本發(fā)明涉及，特指一種以大米胚芽為主要原料、采用分步酶解、超聲輔助酶解、高壓均質(zhì)處理制備功能多肽的方法及其作為傳統(tǒng)肉制品高溝捆蹄食源性蛋白抗氧化肽添加劑的應(yīng)用，屬于肉制品添加劑開發(fā)應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：谷物(小麥、玉米、大米)胚芽是谷物生長發(fā)育的基礎(chǔ)，有著極高的營養(yǎng)價(jià)值。如大米的主要營養(yǎng)在其胚芽上，胚芽含有豐富的蛋白質(zhì)和其它營養(yǎng)成分。胚芽在一粒大米中按重量只占3％，但其營養(yǎng)卻占一粒米的50％，被譽(yù)為“天賜營養(yǎng)源”。胚芽含有豐富的蛋白質(zhì)和淀粉、膳食纖維、多種維生素及生物活性物質(zhì)，含微量元素鈣、鐵、鋅、硒等。大米胚芽中蛋白質(zhì)和脂類含量均在20％以上，脂類中天然維生素E為200mg/100g-300mg/100g，脂類中脂肪酸70％以上是不飽和脂肪酸，并含有豐富的維生素和礦物質(zhì)。大米胚芽因?yàn)楹休^多脂肪,因此常常用來制取米胚芽油。大米胚芽主要由清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白組成，各種分離蛋白具有不同的加工和功能性質(zhì)。玉米胚芽作為玉米籽粒生長發(fā)育的起點(diǎn)，是生命的源泉。玉米胚芽雖僅占玉米籽粒重量的10％～15％，但營養(yǎng)價(jià)值卻極為豐富，集中了玉米籽粒中80％以上的脂肪和無機(jī)鹽，60％的糖類以及20％的優(yōu)質(zhì)蛋白，并含有磷脂、谷固醇等其他營養(yǎng)成分。玉米胚芽還是一種優(yōu)質(zhì)的蛋白資源，其蛋白含量平均在24.3％以上，僅次于黃豆和青豆等高蛋白植物種子，其組成以白蛋白和球蛋白為主，各占30％左右，此外還有25％左右的谷蛋白和5％的醇溶蛋白。麥胚中蛋白質(zhì)含量高達(dá)30％以上，含有人體必需的8種氨基酸，特別是賴氨酸的含量占18.5％，可以補(bǔ)充嬰童成長發(fā)育所需氨基酸。麥胚含有豐富的多種維生素，維生素B1的含量是雞蛋的57倍，維生素B2的含量是雞蛋的2倍，維生素E的含量更是高達(dá)34.9mg/100g，營養(yǎng)學(xué)家稱它是天然維生素E的寶庫，具有增強(qiáng)腦細(xì)胞活力的作用，促進(jìn)嬰童大腦發(fā)育。國內(nèi)已有有關(guān)上述幾種谷物胚芽的加工工藝的專利或研究，針對大米胚芽的研究，一種大米胚芽蛋白的提取方法(申請?zhí)?01510104665)，公開了一種大米胚芽蛋白的提取方法，包括如下步驟：(1)稱取脫脂試樣，加水溶解后，在水浴鍋中預(yù)熱，放入恒溫磁力攪拌器中震蕩，使蛋白質(zhì)溶于樣液中，4000r/min離心20分鐘，收集上清液，即為清蛋白；(2)取上述經(jīng)水提取的殘留物，加入6％的氯化鈉溶液，充分溶解后，按同樣方法收集上清液，即為球蛋白；(3)再將殘留物加入70％的乙醇溶液，溶解，收集上清液，即為醇溶性蛋白；(4)將剩余沉淀加入0.4％的氫氧化鈉，充分溶解，以同樣方法制得谷蛋白。針對玉米胚芽的研究，如專利一種可吸型玉米胚芽抗氧化肽龜苓膏的加工工藝(申請?zhí)?01310217224)，該專利中公開了可吸型玉米胚芽抗氧化肽龜苓膏的制備方法，包括玉米胚芽抗氧化肽粉6～10份，龜苓膏粉劑70～85份混合，加入100～120份冰水混合，攪拌至糊狀，加入1000～1200份40℃溫水，加熱到90℃，熬至膏體，殺菌灌裝，冷卻封裝后即為玉米胚芽抗氧化肽龜苓膏成品，其中玉米胚芽抗氧化肽粉是采用2709堿性蛋白酶，在pH9～11、酶與底物濃度比8％～12％、底物濃度2％～4％、酶解溫度50℃～60℃的條件下對玉米胚芽蛋白進(jìn)行酶解，再經(jīng)超濾、冷凍干燥得到的玉米胚芽抗氧化肽粉。專利“小麥胚芽蛋白及其衍生產(chǎn)品的聯(lián)合制備方法(申請?zhí)?00710078256)”，以干燥小麥胚芽為原料，經(jīng)過脫脂、溶劑提取、分離、酶水解等工藝，制備出小麥胚芽醇溶蛋白、小麥胚芽抗氧化、抗衰老液、水解小麥胚芽肽濃縮液及粉、小麥胚芽蛋白飼料添加劑等多種產(chǎn)品，還能對生產(chǎn)過程中使用的脫色劑、乙醇或甲醇溶劑均可再生利用。綜上所述，大米胚芽、玉米胚芽和小麥胚芽等谷物胚芽具有較高的營養(yǎng)價(jià)值，且其酶解產(chǎn)物具有極強(qiáng)的抗氧化活性，但是未見其作為肉制品添加劑的應(yīng)用報(bào)道。高溝捆蹄是江蘇省淮安市漣水縣高溝鎮(zhèn)特產(chǎn)，具有色澤醬紅、鮮味濃郁、松軟可口、咸甜適中、葷而不膩等特點(diǎn)，食時細(xì)嚼慢品，回味無窮，稱得上三餐美味、四時佳肴，是宴席和饋贈親朋的上乘佳品。如今，高溝捆蹄暢銷江蘇省各市縣，還遠(yuǎn)銷上海、北京、廣州等地。高溝捆蹄以其優(yōu)質(zhì)的品質(zhì)，先后獲得國際巴拿馬食品博覽會優(yōu)質(zhì)產(chǎn)品獎、中國首屆食品博覽會銀獎、全國優(yōu)質(zhì)保健產(chǎn)品“金鶴杯”等榮。曾遠(yuǎn)銷日本，韓國及東南亞許多國家和地區(qū)，被譽(yù)為“中國火腿王”。據(jù)統(tǒng)計(jì)江蘇省漣水縣高溝鎮(zhèn)有捆蹄類企業(yè)上百家，年產(chǎn)量1500噸，銷售額上億元。高溝捆蹄中富含蛋白質(zhì)、脂肪、各種維生素及微量元素。高溝捆蹄在生產(chǎn)和貯存期間，其中的各種營養(yǎng)成分會發(fā)生各種化學(xué)變化。如脂肪在熱、光或金屬離子催化劑的作用下會發(fā)生脂肪氧化，產(chǎn)生一系列的過氧化物引起產(chǎn)品的變質(zhì)。日常生產(chǎn)過程中，常常添加丁基羥基茴香醚(BHA)，二丁基羥基甲苯(BHT)等化學(xué)抗氧化劑來抑制脂肪氧化，但是隨著人們對食品安全性要求的提高，化學(xué)抗氧化劑安全性問題日益受到人們的重視，而天然植物提取物抗氧化劑比化學(xué)抗氧化劑更能滿足消費(fèi)者的需求，但是目前天然植物提取物抗氧化劑應(yīng)用還未得到全面推廣，其應(yīng)用于肉制品中，存在分布不均、影響產(chǎn)品風(fēng)味、價(jià)格較高等缺點(diǎn)。近些年來，抗氧化活性的蛋白來源的功能多肽越來越受到人們的關(guān)注，由于抗氧化肽不僅具備抗氧化活性，而且可以提供人體需求的營養(yǎng)元素氨基酸，在肉制品體系中加入天然來源的抗氧化肽來抑制油脂的脂質(zhì)氧化更符合現(xiàn)代人們對食品安全營養(yǎng)性的要求。上述現(xiàn)有技術(shù)中存在以下不足之處：第一，多肽制備工藝步驟繁瑣，無論是研究較多的麥胚，還是研究較少的大米胚芽，都采用復(fù)雜的工藝進(jìn)行了加工，基本都是先制備谷物胚芽油，然后就剩下的餅粕，分步提取蛋白，或者提取蛋白以后再酶解制備功能多肽，工藝步驟復(fù)雜，不適宜于工藝化生產(chǎn)，且由于分步處理，產(chǎn)品得率低，因此對于胚芽的利用率極低！第二，新鮮的谷物胚芽顆粒經(jīng)過一定的處理達(dá)到滅酶除濕的目的，才能便于儲藏。但由于胚芽生我國處理方法使用明火加熱，明火能夠很好地保持食品的特有風(fēng)味物質(zhì)，但會造成環(huán)境污染，且熱利用效率低下；同時，采用明火加熱需要有專人管，生產(chǎn)效率低，不適用于大規(guī)模生產(chǎn)。第三，現(xiàn)有酶解法制備蛋白或者多肽的過程中，由于大米胚芽等谷物胚芽含有油脂、淀粉、纖維素等多種成分，使得其蛋白不易被蛋白酶酶解，進(jìn)而使得酶解蛋白的水解度較低，產(chǎn)物得率很低，難以進(jìn)一步加工利用。第四：現(xiàn)有的肉制品加工中也有嘗試添加抗氧化肽進(jìn)行抑制脂質(zhì)氧化作用的研究，但是都是將新鮮肉加工肉糜以后再添加抗氧化肽，肉糜與抗氧化肽的接觸面積增大，混合更加均勻，便于發(fā)揮抗氧化肽的效果，而高溝捆蹄加工過程中，是需要直接使用整塊的豬后腿肉，經(jīng)過腌制，捆扎后蒸煮后變成成品，因此添加抗氧化肽后，能否充分發(fā)揮其抗氧化效果還未知。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為解決上述問題，該發(fā)明主要是通過物理穩(wěn)定化處理、色選機(jī)篩選、超微粉碎、多步酶解、超聲輔助酶解等技術(shù)手段制備大米胚芽為主的復(fù)合酶解物，并將其添加在傳統(tǒng)食品高溝捆蹄中，研究其在肉制品中的抗氧化效果及對捆蹄產(chǎn)品風(fēng)味的影響。本發(fā)明大米胚芽復(fù)合酶解物，是由以下重量份數(shù)的原料制備而成：大米胚芽：10～20份玉米胚芽：5～10份；小麥胚芽：5～10份。優(yōu)選由以下重量份數(shù)的原料制備而成：大米胚芽：20份。玉米胚芽：10份；小麥胚芽：10份。其中所述的大米胚芽酶解復(fù)合物，按照下述步驟進(jìn)行制備得到：(1)胚芽穩(wěn)定化處理；按照上述比例將大米胚芽、小麥胚芽和玉米胚芽混合，采取微波干燥，經(jīng)過處理后胚芽的含水量小于5％；(2)色選機(jī)篩選；將干燥過的胚芽放入色選機(jī)中，清除率大于99％；(3)超微粉碎：將干燥過的胚芽利用機(jī)械剪切式超微粉碎使之破碎，從而將胚芽顆粒粉碎至小于25微米的粉體；粉碎時間為20～40分鐘；(4)超聲輔助纖維素酶酶解：按質(zhì)量比為1:5-10的比例將粉碎的胚芽與水混合成懸浮液，加熱至55℃，調(diào)節(jié)pH至6.0，采用纖維素酶在55℃條件下酶解120-240min，加酶量按照酶的酶活與底物的質(zhì)量比為1000-1200u/g；；酶解的同時進(jìn)行掃頻模式超聲處理，超聲時間與酶解時間相同；其中步驟(4)中所述的雙頻掃頻超聲工作時固定上下板間距為10cm，掃頻周期300s，間歇比2:1(超聲10s，間歇5s)，上下每塊振板功率為600W。其中步驟(4)中所述的雙頻頻率組合為：68kHz/22kHz、68kHz/28kHz、40kHz/33kHz、33kHz/28kHz；最優(yōu)選佳頻率組合為40kHz/33kHz。(5)多模式超聲輔助蛋白酶酶解：調(diào)節(jié)pH到7.0，降溫至40～50℃，再按照2000u/g加入步驟(1)的中性蛋白酶，迅速進(jìn)行多頻模式超聲處理，酶解時間120～240min。其中所述的多頻超聲模式為：三頻或者雙頻順序超聲處理，超聲功率密度60～200W/L；超聲脈沖工作時間10s；脈沖間歇時間3s。三頻或者雙頻順序超聲處理的超聲波頻率組合為：28/35kHz、28/35/40kHz或者28/40kHz。(6)風(fēng)味蛋白酶酶解：調(diào)節(jié)pH到6.0，降溫至45℃，再按照1200-2000u/g加入風(fēng)味蛋白酶，進(jìn)行酶解，酶解時間90～120min。(7)酶解反應(yīng)結(jié)束后，將酶解液迅速升溫至75℃并保持30分鐘，然后降溫至55℃，并加入按照胚芽與麥芽糊精為1:1的質(zhì)量比加入麥芽糊精攪拌均勻，通過高壓均質(zhì)機(jī)進(jìn)行均質(zhì)三次，每次的壓力分別為50兆帕，40兆帕，50兆帕，均質(zhì)時間分別為15min，20min，10min最后進(jìn)行噴霧干燥，噴霧干燥的工藝條件為：進(jìn)風(fēng)口溫度160～200℃，出風(fēng)口溫度為70～100℃，得大米胚芽酶解物產(chǎn)品。一種添加了上述大米酶解物作為抗氧化劑的高溝捆蹄的制作方法，按照下述步驟進(jìn)行：(1)原料肉的選擇：選擇屠宰健康的的新鮮的豬后腿肉作為原料肉；(2)分割、修整：將豬肉洗凈，切成長條；(3)腌制：取15斤洗凈切好的新鮮豬肉，加入75g醬油，75g鹽，味極鮮17g，料酒9g，味精7-8g，脫氫乙酸鈉7-8g，D-異抗壞血酸鈉8g，谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶15g，乳酸鏈球菌素9g，檸檬酸6g，溶菌酶3g，生粉300g，亞硫酸鈉5g；大米胚芽酶解物的添加量按照90g-105g；(4)灌腸衣及捆扎：然后取腌制后的豬肉約500g，用豬腸衣裹成火腿狀、外用麻繩捆緊，腸衣為豬小腸或者豬大腸外面的那層透明物質(zhì)，用小腸衣裹肉時，一定要緊貼肉面，不留空隙，注意裹嚴(yán)。(5)蒸煮：放入浸泡肉的原湯內(nèi)煮熟；(6)殺菌：高溫蒸汽殺菌30-60min；(7)成品：殺菌完畢后，冷卻后，真空包裝成成品。本發(fā)明的有益效果是：第一，本發(fā)明通及微波穩(wěn)定化處理、色選機(jī)篩選、超微粉碎制備均勻細(xì)膩的大米胚芽、小麥胚芽和玉米胚芽粉，完整保留了原材料中的功效成分，符合現(xiàn)代食品追求天然、營養(yǎng)、健康的整體發(fā)展趨勢；第二，通過多步生物酶酶解技術(shù)將大米胚芽、小麥胚芽和玉米胚芽中的粗纖維轉(zhuǎn)換為膳食纖維、多聚糖等，通過堿性蛋白酶、中性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶等將谷物蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化成活性蛋白、功能多肽、寡肽等，完整的保留了谷物胚芽中的營養(yǎng)成分。第三，生物酶酶解的過程中施加了多模式超聲波、掃頻超聲波和逆流超聲波，超聲輔助酶解過程中，縮短了酶解時間，改善了酶解效果，減少了酶的使用量，提高了酶解產(chǎn)物的活性。第四，在高溝捆蹄加工過程中，添加大米胚芽酶解物作為抗氧化添加劑，達(dá)到了同添加亞硝酸鈉相同的防腐和抗氧化作用，減緩脂肪氧化，延長保質(zhì)期。而且還更容易讓人接受，降低了亞硝酸鈉的致癌風(fēng)險(xiǎn)。是一種理想的肉制品加工抗氧化劑。附圖說明圖1是多模式超聲輔助酶解設(shè)備結(jié)構(gòu)圖，其中1、2、3為超聲振板，4為盛液器，5為水浴鍋，6為溫度探頭，7為循環(huán)泵，8為電腦程序控制器，9、10、11為超聲控制器。圖2為掃頻雙頻超聲預(yù)處理裝置的設(shè)備圖，1-超聲池，2-溫度計(jì)，3-恒溫水浴池，4-超聲波上振板，5-超聲波下振板，6-樣品處理區(qū)域，7-電腦控制器，8-超聲波發(fā)生器。圖3為逆流超聲處理設(shè)備結(jié)構(gòu)示意圖，1為聚能式超聲波探頭，2為超聲波控制器，3為超聲杯型腔，4為進(jìn)料口，5為循環(huán)泵，6為盛液器，7為出料口。具體實(shí)施方式在本發(fā)明中所使用的術(shù)語，除非有另外說明，一般具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義。下面結(jié)合具體的實(shí)施例，并參照數(shù)據(jù)進(jìn)一步詳細(xì)地描述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例只是為了舉例說明本發(fā)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明中使用的酶，包括：Alcalase2.4LFG蛋白酶(1.325×105U/g，最適溫度，50℃；pH，8.0)，諾維信生物技術(shù)有限公司；纖維素酶：酶活8000U/g，中性蛋白酶(酶活力為16.0萬U/g)、風(fēng)味蛋白酶(酶活力為6.9萬U/g)由無錫杰能科酶制劑有限公司提供。圖1為本發(fā)明的超聲輔助酶解法采用的多模式超聲輔助酶解設(shè)備，該設(shè)備配有一臺電腦程序控制器8，可設(shè)定超聲工作參數(shù)(超聲功率密度、頻率、脈沖工作時間、間歇時間和處理總時間)分別控制三個超聲控制器9、10、11，分別連接三支不同頻率的超聲振板1、2、3，可實(shí)現(xiàn)單一頻率/兩個頻率/三個頻率超聲波處理；將需要酶解的懸浮溶液投入盛液器4中進(jìn)行單頻/雙頻/多頻超聲輔助酶解試驗(yàn)，啟動循環(huán)泵7對酶解液進(jìn)行循環(huán)。通過水浴鍋5和溫度探頭6實(shí)現(xiàn)酶解液溫度的自動控制。圖2為本發(fā)明使用的掃頻雙頻超聲預(yù)處理裝置的設(shè)備圖，為江蘇大學(xué)自主研制。超聲發(fā)生器8能發(fā)出定頻和掃頻兩種模式的超聲波，單臺超聲波發(fā)生器功率為600w。在超聲池1中上下對稱放置超聲波振板上板4和超聲波下板5，通過超聲波發(fā)生器8控制超聲波振板上板4和超聲波下板5；電腦控制器7設(shè)定超聲波各參數(shù)后，控制超聲波發(fā)生器8，發(fā)出符合要求的超聲波；3為本發(fā)明中設(shè)備的恒溫水浴池，通過溫度計(jì)2實(shí)時監(jiān)控溫度，并根據(jù)工作需要調(diào)節(jié)介質(zhì)溫度；將需要處理的液原料置于樣品袋中置于處理液區(qū)域6中進(jìn)行超聲波處理。圖3為本發(fā)明的逆流超聲處理設(shè)備，該設(shè)備配有超聲波控制器2，控制超聲參數(shù)，聚能式超聲波探頭1對進(jìn)料口4進(jìn)入超聲杯型腔3的物料進(jìn)行處理，超聲的同時啟動循環(huán)泵5對料液進(jìn)行循環(huán)，6為盛液器，7為出料口。實(shí)施例1、大米胚芽復(fù)合酶解物的制備：原料組成：大米胚芽：100g；玉米胚芽：50g；小麥胚芽：50g；1)谷物胚芽穩(wěn)定化處理；采取微波干燥，大胚芽均勻的維持物料層均勻的鋪成厚度1cm厚薄層，以保證受熱均勻，進(jìn)行微波加熱滅酶同時微波干燥，微波額定功率2kW，處理量每小時約30kg大米胚芽；處理后胚芽的含水量小于5％；2)色選機(jī)篩選；將干燥過的谷物胚芽放入色選機(jī)中，清除率大于99％；3)超微粉碎：將干燥過的谷物胚芽利用機(jī)械剪切式超微粉碎使之破碎，從而將谷物胚芽顆粒粉碎至小于25微米的粉體；粉碎時間為20分鐘；4)超聲輔助纖維素酶酶解：按質(zhì)量比為1:5的比例將粉碎的谷物胚芽(1000g)與水(5000g)混合成懸浮液，加熱至55℃，調(diào)節(jié)pH至6.0，采用纖維素酶在55℃條件下酶解120min，加酶量按照酶的酶活與底物的質(zhì)量比為1000u/g；酶解的同時進(jìn)行掃頻模式超聲處理，雙頻掃頻超聲工作時固定上下板間距為10cm，掃頻周期300s，間歇比2:1(超聲10s，間歇5s)，上下每塊振板功率為600W。雙頻頻率組合為：40kHz/33kHz。超聲時間與酶解時間相同；5)多模式超聲輔助蛋白酶酶解：調(diào)節(jié)pH到7.0，降溫至40℃，再按照2000u/g加入中性蛋白酶，迅速進(jìn)行多頻模式超聲處理，三頻順序超聲處理的超聲波頻率組合為：28/35/40kHz。超聲功率密度60W/L；超聲脈沖工作時間10s；脈沖間歇時間3s。酶解時間120min。6)風(fēng)味蛋白酶酶解：調(diào)節(jié)pH到6.0，降溫至45℃，再按照1200u/g加入風(fēng)味蛋白酶，進(jìn)行酶解，酶解時間90min。7)酶解反應(yīng)結(jié)束后，將酶解液迅速升溫至75℃并保持30分鐘，然后降溫至55℃，并加入按照胚芽與麥芽糊精為1:1的質(zhì)量比加入麥芽糊精攪拌均勻，通過高壓均質(zhì)機(jī)進(jìn)行均質(zhì)三次，每次的壓力分別為50兆帕，40兆帕，50兆帕，均質(zhì)時間分別為15min，20min，10min；收集幾次的酶解液，最后進(jìn)行噴霧干燥，噴霧干燥的工藝條件為：進(jìn)風(fēng)口溫度160～200℃，出風(fēng)口溫度為70～100℃，得大米胚芽酶解物產(chǎn)品。實(shí)施例2、大米胚芽復(fù)合酶解物的制備：原料組成：大米胚芽：200g；玉米胚芽：100g；小麥胚芽：100g；1)谷物胚芽穩(wěn)定化處理；采取微波干燥，大胚芽均勻的維持物料層均勻的鋪成厚度1cm厚薄層，以保證受熱均勻，進(jìn)行微波加熱滅酶同時微波干燥，微波額定功率2kW，處理量每小時約30kg大米胚芽；處理后胚芽的含水量小于5％；2)色選機(jī)篩選；將干燥過的谷物胚芽放入色選機(jī)中，清除率大于99％；3)超微粉碎：將干燥過的谷物胚芽利用機(jī)械剪切式超微粉碎使之破碎，從而將谷物胚芽顆粒粉碎至小于25微米的粉體；粉碎時間為40分鐘；4)超聲輔助纖維素酶酶解：按質(zhì)量比為1:10的比例將粉碎的谷物胚芽(1000g)與水(10000g)混合成懸浮液，加熱至55℃，調(diào)節(jié)pH至6.0，采用纖維素酶在55℃條件下酶解240min，加酶量按照酶的酶活與底物的質(zhì)量比為1200u/g；酶解的同時進(jìn)行掃頻模式超聲處理，雙頻掃頻超聲工作時固定上下板間距為10cm，掃頻周期300s，間歇比2:1(超聲10s，間歇5s)，上下每塊振板功率為600W。雙頻頻率組合為：28kHz/33kHz。超聲時間與酶解時間相同；5)多模式超聲輔助蛋白酶酶解：調(diào)節(jié)pH到7.0，降溫至40℃，再按照2000u/g加入中性蛋白酶，迅速進(jìn)行多頻模式超聲處理，三頻順序超聲處理的超聲波頻率組合為：28/35/40kHz。超聲功率密度60W/L；超聲脈沖工作時間10s；脈沖間歇時間3s。酶解時間120min。(5)多模式超聲輔助蛋白酶酶解：調(diào)節(jié)pH到7.0，降溫至40～50℃，再按照2000u/g加入步驟(1)的中性蛋白酶，迅速進(jìn)行多頻模式超聲處理，酶解時間120～240min。其中所述的多頻超聲模式為：三頻或者雙頻順序超聲處理，超聲功率密度60～200W/L；超聲脈沖工作時間10s；脈沖間歇時間3s。三頻或者雙頻順序超聲處理的超聲波頻率組合為：28/35kHz、28/35/40kHz或者28/40kHz。6)風(fēng)味蛋白酶酶解：調(diào)節(jié)pH到6.0，降溫至45℃，再按照2000u/g加入風(fēng)味蛋白酶，進(jìn)行酶解，酶解時間90min。7)酶解反應(yīng)結(jié)束后，將酶解液迅速升溫至75℃并保持30分鐘，然后降溫至55℃，并加入按照胚芽與麥芽糊精為1:1的質(zhì)量比加入麥芽糊精攪拌均勻，通過高壓均質(zhì)機(jī)進(jìn)行均質(zhì)三次，每次的壓力分別為50兆帕，40兆帕，50兆帕，均質(zhì)時間分別為15min，20min，10min；收集幾次的酶解液，最后進(jìn)行噴霧干燥，噴霧干燥的工藝條件為：進(jìn)風(fēng)口溫度160～200℃，出風(fēng)口溫度為70～100℃，得大米胚芽酶解物產(chǎn)品。實(shí)驗(yàn)一大米胚芽酶解物抗氧化活性：1、樣品預(yù)處理步驟：分別取1g大米胚芽酶解物，震蕩均勻溶于10mL蒸餾水中，3000轉(zhuǎn)/min下離心10min，取上清液，稀釋至同一濃度(1mg/mL)，測定其抗氧化活性。2、方法：采用ABTS+自由基清除率，DPPH清除率以及鐵離子螯合能力三個指標(biāo)判定大米胚芽酶解物的抗氧化活性。(1)ABTS+自由基清除率：試劑配置：將7mMABTS儲備液和2.45mM高硫酸鉀(最終濃度)混合。在室溫，避光下靜置12-16h，形成ABTS+自由基工作液；使用前用0.2M磷酸緩沖液(PH7.4)稀釋，使其在734nm處吸光度值為0.70±0.02。標(biāo)準(zhǔn)曲線：20μL的Trolox(0-3mM)與1980μL的ABTS+震蕩混勻，30℃下反應(yīng)10min后在734nm測吸光度值。同時以超純水為空白，建立顯示ABTS+自由基清除率與Trolox濃度之間關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線，公式如下。式中：Ab—空白吸光度值；As—樣品吸光度值；樣品分析：20μL樣品(濃度根據(jù)活性調(diào)整，使清除率在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi))與1980μL的ABTS+震蕩混勻，30℃下反應(yīng)10min，后在734nm處測吸光度值，以超純水為空白，計(jì)算ABTS+自由基清除率，對照標(biāo)曲得到以Trolox當(dāng)量(μM)表示結(jié)果。(2)DPPH清除率試劑配置：用無水乙醇溶解DPPH配成1mmol/L的溶液，避光冷藏放置。使用時用無水乙醇稀釋10倍后使用(0.1mmol/L)。樣品測定：將1.5mL樣品與等體積0.1mmol/L的DPPH乙醇溶液震蕩混合于30℃條件下反應(yīng)30min后在517nm處測定吸光度值。同時，以樣品溶劑作為空白計(jì)算DPPH清除率，公式如下。式中：Ab—空白吸光度值；As—樣品吸光度值；(3)鐵離子螯合能力：試劑：2mMFeCl2溶液，5mMferrozine溶液步驟：取1mL樣品溶液與0.05mL的2mMFeCl2溶液，1.85mL超純水混合，反應(yīng)3min后；加入0.1mL的5mMferrozine溶液，均勻混合后在30℃條件下反應(yīng)10min；在562nm下測定反應(yīng)液的吸光度值，并以超純水作對照，公式如下。式中：Ab—空白吸光度值；As—樣品吸光度值；3、試驗(yàn)結(jié)果本發(fā)明中大米胚芽復(fù)合酶解物具有抗氧化活性，1mg/mL大米胚芽復(fù)合酶解物對ABTS+自由基清除率為45.1％，對DPPH自由基清除率達(dá)70.0％，鐵離子螯合率得到80.4％；說明大米胚芽復(fù)合酶解物具有很強(qiáng)的抗氧化能力。實(shí)驗(yàn)二大米胚芽酶解物作為捆蹄抗氧化肽添加劑的應(yīng)用1高溝捆蹄的制作：(1)原料肉的選擇：選擇屠宰健康的的新鮮的豬后腿肉作為原料肉；(2)分割、修整：將豬肉洗凈，切成長條；(3)腌制：取15斤洗凈切好的新鮮豬肉，加入75g醬油，75g鹽，味極鮮17g，料酒9g，味精7-8g，脫氫乙酸鈉7-8g，D-異抗壞血酸鈉8g，谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶15g，乳酸鏈球菌素9g，檸檬酸6g，溶菌酶3g，生粉300g，亞硫酸鈉5g。(4)灌腸衣及捆扎：然后取腌制后的豬肉約500g，用豬腸衣裹成火腿狀、外用麻繩捆緊，腸衣為豬小腸或者豬大腸外面的那層透明物質(zhì)，用小腸衣裹肉時，一定要緊貼肉面，不留空隙，注意裹嚴(yán)。(5)蒸煮：放入浸泡肉的原湯內(nèi)煮熟；(6)殺菌：高溫蒸汽殺菌30-60min；(7)成品：殺菌完畢后，冷卻后，真空包裝成成品。按照上述步驟制作了兩種高溝捆蹄：樣品A(添加大米胚芽酶解物作為抗氧化添加劑的捆蹄，大米胚芽酶解物的添加量按照6-7g/500g肉，不添加任何亞硝酸鈉和丁基羥基茴香醚(BHA)，二丁基羥基甲苯(BHT)等化學(xué)抗氧化劑和防腐劑)。樣品B(市場上的常規(guī)高溝捆蹄，添加了亞硝酸鈉和丁基羥基茴香醚(BHA)等化學(xué)抗氧化劑和防腐劑，上述兩種添加劑的添加量均符合國家相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，其中亞硝酸鈉的添加量為0.1g/kg肉，丁基羥基茴香醚(BHA)為0.1g/kg肉)。上述捆蹄制作實(shí)驗(yàn)在江蘇圓綠捆蹄有限公司完成。2感官評價(jià)2.1定向成對偏愛檢驗(yàn)在檢驗(yàn)中，對于樣品A(添加大米胚芽酶解物作為抗氧化添加劑的捆蹄)和樣品B(正常添加亞硝酸鈉的捆蹄)，共有34名評價(jià)員參與評價(jià)。評價(jià)的結(jié)果是有27位評價(jià)員偏愛樣品A，有7人偏愛樣品B。根據(jù)上述的評價(jià)結(jié)果，查表可知，在顯著性水平為5％的情況下，樣品顯著差異的臨界值為24，實(shí)測的數(shù)值為27，大于這一臨界值，因此評價(jià)小組對樣品A的偏愛超過對樣品B的偏愛。也就是說，這兩個樣品的偏愛程度有顯著性差異。2.2各感官指標(biāo)的評定2.2.1權(quán)重的確定。首先根據(jù)相對重要性對每個因素進(jìn)行重要性比較，根據(jù)評分結(jié)果，我們將口感風(fēng)味和香味由10分制化成5分制，方便比較。由此可以確定色澤的總得分為260.2，口感風(fēng)味的總得分為175.5，組織形態(tài)的總得分為257.2，香味的總得分為298.1，一共991分。將各項(xiàng)因素所得總分除以全部因素總分之和得到權(quán)重系數(shù)為A＝[0.2626,0.1771,0.2595,0.3008]。2.2.2加權(quán)評分。根據(jù)樣品A在色澤、口感風(fēng)味、組織形態(tài)和香味方面的得分，求出樣品A的得分：PA＝0.2626×112.7+0.1771×104.5+0.2595×123.7+0.3008×175.5＝132.9934。同理可得到樣品B的得分PB＝122.8287。可見PA＞PB，表明添加添加大米胚芽酶解物作為抗氧化添加劑的捆蹄在總體上明顯好于正常添加亞硝酸鈉的捆蹄。表2感官評定加權(quán)評分計(jì)算3高溝捆蹄的穩(wěn)定性評價(jià)將兩種捆蹄樣品存放于冰箱的保鮮室(0-4℃)內(nèi)儲存，每隔15天進(jìn)行一次樣品的指標(biāo)測試，主要的指標(biāo)有pH，酸價(jià)和硫代巴比妥酸值(TBA值)等。我們測了四次，最后一次隔30天測一次，每次進(jìn)行兩次試驗(yàn)，取平均值。3.1pH值的測定稱取捆蹄10g，用100ml無氨蒸餾水浸漬30min，其間不時振搖，然后過濾得到浸濾液，用酸度計(jì)測定浸濾液的pH值。表3大米胚芽酶解物對捆蹄pH值的影響儲藏時間(天)大米胚芽酶解物捆蹄常規(guī)捆蹄06.564.58146.616.32286.616.39586.626.55捆蹄在貯藏過程中pH值的變化如表3所示。可以看出，添加了大米胚芽酶解物的捆蹄的pH接近中性，并且其pH值在儲藏期間基本不變化。對照樣(常規(guī)捆蹄)的pH值均呈緩慢增加趨勢，14d后，pH值開始逐步回升，這與肉制品在貯藏過程中pH值的變化相一致。原因是由于添加的大米胚芽酶解物呈堿性，使pH值有所增加。3.2酸價(jià)的測定剪取捆蹄樣品30g，絞碎后置于250ml具塞碘量瓶中加入30-60℃沸程的石油醚80ml，于4℃冰箱中浸泡6h過濾，取濾液在60℃水浴鍋中揮發(fā)掉石油醚，得到肉脂備用。稱取2-3g經(jīng)過前處理得到的肉脂置于錐形瓶中，加入50ml中性乙醇-乙醚混合液，震蕩使油溶解，必要時可置于熱水中，溫?zé)岽倨淙芙狻＠渲潦覝?，加入酚酞指示?-3滴，以0.05mol/LKOH滴定至出現(xiàn)微紅色，0.5min不褪色為終點(diǎn)。計(jì)算公式：注：x——樣品的酸價(jià)；V——樣品消耗氫氧化鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，ml；c——?dú)溲趸洏?biāo)準(zhǔn)溶液的實(shí)際濃度，mol/L；m——樣品的質(zhì)量，g；56.11——與1mL氫氧化鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液[1mol/L]相當(dāng)?shù)臍溲趸浀膍g數(shù)。結(jié)果如表4所示：表4大米胚芽酶解物對捆蹄酸價(jià)的影響儲藏時間(天)大米胚芽酶解物捆蹄常規(guī)捆蹄01.871.44140.961.39280.581.04580.641.20酸價(jià)是脂肪中游離脂肪酸含量的標(biāo)志，肉制品在長期保藏過程中，由于微生物、酶和熱的作用發(fā)生緩慢水解，產(chǎn)生游離脂肪酸。酸價(jià)越小，說明肉制品中油脂質(zhì)量越好，新鮮度越好。從表4可以看出，隨著儲存時間的延長，添加了添加大米胚芽酶解物作為抗氧化添加劑捆蹄，其酸價(jià)呈緩慢變化的趨勢，說明的大米胚芽酶解物捆蹄油脂氧化的程度比常規(guī)捆蹄慢，大米胚芽酶解物具有良好的抗氧化活性，能抑制捆蹄中的油脂氧化。3.3硫代巴比妥酸(TBA)的測定取10g捆蹄研細(xì)。加50mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7.5％的三氯乙酸(含質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1％的EDTA)，振搖30min，雙層濾紙過濾兩次。取5mL上清液，加入5mL0.02mol/L的2-硫代巴比妥酸溶液，沸水浴中保溫40min，取出冷卻1h后，以1600r/min離心5min，上清液中加5mL氯仿?lián)u勻，靜置分層后取上清液分別在532nm和600nm處比色，測定吸光值并用以下公式計(jì)算TBA值。TBA值(mg/100g)＝(A532-A600)/155×72.6×100％式中A532和A600分別表示上清液在532nm和600nm處的吸光值。表5大米胚芽酶解物對捆蹄硫代巴比妥酸(TBA)的影響儲藏時間(天)大米胚芽酶解物捆蹄(mg/100g)常規(guī)捆蹄(mg/100g)00.0240.038140.0870.066280.0660.064580.0430.047硫代巴比妥酸(TBA)能與不飽和脂肪酸的氧化產(chǎn)物醛類生成有色化合物。TBA值表示產(chǎn)品中醛類物質(zhì)的累積程度，是常用的評價(jià)脂肪氧化程度的指標(biāo)。TBA值越大，表明脂肪氧化程度越大。捆蹄在貯藏過程中TBA值的變化如表5所示。可以看出，隨著時間的延長，處理樣和對照樣的TBA值均呈先上升后下降的趨勢，說明火腿腸的脂肪氧化程度不斷加強(qiáng)。在貯藏過程中，添加了添加大米胚芽酶解物作為抗氧化添加劑的捆蹄和常規(guī)捆蹄中的不飽和脂肪酸氧化的程度變化趨勢一致，說明大米胚芽酶解物能夠替代化學(xué)抗氧化劑，減緩脂肪氧化，延長保質(zhì)期。4結(jié)論通過感官評價(jià)和油脂的穩(wěn)定性試驗(yàn)評價(jià)，可以得出以下的結(jié)論：添加大米胚芽酶解物作為抗氧化添加劑在捆蹄中起著同添加亞硝酸鈉防腐劑相同的防腐和氧化作用，減緩脂肪氧化，延長保質(zhì)期。而且還更容易讓人接受，降低了亞硝酸鈉的致癌風(fēng)險(xiǎn)。是一種理想的肉制品加工抗氧化劑。當(dāng)前第1頁1 2 3