將 L-絲氨酸溶于其中，加入上述步驟3）中的DHA-PC，最后加入PLD，在 40 ℃下攪拌反應(yīng)，加入 HCl，滅活酶，反應(yīng)終止，用正己烷-異丙醇提取反應(yīng)產(chǎn)物，即得到DHA磷脂酰絲氨酸（DHA-PS）；

5）將步驟 2）中魷魚卵脂質(zhì)粗提取物，加入丙酮、三甲胺和乙酸酐，冷卻過(guò)濾后，用丙酮洗脫，得到DHA磷脂酰肌醇（DHA-PI）。

進(jìn)一步的，所述的改善慢性疲勞綜合征制品為食品、飼料或藥品；其中，所述EPA或者是DHA磷脂的總添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.5%-2%。

本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明以海參為原料制備EPA磷脂，以魷魚卵為原料制備DHA磷脂，進(jìn)一步進(jìn)行組分分離和轉(zhuǎn)化，制得的PC、PE、PS和PI的純度均在90%以上。本發(fā)明通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了，制得的各個(gè)組分的EPA和DHA磷脂能夠極大地延長(zhǎng)了小鼠在疲勞儀中跑步時(shí)間，即EPA和DHA磷脂均能明顯改善慢性疲勞綜合征小鼠在中等強(qiáng)度下的疲勞耐受性，且PS效果最佳；說(shuō)明了EPA和DHA磷脂均能有效預(yù)防、改善或治療慢性疲勞綜合征。

附圖說(shuō)明

圖1為實(shí)施例3中EPA和DHA磷脂對(duì)小鼠在中等強(qiáng)度下跑步實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。

具體實(shí)施方式

以下采用具體實(shí)施例并結(jié)合附圖來(lái)詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明。

實(shí)施例1：海參EPA磷脂的制備

（1）將市售的北大西洋瓜參經(jīng)真空冷凍干燥粉碎后，磨成粉末（200目）。

第二步，取海參干粉 10kg，加入 100L 氯仿 / 甲醇 (2:1，v/v)，攪拌，過(guò)濾，用0.88%的氯化鉀溶液抽提，靜置分層，收集氯仿層，浸提 3 次，合并濃縮液，經(jīng)減壓濃縮得到海參或魷魚卵脂質(zhì)粗提取物；

第三步，稱取硅膠 200g，加入 5％的水，120℃下活化 4h，室溫冷卻。采用濕法裝柱，靜置待硅膠沉降完全后，用2倍柱體積氯仿進(jìn)行壓柱，使柱中的硅膠更加密實(shí)。取50g的海參或魷魚卵粗提取物樣品用盡量少氯仿溶解后，用滴管轉(zhuǎn)移該溶液，沿著層析柱內(nèi)壁均勻加入。先用氯仿適當(dāng)洗5個(gè)柱體積后，用氯仿-甲醇9:1的混合液洗2個(gè)柱體積，再用丙酮1個(gè)柱體積，最后用甲醇洗脫，收集洗脫液，洗脫液進(jìn)行薄層硅膠板層析 (TLC)，展開劑為氯仿 / 甲醇 / 水(80:15:1，v/v)，并用碘和Dittmer試劑顯色確認(rèn)后減壓濃縮去除殘留有機(jī)溶劑即得到海參脂質(zhì)提取物。其中，收集氯仿-甲醇的洗脫液為EPA -PE，收集甲醇的洗脫液為EPA -PC。

樣品鑒定采用 TLC 法，將硅膠板置于 110℃烘箱中活化 20min，點(diǎn)樣后以氯仿 / 甲醇 / 水 (80:15:1，v/v) 為展開劑展開，展開完畢后，吹干，將顯色劑 (10％硫酸 - 乙醇溶液 ) 均勻噴灑于已干燥的薄層板上，并置于110℃烘箱 5min，直至 TLC 板上呈現(xiàn)出紫色斑點(diǎn)。

第四步，將200ml的緩沖液（20 mM 醋酸/醋酸鈉溶液，含50 mM CaCl2）放入集熱式恒溫加熱磁力攪拌器中預(yù)熱，將 20g的L-絲氨酸溶于其中，加入10g步驟三中的EPA-PC，最后加入3g的40 U/mL 磷脂酶D，在 40 ℃下攪拌反應(yīng)，反應(yīng)6h后，加入適量的HCl，滅活酶，反應(yīng)終止，用正己烷：異丙醇（4:1，v/v）提取反應(yīng)產(chǎn)物，即EPA -PS。

第五步，將 10 克步驟二中的海參或魷魚卵脂質(zhì)粗提取物加入 100毫升丙酮、0.1 毫升三甲胺和2克乙酸酐，40℃攪拌反應(yīng)2小時(shí)，冷卻過(guò)濾，80 毫升丙酮分三次洗滌后，用旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)的方式干燥即得到產(chǎn)品，其產(chǎn)品即為EPA -PI。

實(shí)施例2：魷魚卵DHA磷脂的制備

（1）將市售的烏賊卵經(jīng)真空冷凍干燥粉碎后，磨成粉末（200目）。

第二步，取魷魚卵干粉 10kg，加入 100L 氯仿 / 甲醇 (2:1，v/v)，攪拌，過(guò)濾，用0.88%的氯化鉀溶液抽提，靜置分層，收集氯仿層，浸提 3 次，合并濃縮液，經(jīng)減壓濃縮得到魷魚卵脂質(zhì)粗提取物；

第三步，稱取硅膠 200g，加入 5％的水，120℃下活化 4h，室溫冷卻。采用濕法裝柱，靜置待硅膠沉降完全后，用2倍柱體積氯仿進(jìn)行壓柱，使柱中的硅膠更加密實(shí)。取50g的魷魚卵粗提取物樣品用盡量少氯仿溶解后，用滴管轉(zhuǎn)移該溶液，沿著層析柱內(nèi)壁均勻加入。先用氯仿適當(dāng)洗5個(gè)柱體積后，用氯仿-甲醇9:1的混合液洗2個(gè)柱體積，再用丙酮1個(gè)柱體積，最后用甲醇洗脫，收集洗脫液，洗脫液進(jìn)行薄層硅膠板層析 (TLC)，展開劑為氯仿 / 甲醇 / 水(80:15:1，v/v)，并用碘和Dittmer試劑顯色確認(rèn)后減壓濃縮去除殘留有機(jī)溶劑即得到海參脂質(zhì)提取物。其中，收集氯仿-甲醇的洗脫液為DHA-PE，收集甲醇的洗脫液為DHA-PC。

樣品鑒定采用 TLC 法，將硅膠板置于 110℃烘箱中活化 20min，點(diǎn)樣后以氯仿 / 甲醇 / 水 (80:15:1，v/v) 為展開劑展開，展開完畢后，吹干，將顯色劑 (10％硫酸 - 乙醇溶液 ) 均勻噴灑于已干燥的薄層板上，并置于110℃烘箱 5min，直至 TLC 板上呈現(xiàn)出紫色斑點(diǎn)。

第四步，將200ml的緩沖液（20 mM 醋酸/醋酸鈉溶液，含50 mM CaCl2）放入集熱式恒溫加熱磁力攪拌器中預(yù)熱，將 20g的L-絲氨酸溶于其中，加入10g步驟三中的DHA-PC，最后加入3g的40 U/mL 磷脂酶D，在 40 ℃下攪拌反應(yīng)，反應(yīng)6h后，加入適量的HCl，滅活酶，反應(yīng)終止，用正己烷：異丙醇（4:1，v/v）提取反應(yīng)產(chǎn)物，即DHA-PS。

第五步，將 10 克步驟二中的魷魚卵脂質(zhì)粗提取物加入 100毫升丙酮、0.1 毫升三甲胺和2克乙酸酐，40℃攪拌反應(yīng)2小時(shí)，冷卻過(guò)濾，80 毫升丙酮分三次洗滌后，用旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)的方式干燥即得到產(chǎn)品，其產(chǎn)品即為DHA-PI。

實(shí)施例3：動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

1.材料和方法

（1）動(dòng)物喂養(yǎng)和行為學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采用 Balb/c小鼠，雄性，體重 22±0.5g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。動(dòng)物房濕度65±15%，室溫23±2℃，12:12 h明暗交替，小鼠可自由攝食和飲水。小鼠在適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，將小鼠按體重分為 10 組 ：正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、DHA-PC、DHA-PE、DHA-PS、DHA-PI以及EPA-PC、EPA-PE、EPA-PS、EPA-PI組，每組 8 只，分別喂食相應(yīng)的飼料。飼料參照 AIN-93G 嚙齒動(dòng)物飼料配方并加以改良，實(shí)驗(yàn)組添加 0.5％的DHA+EPA，每日記錄和統(tǒng)計(jì)攝食量，每隔一天稱量記錄體重變化，連續(xù)喂養(yǎng)3周。每隔一天強(qiáng)迫小鼠在YLS- 10B 轉(zhuǎn)輪式疲勞儀中在條件( 25 r /min，3s，1.5 mA 難度中)下連續(xù)跑步2 h，在最后一次時(shí)記錄小鼠在YLS- 10B轉(zhuǎn)輪式疲勞儀中的跑步到力竭的時(shí)間，并摘眼球取血，處死小鼠。力竭判斷的標(biāo)準(zhǔn)：當(dāng)小鼠在長(zhǎng)時(shí)間電擊后休息時(shí)間30s，5min內(nèi)連續(xù)休息5次，判斷為力竭狀態(tài)。

（2）統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以`x ± SEM表示，采用 SPSS 18.0 軟件進(jìn)行 Student’s t test and Tukey’s test 分析， 以 P ＜ 0.05 為有顯著差異。

1.實(shí)驗(yàn)結(jié)果

海參和魷魚卵磷脂對(duì)小鼠在中等強(qiáng)度下的跑步時(shí)間如圖1所示，模型組相對(duì)于正常對(duì)照組而言，各種形式的EPA和DHA磷脂干預(yù)后，與模型組相比，小鼠在疲勞儀中跑步時(shí)間明顯的延長(zhǎng)了，這提示各種形式的EPA和DHA磷脂均能明顯的改善慢性疲勞綜合征小鼠在中等強(qiáng)度下的疲勞耐受性，進(jìn)一步提示了各種形式的EPA和DHA磷脂均能預(yù)防、改善或治療慢性疲勞綜合征，對(duì)預(yù)防、改善或治療慢性疲勞綜合征具有顯著的效果。