本發(fā)明涉及蝦青素軟膠囊制備技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種蝦青素軟膠囊配方及其制備方法。
背景技術(shù)：
蝦青素又名蝦黃質(zhì)、龍蝦殼色素，是一種類胡蘿卜素，也是類胡蘿卜素合成的最高級(jí)別產(chǎn)物，呈深粉紅色，化學(xué)結(jié)構(gòu)類似于β-胡蘿卜素，而β-胡蘿卜素、葉黃素、角黃素、番茄紅素等都是類胡蘿卜素合成的中間產(chǎn)物，因此在自然界，蝦青素具有最強(qiáng)的抗氧化性。廣泛存在于生物界，特別是蝦、蟹、魚、藻體、酵母和鳥類的羽毛中含量較高，是海洋生物體內(nèi)主要的類胡蘿卜素之一。蝦青素世界上最強(qiáng)的抗氧化劑之一，有效清除細(xì)胞內(nèi)的氧自由基，增強(qiáng)細(xì)胞再生能力，維持機(jī)體平衡和減少衰老細(xì)胞的堆積，由內(nèi)而外保護(hù)細(xì)胞和dna健康，從而保護(hù)皮膚健康，促進(jìn)毛發(fā)生長(zhǎng)，抗衰老、緩解運(yùn)動(dòng)疲勞、增強(qiáng)活力。自2008年以來(lái)，國(guó)內(nèi)外大量研究證實(shí)蝦青素具有較強(qiáng)的抗氧化活性，在提高免疫力，預(yù)防腫瘤、心血管疾病、糖尿病等慢性疾病的發(fā)生發(fā)展，延緩衰老等方面具有積極的促進(jìn)作用，設(shè)計(jì)了一種蝦青素軟膠囊配方及其制作方法具有一定的意義。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
針對(duì)以上問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種蝦青素軟膠囊配方及其制備方法，以蝦青素納米乳液、紅花籽油、明膠、甘油、純化水為主要原料制成的保健食品，具有增強(qiáng)免疫力和抗氧化的保健功能。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：一種蝦青素軟膠囊配方，
其膠囊內(nèi)容物配方由如下原料組成：
蝦青素納米乳液110-130g；
不飽和脂肪酸370-390g；
其囊皮配方按照重量百分比有如下原料組成：
甘油43-47％；
明膠17-21％；
純化水34-38％。
作為本發(fā)明一種優(yōu)選的方案，其膠囊內(nèi)容物配方由如下原料組成：
蝦青素納米乳液120g；
不飽和脂肪酸380g；
其囊皮配方按照重量百分比有如下原料組成：
甘油45％；
明膠19％；
純化水36％。
作為本發(fā)明一種優(yōu)選的方案，所述蝦青素納米乳液采用蝦青素納米乳液。
作為本發(fā)明一種優(yōu)選的方案，所述不飽和脂肪酸采用富含亞油酸的紅花籽油、棕櫚油等。
另外本發(fā)明還設(shè)計(jì)了一種蝦青素軟膠囊的制備方法，包括如下步驟：
(1)制備蝦青素納米：將雨生紅球藻通過(guò)化學(xué)工藝提取及乳化后得到蝦青素納米；
(2)將得到的蝦青素納米和不飽和脂肪酸混合均勻，得到溶液i；
(3)將明膠、甘油、純化水按照比例混合，并經(jīng)過(guò)溶膠和過(guò)濾工藝處理得到溶液ii；
(4)將上述溶液i和溶液ii經(jīng)過(guò)壓丸工藝處理，再依次經(jīng)過(guò)定型、洗丸、干燥、選丸、包裝、檢驗(yàn)工藝之后入庫(kù)。
作為本發(fā)明一種優(yōu)選的方案，所述步驟(4)中包裝工藝分為內(nèi)包裝和外包裝，并且先進(jìn)行內(nèi)包裝工藝，再進(jìn)行外包裝工藝。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：
本發(fā)明通過(guò)橡膠材料的設(shè)計(jì)，使得設(shè)備在使用的時(shí)候，可以很好的自動(dòng)恢復(fù)到正常的位置，在跨欄訓(xùn)練中能夠快速的回正，減少了跨欄倒地扶起來(lái)浪費(fèi)的時(shí)間與精力，很好的保護(hù)了跨欄訓(xùn)練者的安全，能夠調(diào)節(jié)適應(yīng)不同的訓(xùn)練要求，值得推廣。
具體實(shí)施方式
下面將對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒(méi)有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
實(shí)施例1：
一種蝦青素軟膠囊配方，其膠囊內(nèi)容物配方由如下原料組成：
蝦青素納米乳液110g；
不飽和脂肪酸370g；
其囊皮配方按照重量百分比有如下原料組成：
甘油43％；
明膠17％；
純化水34％。
所述蝦青素納米乳液采用蝦青素納米乳液；所述不飽和脂肪酸采用富含亞油酸的紅花籽油、棕櫚油等。
其制備方法包括如下步驟：
(1)制備蝦青素納米：將雨生紅球藻通過(guò)化學(xué)工藝提取及乳化后得到蝦青素納米；
(2)將得到的蝦青素納米和不飽和脂肪酸混合均勻，得到溶液i；
(3)將明膠、甘油、純化水按照比例混合，并經(jīng)過(guò)溶膠和過(guò)濾工藝處理得到溶液ii；
(4)將上述溶液i和溶液ii經(jīng)過(guò)壓丸工藝處理，再依次經(jīng)過(guò)定型、洗丸、干燥、選丸、包裝、檢驗(yàn)工藝之后入庫(kù)。
所述步驟(4)中包裝工藝分為內(nèi)包裝和外包裝，并且先進(jìn)行內(nèi)包裝工藝，再進(jìn)行外包裝工藝。
實(shí)施例2：
與實(shí)施例1不同之處在于：
一種蝦青素軟膠囊配方，其膠囊內(nèi)容物配方由如下原料組成：
蝦青素納米乳液120g；
不飽和脂肪酸380g；
其囊皮配方按照重量百分比有如下原料組成：
甘油45％；
明膠19％；
純化水36％。
實(shí)施例3：
與實(shí)施例1不同之處在于：
一種蝦青素軟膠囊配方，其膠囊內(nèi)容物配方由如下原料組成：
蝦青素納米乳液130g；
不飽和脂肪酸390g；
其囊皮配方按照重量百分比有如下原料組成：
甘油47％；
明膠21％；
純化水38％。
a、蝦青素軟膠囊毒理學(xué)安全性評(píng)價(jià)試驗(yàn)：
1材料和方法
1.1樣品：由w公司送檢的q品牌蝦青素軟膠囊，規(guī)格：0.5g/粒，產(chǎn)品批號(hào)：sz20140101，置陰涼干燥處保存。人口服推薦用量為每人(成人)每日2次，每次1粒，成人體重按60kg計(jì)算，折合劑量為16.7mg/kgbw。取膠囊內(nèi)容物進(jìn)行試驗(yàn)，測(cè)得內(nèi)容物的比重為0.9。
1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及環(huán)境：spf級(jí)健康昆明種小鼠，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心繁殖，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：scxk(桂)2009-0002，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：0006676；spf級(jí)健康sd種大鼠，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心繁殖，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：scxk(粵)2013-0002，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：44007200011650。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室為屏障系統(tǒng)，使用許可證號(hào)：syxk(桂)2011-0005。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室溫度：22～25℃，相對(duì)濕度：55～70％。
1.3小鼠急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)：采用最大耐受劑量(mtd)試驗(yàn)法，選體重18～22g的昆明種小鼠20只，雌雄各半。試驗(yàn)前動(dòng)物禁食16小時(shí)，不限飲水。按0.4ml/20gbw的體積給動(dòng)物灌胃樣品一次，按0.9比重計(jì)算，劑量為18000mg/kgbw。灌胃后觀察、記錄動(dòng)物的中毒表現(xiàn)。每周稱重一次，觀察兩周時(shí)間，試驗(yàn)結(jié)束解剖動(dòng)物進(jìn)行大體觀察。按毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)受試物的急性毒性。
1.4ames試驗(yàn)：采用經(jīng)鑒定符合要求的鼠傷寒沙門氏菌組氨酸缺陷型ta97a、ta98、ta100、ta102四種菌株進(jìn)行試驗(yàn)。稱取5.0g樣品，加二甲基亞砜至100ml，混勻，配成50mg/ml濃度溶液，再依次5倍稀釋(取10ml加二甲基亞砜至50ml)，分別配成10、2、0.4、0.08mg/ml濃度溶液，受試溶液經(jīng)高壓滅菌(0.103mpa20min)處理后供試驗(yàn)用。以多氯聯(lián)苯誘導(dǎo)的大鼠肝微粒體酶(s-9)作為體外代謝活化系統(tǒng)。采用平板摻入法，在保溫的頂層培養(yǎng)基中依次加入0.1ml試驗(yàn)菌株增菌液、0.1ml受試物溶液和0.5mls-9混合液(當(dāng)需要代謝活化時(shí))，混勻后倒入底層培養(yǎng)基平板上。5個(gè)試驗(yàn)劑量分別為5000、1000、200、40、8μg/皿，同時(shí)設(shè)自發(fā)回變對(duì)照、溶劑對(duì)照和陽(yáng)性突變劑對(duì)照。自發(fā)回變對(duì)照除不加樣品外，其余條件與樣品組相同。溶劑對(duì)照用二甲基亞砜替代樣品，其余條件與樣品組相同。每個(gè)劑量組的各種菌株均做3個(gè)平行皿。在37℃下培養(yǎng)48小時(shí)，計(jì)數(shù)每皿的菌落數(shù)。整套試驗(yàn)在相同條件下重復(fù)做兩次。如果受試物的回變菌落數(shù)增加超過(guò)自發(fā)回變菌落數(shù)的2倍以上，并具有劑量-反應(yīng)關(guān)系者，即為誘變?cè)囼?yàn)陽(yáng)性。
1.5小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)：采用間隔24小時(shí)兩次經(jīng)口灌胃法進(jìn)行試驗(yàn)。選體重為25～30g的昆明種小鼠50只，隨機(jī)分成5組，每組10只，雌雄各半。試驗(yàn)組3個(gè)劑量分別設(shè)10000、5000、2500mg/kgbw，以玉米油為陰性對(duì)照，40mg/kgbw劑量的環(huán)磷酰胺(cp)作陽(yáng)性對(duì)照。分別稱取40.0、20.0、10.0g樣品，各加玉米油至80ml，混勻、配成500、250、125mg/ml濃度溶液，然后按0.4ml/20gbw的體積給動(dòng)物灌胃，陰性對(duì)照組灌給等體積的玉米油，陽(yáng)性對(duì)照組灌給等體積的2mg/ml環(huán)磷酰胺溶液。第二次給樣后6小時(shí)頸椎脫臼處死動(dòng)物，取胸骨骨髓用小牛血清稀釋涂片，甲醇固定，giemsa染色。在光學(xué)顯微鏡下，每只動(dòng)物計(jì)數(shù)1000個(gè)嗜多染紅細(xì)胞(pce)，觀察含微核的pce數(shù)，微核率以含微核的pce千分率計(jì)；同時(shí)計(jì)數(shù)200個(gè)嗜多染紅細(xì)胞，計(jì)算嗜多染紅細(xì)胞與成熟紅細(xì)胞的比值(pce/nce)。應(yīng)用spss統(tǒng)計(jì)軟件中的泊松分布均數(shù)比較法統(tǒng)計(jì)處理。如試驗(yàn)組的微核率比陰性對(duì)照組增高，并有明顯的劑量-反應(yīng)關(guān)系和統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即為陽(yáng)性結(jié)果。
1.6小鼠精子畸形試驗(yàn)：選體重為25～35g的昆明種雄性小鼠50只，隨機(jī)分成5組，每組10只。試驗(yàn)組3個(gè)劑量分別設(shè)10000、5000、2500mg/kgbw，以玉米油為陰性對(duì)照，40mg/kgbw劑量的環(huán)磷酰胺(cp)作陽(yáng)性對(duì)照。分別稱取40.0、20.0、10.0g樣品，各加玉米油至80ml，混勻、配成500、250、125mg/ml濃度溶液，然后按0.4ml/20gbw的體積給動(dòng)物灌胃，陰性對(duì)照組灌給等體積的玉米油，陽(yáng)性對(duì)照組灌給等體積的2mg/ml環(huán)磷酰胺溶液。每天灌胃一次，連續(xù)5天。末次給樣后第30天處死動(dòng)物，取副睪的精子涂片，甲醇固定，伊紅染色。在光學(xué)顯微鏡下，每只動(dòng)物計(jì)數(shù)完整精子1000個(gè)，計(jì)算精子畸形率。應(yīng)用spss統(tǒng)計(jì)軟件中的wilcoxon秩和檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)處理。如試驗(yàn)組的精子畸形率比陰性對(duì)照組增高，經(jīng)統(tǒng)計(jì)有顯著意義，并有劑量反應(yīng)關(guān)系，即為陽(yáng)性結(jié)果。
1.7大鼠30天喂養(yǎng)試驗(yàn)
1.7.1劑量選擇與受試物給予方式：選sd種大鼠80只，雌、雄性各半，體重為60～80g。將動(dòng)物隨機(jī)分為4組，即陰性對(duì)照組和3個(gè)試驗(yàn)組，每組20只，雌、雄各半。3個(gè)試驗(yàn)組劑量分別設(shè)為1670、835、418mg/kgbw，分別相當(dāng)于人體推薦用量100、50、25倍。分別稱取33.40、16.70、8.35g樣品，各加玉米油至100ml，混勻，配成334.0、167.0、83.5mg/ml濃度溶液，按0.5ml/100gbw的體積給相應(yīng)劑量組動(dòng)物灌胃，陰性對(duì)照組灌給等量的玉米油，每天灌胃一次，連續(xù)灌胃30天。
1.7.2實(shí)驗(yàn)方法：實(shí)驗(yàn)期間所有動(dòng)物給予普通飼料，單籠飼養(yǎng)，自由攝食飲水。每天觀察動(dòng)物的活動(dòng)和生長(zhǎng)情況，每周加食2次，記錄給食量和剩食量，每周稱一次體重，計(jì)算每周進(jìn)食量和食物利用率。實(shí)驗(yàn)結(jié)束動(dòng)物隔夜禁食(禁食16h，不限飲水)，然后稱動(dòng)物空腹體重，處死大鼠，采2份血樣，一份血抗凝用血球計(jì)數(shù)儀檢測(cè)hb、rbc、wbc及其分類、plt等；另一份血不抗凝分離血清，用試劑盒和全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清ast、alt、bun、cr、tc、tg、glu、tp、alb等項(xiàng)目。采血后解剖動(dòng)物，進(jìn)行大體觀察，取肝臟、腎臟、脾臟和睪丸等臟器進(jìn)行稱重，計(jì)算臟/體比值，取肝臟、腎臟、脾臟、胃、十二指腸、睪丸和卵巢等臟器進(jìn)行病理組織學(xué)檢查。在對(duì)各劑量組動(dòng)物作大體檢查未發(fā)現(xiàn)明顯病變和生化指標(biāo)改變時(shí)，只進(jìn)行高劑量組和對(duì)照組動(dòng)物的主要臟器的組織病理學(xué)檢查，如發(fā)現(xiàn)病變則對(duì)中、低劑量組相應(yīng)器官及組織進(jìn)行檢查。
1.7.3實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)：應(yīng)用spss統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析。在統(tǒng)計(jì)分析時(shí)，先對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，若方差齊，采用單因素方差分析進(jìn)行總體比較，發(fā)現(xiàn)差異再用dunnett檢驗(yàn)進(jìn)行多個(gè)劑量組與對(duì)照組均數(shù)間的兩兩比較。若方差不齊則對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，滿足方差齊性檢驗(yàn)后，用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；若轉(zhuǎn)換數(shù)據(jù)仍未達(dá)到方差齊要求，改用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
2結(jié)果
2.1急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)
表1q品牌蝦青素軟膠囊對(duì)小鼠的急性毒性試驗(yàn)結(jié)果
從表1可見(jiàn)，以18000mg/kgbw劑量的樣品給予小鼠灌胃后，動(dòng)物生長(zhǎng)良好，未見(jiàn)體重受到影響。受試小鼠均未見(jiàn)有中毒癥狀，觀察14天無(wú)動(dòng)物死亡。試驗(yàn)結(jié)束解剖動(dòng)物、大體觀察，肝、腎、脾、心、肺、胃、腸等主要臟器均未見(jiàn)明顯異常改變。結(jié)果表明，該樣品對(duì)小鼠的急性經(jīng)口毒性mtd大于18000mg/kgbw，急性經(jīng)口毒性屬無(wú)毒級(jí)。
2.2ames試驗(yàn)
表2q品牌蝦青素軟膠囊第一次ames試驗(yàn)結(jié)果
注：1、以上結(jié)果(菌落數(shù))均為3個(gè)平皿的均值±標(biāo)準(zhǔn)差。
2、陽(yáng)性對(duì)照：ta97a+s9、ta98+s9、ta100+s9采用2-氨基芴(劑量為10μg/皿)；ta98－s9采用柔毛霉素(劑量為6μg/皿)；ta97a－s9、ta102－s9采用敵克松(劑量為50μg/皿)；ta100－s9采用疊氮鈉(劑量為1.5μg/皿)；ta102+s9采用1,8-二羥基蒽醌(劑量為50μg/皿)。表3同。
從表2、表3可見(jiàn)，對(duì)ta97a、ta98、ta100、ta102四種試驗(yàn)菌株，無(wú)論是否加入s-9，樣品各劑量組的回變菌落數(shù)均未超過(guò)自發(fā)回變菌落數(shù)的兩倍，亦無(wú)劑量-反應(yīng)關(guān)系，表明該受試物誘變?cè)囼?yàn)結(jié)果為陰性。
注：以上結(jié)果(菌落數(shù))均為3個(gè)平皿的均值±標(biāo)準(zhǔn)差。
表4芝墉堂牌天然蝦青素軟膠囊對(duì)小鼠的骨髓細(xì)胞微核發(fā)生率的影響
注：**與陰性對(duì)照組比較，p＜0.01；cp為環(huán)磷酰胺。
從表4可見(jiàn)，樣品各劑量組小鼠的骨髓細(xì)胞微核率與陰性對(duì)照組比較，差異均無(wú)顯著性(p＞0.05)，各劑量的pce/nce值均在正常值范圍內(nèi)，各劑量組pce/nce值均不少于陰性對(duì)照組的20％，與陰性對(duì)照組比較也無(wú)明顯差異，而環(huán)磷酰胺陽(yáng)性對(duì)照組的微核率與陰性對(duì)照組的差異有非常顯著性(p＜0.01)，提示未見(jiàn)該樣品對(duì)小鼠的骨髓細(xì)胞有損傷和抑制作用。
表5q品牌蝦青素軟膠囊對(duì)小鼠精子畸形發(fā)生率的影響
注：**與陰性對(duì)照組比較，p＜0.01；cp為環(huán)磷酰胺。
從表5可見(jiàn)，樣品對(duì)小鼠精子畸形發(fā)生率未產(chǎn)生明顯改變，樣品各劑量組的精子畸形率與陰性對(duì)照組比較，差異均無(wú)顯著性(p＞0.05)，而環(huán)磷酰胺陽(yáng)性對(duì)照組與陰性對(duì)照組的差異有非常顯著性(p＜0.01)，提示該樣品對(duì)雄性小鼠的精子未產(chǎn)生畸變作用。
2.5大鼠30天喂養(yǎng)試驗(yàn)
2.5.1動(dòng)物一般表現(xiàn)：實(shí)驗(yàn)期間，各組動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育良好，未見(jiàn)動(dòng)物有異常行為和中毒表現(xiàn)，各組動(dòng)物均無(wú)死亡
2.5.2樣品對(duì)大鼠體重及食物利用率的影響
結(jié)果見(jiàn)表6～表11，以1670、835、418mg/kgbw劑量的q品牌蝦青素軟膠囊給大鼠灌胃30天，實(shí)驗(yàn)期間，樣品各劑量組雌雄鼠每周的體重、增重量、每周進(jìn)食量及總進(jìn)食量、每周食物利用率及總食物利用率與對(duì)照組比較，差異均無(wú)顯著性(p＞0.05)，表明該樣品對(duì)大鼠的體重增長(zhǎng)和食物利用率無(wú)明顯影響。
表6q品牌蝦青素軟膠囊對(duì)大鼠體重的影響
注：表中各劑量組與陰性對(duì)照組比較，差異均無(wú)顯著性(p＞0.05)。
表7q品牌蝦青素軟膠囊對(duì)大鼠第1周體重增長(zhǎng)和食物利用率的影響
注：表中各劑量組與陰性對(duì)照組比較，差異均無(wú)顯著性(p＞0.05)。
表8q品牌蝦青素軟膠囊對(duì)大鼠第2周體重增長(zhǎng)和食物利用率的影響
注：表中各劑量組與陰性對(duì)照組比較，差異均無(wú)顯著性(p＞0.05)。
表9q品牌蝦青素軟膠囊對(duì)大鼠第3周體重增長(zhǎng)和食物利用率的影響
注：表中各劑量組與陰性對(duì)照組比較，差異均無(wú)顯著性(p＞0.05)。
表10q品牌蝦青素軟膠囊對(duì)大鼠第4周體重增長(zhǎng)和食物利用率的影響
注：第4周的天數(shù)為9天。表中各劑量組與陰性對(duì)照組比較，差異均無(wú)顯著性(p＞0.05)。
表11q品牌蝦青素軟膠囊對(duì)大鼠總食物利用率的影響
注：表中各劑量組與陰性對(duì)照組比較，差異均無(wú)顯著性(p＞0.05)。
2.5.3樣品對(duì)大鼠血常規(guī)指標(biāo)的影響
表12q品牌蝦青素軟膠囊30天喂養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束大鼠血常規(guī)指標(biāo)檢查結(jié)果
注：表中各劑量組與陰性對(duì)照組比較，差異均無(wú)顯著性(p＞0.05)。
表13q品牌蝦青素軟膠囊30天喂養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束大鼠血常規(guī)指標(biāo)檢查結(jié)果
注：表中各劑量組與陰性對(duì)照組比較，差異均無(wú)顯著性(p＞0.05)。
從表12、表13可見(jiàn)，以1670、835、418mg/kgbw劑量的q品牌蝦青素軟膠囊給大鼠灌胃30天，樣品各劑量組雌、雄性大鼠的血紅蛋白、紅細(xì)胞總數(shù)、白細(xì)胞總數(shù)及其分類、血小板數(shù)與對(duì)照組比較，差異均無(wú)顯著性(p＞0.05)，表明該樣品對(duì)大鼠的血常規(guī)指標(biāo)無(wú)明顯影響。
2.5.4樣品對(duì)大鼠血液生化指標(biāo)的影響
結(jié)果見(jiàn)表14、表15，以1670、835、418mg/kgbw劑量的q品牌蝦青素軟膠囊給大鼠灌胃30天，樣品各劑量組雌、雄性大鼠的血清谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、尿素氮、肌酐、膽固醇、甘油三酯、總蛋白、白蛋白、血糖與對(duì)照組比較，差異均無(wú)顯著性(p＞0.05)，表明該樣品對(duì)大鼠的血液生化指標(biāo)無(wú)明顯影響。
表14q品牌蝦青素軟膠囊30天喂養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束大鼠血液生化指標(biāo)檢查結(jié)果
注：表中各劑量組與陰性對(duì)照組比較，差異均無(wú)顯著性(p＞0.05)。
表15q品牌蝦青素軟膠囊30天喂養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束大鼠血液生化指標(biāo)檢查結(jié)果
注：表中各劑量組與陰性對(duì)照組比較，差異均無(wú)顯著性(p＞0.05)。
2.5.5樣品對(duì)大鼠臟器重量及臟器/體重比值的影響
結(jié)果見(jiàn)表16、表17，以1670、835、418mg/kgbw劑量的q品牌蝦青素軟膠囊給大鼠灌胃30天，樣品各劑量組大鼠的肝、腎、脾、雄鼠睪丸重量和肝/體、腎/體、脾/體、雄鼠睪/體比值與對(duì)照組比較，差異均無(wú)顯著性(p＞0.05)，表明該樣品對(duì)大鼠的臟器重量及臟器/體重比值無(wú)明顯影響。
表16q品牌蝦青素軟膠囊對(duì)大鼠臟器重量的影響
注：表中各劑量組與陰性對(duì)照組比較，差異均無(wú)顯著性(p＞0.05)。
表17q品牌蝦青素軟膠囊對(duì)大鼠臟器/體重比值的影響
注：表中各劑量組與陰性對(duì)照組比較，差異均無(wú)顯著性(p＞0.05)。
2.5.6解剖大體觀察及組織學(xué)檢查結(jié)果
實(shí)驗(yàn)結(jié)束解剖動(dòng)物，大體觀察各組動(dòng)物均未發(fā)現(xiàn)明顯病變。故只選樣品的高劑量組和陰性對(duì)照組動(dòng)物的主要臟器進(jìn)行組織病理切片檢查，結(jié)果見(jiàn)表18～表24。結(jié)果顯示，高劑量組有1只雄性和2只雌性、對(duì)照組有2只雄性和2只雌性大鼠的肝小葉組織可見(jiàn)輕度的肝細(xì)胞脂肪變性，高劑量組有1只雄性、對(duì)照組有1只雄性和1只雌性大鼠的肝小葉可見(jiàn)肝細(xì)胞點(diǎn)狀壞死，高劑量組和對(duì)照組均有1只雄性和1只雌性大鼠的肝臟匯管區(qū)可見(jiàn)少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)；高劑量組有1只雄性和1只雌性、對(duì)照組有1只雄性和2只雌性大鼠的腎臟皮質(zhì)部間質(zhì)可見(jiàn)少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)。以上組織病變屬動(dòng)物的自發(fā)輕型病變，且兩組動(dòng)物的組織病變程度相似，故可以排除是樣品所致，其他臟器組織未見(jiàn)病理組織學(xué)改變，表明該樣品對(duì)大鼠的上述臟器組織無(wú)損害作用。
表18q品牌蝦青素軟膠囊30天喂養(yǎng)試驗(yàn)大鼠肝臟組織病理學(xué)檢查結(jié)果
表19q品牌蝦青素軟膠囊30天喂養(yǎng)試驗(yàn)大鼠腎臟細(xì)織病理學(xué)檢查結(jié)果
表20q品牌蝦青素軟膠囊30天喂養(yǎng)試驗(yàn)大鼠脾臟組織病理學(xué)檢查結(jié)果
表21q品牌蝦青素軟膠囊30天喂養(yǎng)試驗(yàn)大鼠胃組織病理學(xué)檢查結(jié)果
表22q品牌蝦青素軟膠囊30天喂養(yǎng)試驗(yàn)大鼠十二指腸組織病理學(xué)檢查結(jié)果
表23q品牌蝦青素軟膠囊30天喂養(yǎng)試驗(yàn)大鼠雄鼠睪丸組織病理學(xué)檢查結(jié)果
表24q品牌蝦青素軟膠囊30天喂養(yǎng)試驗(yàn)大鼠雌鼠卵巢組織病理學(xué)檢查結(jié)果
3小結(jié)
以18000mg/kgbw劑量的樣品給予小鼠灌胃后，未見(jiàn)動(dòng)物有中毒癥狀和死亡，該樣品對(duì)小鼠的急性經(jīng)口毒性mtd大于18000mg/kgbw，急性經(jīng)口毒性屬無(wú)毒級(jí)。三項(xiàng)遺傳毒性試驗(yàn)(ames試驗(yàn)、小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)、小鼠精子畸形試驗(yàn))結(jié)果均為陰性。30天喂養(yǎng)試驗(yàn)，以1670、835、418mg/kgbw(分別相當(dāng)于人體推薦用量100、50、25倍)3個(gè)劑量的樣品連續(xù)給大鼠灌胃30天，實(shí)驗(yàn)期間動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育良好，各劑量組大鼠的體重、增重量、進(jìn)食量、食物利用率、血常規(guī)指標(biāo)、血液生化指標(biāo)、臟器重量及臟器/體重比值等與對(duì)照組比較，均無(wú)顯著性差異(p>0.05)；大體解剖觀察和組織病理學(xué)檢查未見(jiàn)與樣品有關(guān)的異常改變。在受試劑量范圍內(nèi)未見(jiàn)該樣品對(duì)大鼠各項(xiàng)觀察指標(biāo)產(chǎn)生毒副作用。
b、q品牌蝦青素軟膠囊抗氧化功能動(dòng)物實(shí)驗(yàn)報(bào)告
1材料和方法
1.1樣品：由w公司送檢的q品牌蝦青素軟膠囊，規(guī)格：0.5g/粒，產(chǎn)品批號(hào)：sz20140101，置陰涼干燥處保存。人口服推薦用量為每人(成人)每日2次，每次1粒，成人體重按60kg計(jì)算，折合劑量為16.7mg/kgbw。取膠囊內(nèi)容物進(jìn)行試驗(yàn)。
1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及環(huán)境：選用廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心繁殖的spf級(jí)10月齡以上sd種雄性大鼠40只，體重591.1±26.6g，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：scxk(桂)2009-0002，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：0006243。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室為屏障系統(tǒng)，使用許可證號(hào)：syxk(桂)2011-0005。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室溫度：22～25℃，相對(duì)濕度：55～75％。
1.3劑量選擇與受試物給予方式：根據(jù)樣品的人體推薦量設(shè)334、167、84mg/kgbw(分別相當(dāng)于人體推薦用量的20、10、5倍)3個(gè)劑量組，同時(shí)設(shè)一個(gè)陰性對(duì)照組，每組10只動(dòng)物。分別取送檢樣品6.68、3.34、1.68g，各加玉米油至100ml，混勻，配成66.8、33.4、16.8mg/ml濃度的溶液，采用經(jīng)口方式，分別給予相應(yīng)劑量組動(dòng)物灌胃，灌胃體積為0.5ml/100gbw，陰性對(duì)照組給予等體積的玉米油，每天灌胃一次，連續(xù)灌胃30天。
1.4儀器與試劑
1.4.1儀器：日立ky2000型半自動(dòng)生化分析儀、電子分析天平、低溫離心機(jī)、恒溫水浴箱、旋渦混勻器等。
1.4.2試劑：生理鹽水，mda、蛋白質(zhì)羰基、sod、gsh試劑盒(南京建成生物工程研究所提供)等。
1.5實(shí)驗(yàn)方法：依據(jù)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局發(fā)布的國(guó)食藥監(jiān)?；痆2012]107號(hào)《關(guān)于印發(fā)抗氧化功能評(píng)價(jià)方法等9個(gè)保健功能評(píng)價(jià)方法的通知》的附件1—抗氧化功能評(píng)價(jià)方法。受試?yán)淆g大鼠在spf級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室內(nèi)喂養(yǎng)觀察7天，未見(jiàn)異常后眼內(nèi)眥取血測(cè)定血清丙二醛(mda)含量。根據(jù)mda含量將大鼠分層隨機(jī)分成4個(gè)組，每組10只，并適當(dāng)調(diào)整，使各組的平均體重也盡可能的均衡。按0.5ml/100gbw的體積，分別給予各劑量組動(dòng)物灌胃相應(yīng)濃度的樣品溶液，陰性對(duì)照組給予等體積的玉米油，每天灌胃一次，連續(xù)灌胃30天，然后處死動(dòng)物，取血、肝組織進(jìn)行觀察指標(biāo)測(cè)定。
1.5.1大鼠血清和肝組織勻漿液中l(wèi)po含量測(cè)定(以mda含量計(jì))。
1.5.2大鼠血清和肝組織勻漿液中蛋白質(zhì)氧化產(chǎn)物(蛋白質(zhì)羰基)含量測(cè)定。
1.5.3大鼠血清和肝組織勻漿液中抗氧化酶(sod)活力測(cè)定。
1.5.4大鼠血清和肝組織勻漿液中抗氧化物質(zhì)(gsh)含量測(cè)定。
1.6實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。
1.7結(jié)果判定：過(guò)氧化脂質(zhì)含量、蛋白質(zhì)羰基、抗氧化酶活性、抗氧化物質(zhì)四項(xiàng)指標(biāo)中三項(xiàng)指標(biāo)陽(yáng)性，可判定該受試樣品抗氧化動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性。
2試驗(yàn)結(jié)果
2.1樣品對(duì)大鼠體重的影響
試驗(yàn)前各組大鼠的體重?zé)o明顯差異，試驗(yàn)過(guò)程及結(jié)束樣品各劑量組的大鼠體重及增重量與陰性對(duì)照組比較，差異均無(wú)顯著性(p>0.05)，表明該樣品對(duì)老齡大鼠的體重?zé)o明顯影響，見(jiàn)表1。
表1實(shí)驗(yàn)期間各組大鼠的體重變化
注：表中各時(shí)期各組大鼠的體重及增重量比較，差異均無(wú)顯著性(p＞0.05)。
注：表中各時(shí)期各組大鼠的體重及增重量比較，差異均無(wú)顯著性(p>0.05)。
2.2樣品對(duì)大鼠血清及組織過(guò)氧化脂質(zhì)(lpo)含量的影響
試驗(yàn)前各組動(dòng)物的血清lpo含量較均衡，各組之間差異無(wú)顯著性(p>0.05)。試驗(yàn)終末，樣品各劑量組大鼠的血清和肝組織的過(guò)氧化脂質(zhì)(lpo)含量均低于陰性對(duì)照組，但各劑量組與對(duì)照組比較，差異無(wú)顯著性(p>0.05)，見(jiàn)表2，表明該樣品對(duì)老齡大鼠的血清和組織過(guò)氧化脂質(zhì)含量無(wú)明顯的降低作用。
表2各組大鼠的血清和肝組織過(guò)氧化脂質(zhì)(lpo以mda計(jì))含量
2.3樣品對(duì)大鼠血清及組織蛋白質(zhì)羰基含量的影響
表3各組大鼠的血清和肝組織蛋白質(zhì)羰基含量
試驗(yàn)終末，樣品各劑量組大鼠的血清和肝組織的蛋白質(zhì)羰基含量均低于陰性對(duì)照組，其中高、中劑量組血清蛋白質(zhì)羰基含量與陰性對(duì)照組的差異具有極顯著性(p＜0.01)，見(jiàn)表3，表明該樣品具有降低老齡大鼠血清中蛋白質(zhì)羰基含量的作用。
2.4樣品對(duì)大鼠血清及組織中超氧化物歧化酶(sod)活力的影響
試驗(yàn)終末，樣品各劑量組大鼠的血清和肝組織中sod活力均高于陰性對(duì)照組，其中高劑量組血清和肝組織sod活力與陰性對(duì)照組的差異有顯著性(p＜0.01或p＜0.05)，見(jiàn)表4，表明該樣品能夠提高老齡大鼠血清和肝組織中的超氧化物歧化酶(sod)的活性。
表4各組大鼠的血清和肝組織sod活性
2.5樣品對(duì)大鼠血清及組織中谷胱甘肽(gsh)含量的影響
試驗(yàn)終末，樣品各劑量組大鼠的血清和肝組織中g(shù)sh含量均高于陰性對(duì)照組，其中高劑量組肝組織gsh含量與陰性對(duì)照組的差異具有顯著性(p<0.05)，見(jiàn)表5，表明該樣品能夠提高老齡大鼠肝組織中的谷胱甘肽(gsh)含量。
表5各組大鼠的血清和肝組織gsh含量
3小結(jié)
分別以334、167、84mg/kgbw劑量(分別相當(dāng)于人體推薦用量的20、10、5倍)的q品牌蝦青素軟膠囊給予老齡大鼠連續(xù)灌胃30天，能夠降低大鼠的血清中蛋白質(zhì)羰基的含量，提高大鼠的血清和肝組織中超氧化物歧化酶(sod)的活性，提高大鼠的肝組織中谷胱甘肽(gsh)的含量，對(duì)大鼠的體重?zé)o明顯影響，表明該樣品具有抗氧化功能。
c、q品牌蝦青素軟膠囊抗氧化功能－人體試食試驗(yàn)報(bào)告
1材料和方法
1.6樣品：由w公司送檢的q品牌蝦青素軟膠囊，規(guī)格為0.5g/粒，產(chǎn)品批號(hào)：sz20140101，置陰涼干燥處保存。人體推薦用量為每人(成人)每日2次，每次1粒。
1.7受試對(duì)象
1.2.1受試者納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡在40～65歲，身體健康狀況良好，無(wú)明顯腦、心、肝、肺、腎、血液疾患，無(wú)長(zhǎng)期服藥史，志愿受試并保證配合者。本次試驗(yàn)初始共有120位符合納入條件者志愿參加試驗(yàn)。
1.2.2受試者排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)妊娠或哺乳期婦女及對(duì)本品過(guò)敏者；(2)合并有心、腦血管、肝、腎和造血系統(tǒng)等嚴(yán)重疾病及精神病患者；(3)短期內(nèi)服用與受試功能有關(guān)的物品，影響到對(duì)結(jié)果的判斷者；(4)不符合納入標(biāo)準(zhǔn)，未按規(guī)定食用受試樣品，無(wú)法判定功效或資料不全影響功效或安全性判斷者。
3試驗(yàn)設(shè)計(jì)與分組：采用自身和組間兩種對(duì)照設(shè)計(jì)。以受試者血液丙二醛(mda)含量為主，兼顧超氧化物歧化酶(sod)和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(gsh-px)活性進(jìn)行分層，然后隨機(jī)分為試食組和對(duì)照組，每組各60人；盡可能考慮影響結(jié)果的主要因素如年齡、性別、生活飲食習(xí)慣等，進(jìn)行均衡性檢驗(yàn)，以保證組間的可比性。
4食用劑量及時(shí)間：試食組試食樣品每人每日服食2次，每次1粒，連續(xù)服用3個(gè)月，對(duì)照組采用空白對(duì)照。試驗(yàn)期間兩組人群原生活、飲食習(xí)慣不變。
5主要儀器及試劑：心電圖、x線透視機(jī)、b超掃描儀、生化分析儀、血球計(jì)數(shù)儀、血壓計(jì)等。mda、sod、gsh-px測(cè)定試劑盒均由南京建成生物工程研究所生產(chǎn)。
6觀察指標(biāo)
1.6.1安全性指標(biāo)
2.6一般情況：包括精神狀況、睡眠、飲食、大小便等，每天由受試者記錄。
2.7血常規(guī)檢查：應(yīng)用全自動(dòng)血球計(jì)數(shù)儀檢測(cè)血常規(guī)指標(biāo)，試驗(yàn)前、試驗(yàn)?zāi)└黩?yàn)一次。
2.8大、小便常規(guī)檢查：試驗(yàn)前、試驗(yàn)?zāi)└鳈z一次。
2.9血壓和肝、腎功能檢查：用血壓計(jì)測(cè)量血壓，應(yīng)用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血液主要肝、腎功能指標(biāo)，試驗(yàn)前、試驗(yàn)?zāi)└鳒y(cè)一次。
2.10胸透、心電圖、腹部b超：在試驗(yàn)開(kāi)始前進(jìn)行一次胸部透視、心電圖和腹部b超檢查。試驗(yàn)前、試驗(yàn)?zāi)└鳒y(cè)一次。
1.6.2功效性指標(biāo)
1.6.2.1過(guò)氧化脂質(zhì)含量：觀察試驗(yàn)前后mda的變化及mda下降百分率。
1.6.2.2超氧化物歧化酶活性：觀察試驗(yàn)前后sod的變化及sod升高百分率。
1.6.2.3谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性：觀察試驗(yàn)前后gsh-px的變化及gsh-px升高百分率。
1.7試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理：自身對(duì)照資料采用配對(duì)t檢驗(yàn)，兩組均數(shù)比較采用成組t檢驗(yàn)。百分率用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行檢驗(yàn)。在試驗(yàn)前兩組間比較差異無(wú)顯著性的前提下，可進(jìn)行試驗(yàn)后兩組間比較。
1.8結(jié)果判定：各功效觀察指標(biāo)試驗(yàn)前后自身比較和試食后組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，方可判定該指標(biāo)陽(yáng)性。
過(guò)氧化脂質(zhì)含量、超氧化物歧化酶活性、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性三項(xiàng)指標(biāo)中任兩項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性，可判定該受試樣品具有抗氧化功能。
2結(jié)果
2.1一般情況：試驗(yàn)中失訪7例，失訪率為5.8％，最終對(duì)照組和試食組分別56例和57例進(jìn)入有效統(tǒng)計(jì)。試食前，試食組與對(duì)照組人群的年齡、精神狀況、睡眠情況、飲食情況等基本一致；兩組人群的胸部透視、心電圖及腹部b超檢查結(jié)果均未見(jiàn)明顯異常。試食前兩組人群的血液過(guò)氧化脂質(zhì)含量、超氧化物歧化酶活性和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性比
較，均沒(méi)有明顯差異(p>0.05)，見(jiàn)表1。
表1試食前兩組人群基本情況
2.2樣品對(duì)血液過(guò)氧化脂質(zhì)含量的影響
試食前兩組人群的血液過(guò)氧化脂質(zhì)(mda)含量無(wú)明顯差異(p>0.05)。試食后，試食組的mda含量低于對(duì)照組，差異有顯著性(p<0.01)；試食組的mda含量平均下降14.96％，大于對(duì)照組的0.77％，差異有顯著性(p<0.01)；試食組的mda試驗(yàn)前后自身比較差異也有顯著性(p<0.01)，對(duì)照組前后自身比較差異則無(wú)顯著性(p>0.05)，見(jiàn)表2，
表明該樣品具有降低試食者的血液過(guò)氧化脂質(zhì)含量的作用。
表2試食前后兩組人群的血液過(guò)氧化脂質(zhì)含量變化
2.3樣品對(duì)血液超氧化物歧化酶(sod)活性的影響
試食前兩組人群的血液超氧化物歧化酶(sod)活性無(wú)明顯差異(p>0.05)。試食后，試食組人群的血液sod活性平均升高12.24％，大于對(duì)照組的0.16％，差異有顯著性(p＜0.01)；試食組的血液sod試驗(yàn)前后自身比較差異也有顯著性(p＜0.01)，對(duì)照組前后自身比較差異則無(wú)顯著性(p＞0.05)，見(jiàn)表3，表明該樣品具有升高試食者血液sod
活性的作用。
表3試食前后兩組人群的血液超氧化物歧化酶活性變化
2.4樣品對(duì)血液谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(gsh-px)活性的影響
試食前兩組人群的血液谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(gsh-px)含量無(wú)明顯差異(p＞0.05)。試食后，試食組的gsh-px活性明顯高于對(duì)照組，差異有顯著性(p＜0.05)；試食組gsh-px活性平均升高10.89％，大于對(duì)照組的0.14％，差異有顯著性(p＜0.01)；試食組gsh-px自身前后比較差異也有顯著性(p＜0.01)，對(duì)照組自身比較差異則無(wú)顯著性(p＞0.05)，見(jiàn)表4，表明該樣品具有升高試食者血液gsh-px活性的作用。
表4試食前后兩組人群的血液谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性變化
2.5樣品對(duì)安全性指標(biāo)的影響
表5試驗(yàn)前后兩組人群血壓、心率的測(cè)量結(jié)果
試食前后，兩組人群的血壓、心率均在正常范圍，試食組血壓、心率的試食前后自身前后比較和試食后的組間比較，差異均無(wú)顯著性差異(p＞0.05)，表明該樣品對(duì)受試者的血壓和心率無(wú)不良影響，見(jiàn)表5。
2.5.2樣品對(duì)尿、便常規(guī)的影響結(jié)果見(jiàn)表6和表7，試食前后，試食組與對(duì)照組人群的尿液酸堿度、透明度、顏色和尿沉渣鏡檢均未見(jiàn)異常，蛋白均為陰性。兩組的糞便顏色、性狀和鏡檢均未見(jiàn)異常，表明該樣品對(duì)受試者的大、小便常規(guī)無(wú)不良影響。
表6試驗(yàn)前后兩組人群尿常規(guī)的檢驗(yàn)結(jié)果
表7試驗(yàn)前后兩人群大便常規(guī)的檢驗(yàn)結(jié)果
2.5.3樣品對(duì)血常規(guī)的影響試食前后，試食組與對(duì)照組人群的血紅細(xì)胞數(shù)、白細(xì)胞數(shù)及血紅蛋白含量均在正
常值范圍內(nèi)，見(jiàn)表8，表明該樣品對(duì)受試者的血常規(guī)無(wú)不良影響。
表8試驗(yàn)前后兩組人群血常規(guī)的檢驗(yàn)結(jié)果
2.5.4樣品對(duì)血液生化功能指標(biāo)的影響
表9實(shí)驗(yàn)前后兩組人群血液生化指標(biāo)的檢驗(yàn)結(jié)果
從表9可見(jiàn)，試食前后，兩組人群的肝腎功能血液學(xué)指標(biāo)檢查結(jié)果均在正常值范圍內(nèi)，表明該樣品對(duì)受試者的肝、腎功能無(wú)不良影響。
2.5.5樣品的不良反應(yīng)試驗(yàn)過(guò)程中兩組志愿者均未出現(xiàn)惡心、脹氣、腹瀉及過(guò)敏等不良反應(yīng)。
3小結(jié)
1.4符合本試驗(yàn)受試入選標(biāo)準(zhǔn)的志愿者113例(對(duì)照組56例：男29例，女27例；試食組57例：男27例，女30例)。其中試食組人群連續(xù)服用q品牌蝦青素軟膠囊3個(gè)月后，血液mda含量平均下降14.96％，顯著大于對(duì)照組的0.77％(p＜0.01)，試食組自身前后比較及試食后與對(duì)照組的組間比較差異均有顯著性(p＜0.01)；試食組人群血液中sod活性平均升高12.24％，顯著大于對(duì)照組的0.16％(p＜0.01)，試食組自身前后比較差異有顯著性(p＜0.01)；試食組人群血液gsh-px活性平均升高10.89％，顯著高于對(duì)照組的0.14％(p＜0.01)，試食組自身前后比較及試食后與對(duì)照組的組間比較差異均有顯著性(p＜0.01和p＜0.05)也有顯著性差異(p＜0.05)；而對(duì)照組人群的mda、sod及gsh-px，試驗(yàn)前后自身比較均沒(méi)有顯著性差異(p＞0.05)。據(jù)此判定，該樣品具有抗氧化功能。試驗(yàn)前后，試食樣品組人群的血紅細(xì)胞數(shù)、白細(xì)胞數(shù)、血紅蛋白、大小便常規(guī)、血清總蛋白、白蛋白、谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、尿素氮、肌酐、血糖等各項(xiàng)檢查結(jié)果均在正常值范圍內(nèi)，且試驗(yàn)前后無(wú)明顯變化，表明該樣品對(duì)受試者健康無(wú)不良影響。
d、q品牌蝦青素軟膠囊增強(qiáng)免疫力功能實(shí)驗(yàn)報(bào)告
1材料和方法
1.4.1樣品：由w公司送檢的q品牌蝦青素軟膠囊，規(guī)格：0.5g/粒，產(chǎn)品批號(hào)：sz20140101，置陰涼干燥處保存。人口服推薦用量為每人(成人)每日2次，每次1粒，成人體重按60kg計(jì)算，折合劑量為16.7mg/kgbw。
1.4.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組：spf級(jí)健康昆明種雄性小鼠240只，體重為18～22克，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心繁殖，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：scxk(桂)2009-0002，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：0006739。每40只小鼠為一組，共6組。免疫i組，進(jìn)行cona誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)；免疫ⅱ組，進(jìn)行遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)實(shí)驗(yàn)；免疫ⅲ組，進(jìn)行臟/體比值測(cè)定，血清溶血素測(cè)定和抗體生成細(xì)胞數(shù)測(cè)定；免疫ⅳ～ⅵ組，分別進(jìn)行碳廓清實(shí)驗(yàn)、腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和nk細(xì)胞活性測(cè)定。
1.4.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房環(huán)境條件：動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室為屏障系統(tǒng)，使用許可證號(hào)：syxk(桂)2011-0005。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室溫度：22～25℃，相對(duì)濕度：55～70％。
1.4.4劑量選擇與受試物給予方式：根據(jù)人口服推薦用量，設(shè)樣品低、中、高劑量組分別為84、167、334mg/kgbw(分別相當(dāng)于人體推薦用量的5、10、20倍)，設(shè)一個(gè)陰性對(duì)照組，每組10只動(dòng)物。分別稱取樣品內(nèi)容物0.84、1.67、3.34g，各加玉米油至200ml，混勻、配成4.20、8.35、16.70mg/ml濃度溶液，按0.2ml/10gbw的體積給予相應(yīng)劑量組動(dòng)物灌胃，陰性對(duì)照組予以等體積的玉米油，每天灌胃一次，連續(xù)灌胃30～35天。
1.4.5主要儀器與試劑：動(dòng)物天平、電子分析天平、離心機(jī)、潔凈工作臺(tái)、二氧化碳培養(yǎng)箱、恒溫水浴箱、顯微鏡、半自動(dòng)生化分析儀、酶標(biāo)儀等。
無(wú)菌手術(shù)器械、微量注射器、細(xì)胞計(jì)數(shù)器、24孔和96孔平底細(xì)胞培養(yǎng)板、96孔u(yù)型細(xì)胞培養(yǎng)板、玻璃平皿、紗布、載玻片、試管、200目篩網(wǎng)、計(jì)時(shí)器、血色素吸管等。
rpmi1640培養(yǎng)液、小牛血清、2-me、青霉素、鏈霉素、cona、1mol/l的hcl溶液、異丙醇、mtt、hank’s液(ph7.2～7.4)、pbs緩沖液(ph7.2～7.4)、臺(tái)酚藍(lán)、dnfb、丙酮、硫化鋇、補(bǔ)體(豚鼠血清)、sa緩沖液、瓊脂糖、綿羊紅細(xì)胞(srbc)、生理鹽水、印度墨汁、0.1％的碳酸鈉、雞紅細(xì)胞、甲醇、gimsa染液、yac-1細(xì)胞、乳酸鋰、硝基氯化四氮唑、吩嗪二甲酯硫酸鹽、氧化型輔酶i、0.2mol/l的tris-hcl緩沖液、1％冰醋酸、1％的np40等。
1.4.6實(shí)驗(yàn)方法
臟器/體重比值測(cè)定：稱重后處死小鼠，取出胸腺和脾臟，在電子分析天平上稱重，計(jì)算臟/體比值。
cona誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)(mtt法)無(wú)菌取脾，置于盛有適量無(wú)菌hank’s液的平皿中，制成細(xì)胞懸液，經(jīng)200目篩網(wǎng)過(guò)濾。用hank’s液洗2次，每次離心10min(1000r/min)。然后將細(xì)胞懸浮于1ml完全培養(yǎng)液中，計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)，用rpmi1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為3×106個(gè)/ml。再將細(xì)胞懸液分兩孔加入24孔培養(yǎng)板中，每孔1ml，在其中一孔加75μlcona液(相當(dāng)于7.5μg/ml)，另一孔作為對(duì)照，置5％co2，37℃二氧化碳孵箱中培養(yǎng)72h。培養(yǎng)結(jié)束前4h，每孔輕輕吸去上清液0.7ml，加入0.7ml不含小牛血清的rpmi1640培養(yǎng)液，同時(shí)加入mtt(5mg/ml)50μl/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4h。培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入1ml酸性異丙醇，吹打混勻，使紫色結(jié)晶完全溶解。然后分裝到96孔培養(yǎng)板中，每個(gè)孔作3個(gè)平行孔，用酶標(biāo)儀，以570nm波長(zhǎng)測(cè)定光密度值。淋巴細(xì)胞的增殖能力用加cona孔的光密度值減去不加cona孔的光密度值表示。
1.6.3二硝基氟苯誘導(dǎo)的小鼠dth實(shí)驗(yàn)(耳腫脹法)
實(shí)驗(yàn)結(jié)束前5天用硫化鋇將小鼠腹部皮膚脫毛約3cm×3cm范圍，用50μldnfb溶液均勻涂抹致敏，5天后將10μldnfb均勻涂抹于小鼠右耳兩面進(jìn)行攻擊，24小時(shí)后頸椎脫臼處死小鼠，剪下左右耳殼，用打孔器取下8mm直徑的耳片、稱重，以左右耳重量之差值表示dth的程度。
1.6.4抗體生成細(xì)胞檢測(cè)(jerne改良玻片法)
取脫纖維的羊血，用生理鹽水洗滌3次，每次離心10min(2000r/min)，用生理鹽水將壓積srbc配成2％(v/v)的細(xì)胞懸液，每鼠腹腔注射0.2ml。將免疫后5天的小鼠處死，取脾臟置盛有hank’s液的平皿內(nèi)，輕輕磨碎脾臟，制成細(xì)胞懸液，經(jīng)200目篩網(wǎng)過(guò)濾，離心10min(1000r/min)，用hank’s液洗滌2遍，最后將細(xì)胞懸浮在5mlrpmi1640培養(yǎng)液中。將表層培養(yǎng)基(1g瓊脂糖加雙蒸水至100ml)加熱溶解后，放45～50℃水浴保溫，與等量ph7.2～7.4、2倍濃度的hank’s液混合，分裝小試管，每管0.5ml，再向管內(nèi)加入50μl10％srbc(v/v，用sa緩沖液配制)、25μl脾細(xì)胞懸液，迅速混勻后傾倒于已刷瓊脂糖薄層的玻片上，做平行片，待瓊脂凝固后，將玻片平扣放在玻片架上，放入二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育1.5h，用sa緩沖液稀釋的補(bǔ)體(1:8)加入玻片架凹槽內(nèi)，繼續(xù)孵育1.5h，計(jì)數(shù)溶血空斑數(shù)。用空斑數(shù)/106脾細(xì)胞表示抗體生成細(xì)胞數(shù)。
1.6.5血清溶血素的測(cè)定(血凝法)
取脫纖維的羊血，用生理鹽水洗滌3次，每次離心10min(2000r/min)，用生理鹽水將壓積srbc配成2％(v/v)的細(xì)胞懸液，每鼠腹腔注射0.2ml。免疫5天后，摘除小鼠的眼球，取血于離心管內(nèi)，放置約1h，2000r/min離心10min，分離、收集血清。用生理鹽水將血清倍比稀釋，將不同稀釋度的血清分別置于微量血凝板內(nèi)，每孔100μl，再加入100μl0.5％(v/v)的srbc懸液，混勻，裝入濕潤(rùn)的平盤內(nèi)加蓋，于37℃溫箱孵育3h，觀察血球凝集程度。按下式計(jì)算抗體積數(shù)：
抗體積數(shù)＝(s1+2s2+3s3……nsn)
式中1、2、3……n為對(duì)倍稀釋的指數(shù)，s為凝集程度的級(jí)別。1.6.6小鼠碳廓清實(shí)驗(yàn)
經(jīng)尾靜脈給小鼠注射用生理鹽水稀釋4倍的印度墨汁，每10g體重注射0.1ml，墨汁注入后立即計(jì)時(shí)，于注入墨汁后第2、10min，分別從內(nèi)眥靜脈叢取血20μl，加入到2ml0.1％na2co3溶液中，搖勻。以na2co3溶液作空白對(duì)照，以600nm波長(zhǎng)測(cè)光密度值(od)。將小鼠處死，取肝、脾臟，稱重。按下式計(jì)算吞噬指數(shù)a。
a＝k1/3×體重/(肝重+脾重)式中k＝(lgod1－lgod2)/(t2-t1)
1.6.7小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞實(shí)驗(yàn)(半體內(nèi)法)
給小鼠腹腔注射20％(v/v，用生理鹽水配制)的壓積雞紅細(xì)胞懸液，每鼠1ml，間隔30min，頸椎脫臼處死小鼠，正中剪開(kāi)腹壁皮膚，腹腔注入2ml生理鹽水，轉(zhuǎn)動(dòng)鼠板1min，吸出腹腔洗液1ml，平均滴于2片載玻片上，放入墊有濕紗布的搪瓷盒內(nèi)，置37℃孵箱溫育30min。孵畢，取出玻片于生理鹽水中漂洗后晾干，用甲醇:丙酮(1:1)溶液固定，4％(v/v)giemsa-磷酸緩沖液染色，再用純水漂洗、晾干。油鏡下每片計(jì)數(shù)100個(gè)巨噬細(xì)胞，按下式計(jì)算吞噬率和吞噬指數(shù)。
吞噬率(％)＝吞噬雞紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞數(shù)/計(jì)數(shù)的巨噬細(xì)胞數(shù)×100吞噬指數(shù)＝被吞噬的雞紅細(xì)胞總數(shù)/計(jì)數(shù)的巨噬細(xì)胞數(shù)
1.6.8nk細(xì)胞活性測(cè)定(ldh測(cè)定法)
將小鼠頸椎脫臼處死，無(wú)菌取脾，制成脾細(xì)胞懸液，用hank’s液洗2次，每次離心10min(1000r/min)。棄上清，將細(xì)胞漿彈起，加入0.5ml滅菌純水20秒，裂解紅細(xì)胞后再加入0.5ml2倍hank’s液及8mlhank’s液，1000r/min離心10min，用1ml含10％小牛血清的rpmi1640完全培養(yǎng)液重懸，用1％冰醋酸稀釋后計(jì)數(shù)(活細(xì)胞數(shù)應(yīng)在95％以上)，用臺(tái)酚蘭染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)，最后用rpmi1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為2×107個(gè)/ml，此為效應(yīng)細(xì)胞。取傳代后24h生長(zhǎng)良好的yac-1細(xì)胞，用rpmi1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為4×105個(gè)/ml，此為靶細(xì)胞。取靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞各100μl(效靶比50:1)，加入u型96孔培養(yǎng)板中；靶細(xì)胞自然釋放孔加靶細(xì)胞和培養(yǎng)液各100μl，靶細(xì)胞最大釋放孔加靶細(xì)胞和1％np40各100μl。上述各項(xiàng)各設(shè)3個(gè)平行孔，置5％co2、37℃二氧化碳孵箱中培養(yǎng)4h。然后將96孔培養(yǎng)板以1500r/min離心5min，每孔吸取上清100μl置平底96孔培養(yǎng)板中，同時(shí)加入ldh基質(zhì)液100μl，反應(yīng)8分鐘，每孔加入1mol/l的hcl30μl，在酶標(biāo)儀490nm處測(cè)定光密度(od)值。按下式計(jì)算nk細(xì)胞活性。
nk細(xì)胞活性(％)＝(反應(yīng)孔o(hù)d－自然釋放孔o(hù)d)/(最大釋放孔o(hù)d－自然釋放孔o(hù)d)×100％
實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)：應(yīng)用spss統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析統(tǒng)計(jì)處理。
1.5.5結(jié)果判定：在細(xì)胞免疫功能、體液免疫功能、單核-巨噬細(xì)胞功能、nk細(xì)胞活性四方面任兩個(gè)方面結(jié)果陽(yáng)性，可判定該受試樣品具有增強(qiáng)免疫力功能作用。
2結(jié)果
1.8樣品對(duì)小鼠體重的影響
表1q品牌蝦青素軟膠囊增強(qiáng)免疫力功能實(shí)驗(yàn)小鼠體重
表2q品牌蝦青素軟膠囊增強(qiáng)免疫力功能實(shí)驗(yàn)小鼠體重
注：免疫ii～vi組各劑量組的小鼠初始、中期和末期體重及增重與陰性對(duì)照組比較，差異均無(wú)顯著性(p＞0.05)。
由表1、表2可見(jiàn)，實(shí)驗(yàn)初、實(shí)驗(yàn)中期和實(shí)驗(yàn)?zāi)┢冢瑯悠犯鲃┝拷M的小鼠體重及實(shí)驗(yàn)期間小鼠的體重增長(zhǎng)與陰性對(duì)照組間比較，差異均無(wú)顯著性(p＞0.05)，表明該樣品對(duì)小鼠的體重增長(zhǎng)無(wú)明顯影響。
2.2樣品對(duì)小鼠免疫器官臟器/體重比值的影響
表3q品牌蝦青素軟膠囊增強(qiáng)免疫力功能實(shí)驗(yàn)小鼠的免疫器官臟器/體重比值
由表3可見(jiàn)，樣品各劑量組的小鼠胸腺/體重及脾臟/體重比值與陰性對(duì)照組比較，均無(wú)顯著性差異(p＞0.05)，表明該樣品對(duì)小鼠的免疫器官重量無(wú)明顯影響。
2.3樣品對(duì)小鼠的細(xì)胞免疫的影響
2.4樣品對(duì)cona誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力的影響
表4q品牌蝦青素軟膠囊的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果
從表4可見(jiàn)，樣品各劑量組的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力高于陰性對(duì)照組，且高劑量組與陰性對(duì)照組的差異具有顯著性(p＜0.05)，表明該樣品具有促進(jìn)小鼠的脾淋巴細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)化能力的作用。
2.3.2樣品對(duì)小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)(dth)的影響
表5q品牌蝦青素軟膠囊的小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)(dth)實(shí)驗(yàn)結(jié)果
從表5可見(jiàn)，樣品各劑量組的小鼠左右耳片重量差值高于陰性對(duì)照組，且高劑量組與陰性對(duì)照組的差異具有顯著性(p＜0.05)，表明該樣品具有促進(jìn)小鼠的遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)的作用。
2.4樣品對(duì)小鼠的體液免疫的影響
2.4.1樣品對(duì)小鼠的抗體生成細(xì)胞數(shù)的影響
表6q品牌蝦青素軟膠囊的小鼠抗體生成細(xì)胞檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果
從表6可見(jiàn)，樣品各劑量組的小鼠溶血空斑數(shù)高于陰性對(duì)照組，且高劑量組與陰性對(duì)照組的差異具有顯著性(p＜0.05)，表明該樣品具有促進(jìn)小鼠的抗體生成細(xì)胞增殖的作用。
2.4.2樣品對(duì)小鼠血清溶血素的影響
表7q品牌蝦青素軟膠囊的小鼠溶血素測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果
從表7可見(jiàn)，樣品各劑量組的小鼠抗體積數(shù)高于陰性對(duì)照組，且高、中劑量組與陰性對(duì)照組的差異具有顯著性(p＜0.01或p＜0.05)，表明該樣品具有提高小鼠的血清溶血素水平的作用。
2.5樣品對(duì)小鼠的單核-巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響
2.5.1樣品對(duì)小鼠的單核-巨噬細(xì)胞碳廓清的影響
表8q品牌蝦青素軟膠囊的小鼠單核-巨噬細(xì)胞碳廓清實(shí)驗(yàn)結(jié)果
從表8可見(jiàn)，樣品各劑量組的小鼠吞噬指數(shù)高于陰性對(duì)照組，且高劑量組與陰性對(duì)照組的差異具有顯著性(p＜0.05)，表明該樣品具有促進(jìn)小鼠的單核-巨噬細(xì)胞碳廓清功能的作用。
2.5.2樣品對(duì)小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞能力的影響
表9q品牌蝦青素軟膠囊的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果
從表9可見(jiàn)，樣品各劑量組的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞對(duì)雞紅細(xì)胞的吞噬率及吞噬指數(shù)高于陰性對(duì)照組，但各劑量組與陰性對(duì)照組的差異均無(wú)顯著性(p＞0.05)，表明該樣品無(wú)明顯促進(jìn)小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力的作用。
2.6樣品對(duì)小鼠的nk細(xì)胞活性的影響
表10q品牌蝦青素軟膠囊的小鼠nk細(xì)胞活性測(cè)定結(jié)果
從表10可見(jiàn)，樣品各劑量組的小鼠nk細(xì)胞活性與陰性對(duì)照組接近，各劑量組與陰性對(duì)照組的差異均無(wú)顯著性(p＞0.05)，表明該樣品對(duì)小鼠的nk細(xì)胞活性無(wú)明顯的促進(jìn)作用。
3小結(jié)
經(jīng)口給予小鼠84、167、334mg/kgbw(相當(dāng)于人體推薦量5、10、20倍)劑量的q品牌蝦青素軟膠囊30～35天，能促進(jìn)小鼠的細(xì)胞免疫(脾淋巴細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)化和遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng))、體液免疫(抗體生成細(xì)胞增殖和血清溶血素水平)，促進(jìn)小鼠的單核-巨噬細(xì)胞碳廓清功能，對(duì)小鼠的體重增長(zhǎng)、胸腺/體重比值、脾臟/體重比值、腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬能力和nk細(xì)胞活性無(wú)明顯影響，提示該樣品具有增強(qiáng)免疫力功能。
以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。