本發(fā)明涉及保健食品領(lǐng)域，特別涉及一種多糖組合物及其用途。

背景技術(shù)：

免疫力是人體重要的抗病能力，由免疫系統(tǒng)通過免疫應(yīng)答來執(zhí)行。機(jī)體免疫應(yīng)答根據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化、發(fā)育和免疫效應(yīng)機(jī)制特征，通常分為固有免疫應(yīng)答和適應(yīng)性免疫應(yīng)答兩類。機(jī)體免疫力的正常發(fā)揮有賴于免疫系統(tǒng)中各成分(細(xì)胞、細(xì)胞因子等)及其功能維持在一定的穩(wěn)定狀態(tài)，其中免疫細(xì)胞是核心，各種細(xì)胞因子由細(xì)胞分泌并作用于免疫細(xì)胞自身、臨近的免疫細(xì)胞和機(jī)體其他部位的細(xì)胞。參與固有免疫應(yīng)答的免疫細(xì)胞有單核巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞(NK)細(xì)胞等；其中單核吞噬細(xì)胞包括血液中的單核細(xì)胞和組織中的巨噬細(xì)胞。單核吞噬細(xì)胞是固有免疫的重要組成部分，具有吞噬作用、激活殺菌活性和抗原提呈的功能，參與維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、天然抗感染、抗腫瘤免疫。NK細(xì)胞是一群大顆粒淋巴細(xì)胞，不需要抗原激活，可以直接釋放顆粒酶、穿孔素等裂解顆粒殺死病毒感染的細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞，既參與組成機(jī)體固有免疫的第一道防線，又在免疫監(jiān)視中發(fā)揮重要作用。適應(yīng)性免疫應(yīng)答是在固有免疫應(yīng)答之后發(fā)揮效應(yīng)的，在病原體的最終清除和預(yù)防再感染中起主導(dǎo)作用，其執(zhí)行者主要是T、B淋巴細(xì)胞。根據(jù)應(yīng)答成分和功能，適應(yīng)性免疫應(yīng)答可分為體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答。體液免疫應(yīng)答主要由B細(xì)胞介導(dǎo)，B細(xì)胞受抗原刺激分化為漿細(xì)胞(在T細(xì)胞輔助下)并分泌抗體(IgG、IgA、IgM、IgD和IgE)?？贵w主要通過中和作用、激活補(bǔ)體和抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用等方式清楚胞外菌的感染以及中和細(xì)菌的外毒素。細(xì)胞免疫應(yīng)答主要由T細(xì)胞介導(dǎo)，T細(xì)胞接收抗原提呈細(xì)胞傳遞的信息后會(huì)增殖、分化為CD4⁺T細(xì)胞和CD8⁺T細(xì)胞。CD4⁺T細(xì)胞又叫輔助性T細(xì)胞，主要輔助細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CD8⁺T細(xì)胞)功能和B細(xì)胞介導(dǎo)的體液免疫功能；而CD8⁺T細(xì)胞具有和NK細(xì)胞類似的分泌細(xì)胞毒性顆粒以殺死受病毒和胞內(nèi)菌感染的細(xì)胞。

由此可見，維持機(jī)體免疫力正常是維護(hù)機(jī)體健康的必要手段。及時(shí)有效的免疫應(yīng)答能保證機(jī)體不受病原體侵害，并及時(shí)清除突變的腫瘤細(xì)胞，維持機(jī)體處于健康狀態(tài)。而一旦免疫系統(tǒng)的各成分(特別是細(xì)胞)受損，會(huì)導(dǎo)致免疫應(yīng)答異常則造成感染、腫瘤等疾病。隨著現(xiàn)代社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，競爭日趨激烈，人們的生活、工作方式和環(huán)境發(fā)生巨大改變，亞健康狀態(tài)人群所占的比例日趨升高，最新的調(diào)查顯示其發(fā)生率在17.8-60.5％，而一項(xiàng)非體力勞動(dòng)者亞健康狀況調(diào)查結(jié)果顯示其發(fā)生率高達(dá)70.33％。亞健康狀態(tài)，即處于疾病與健康之間的健康低質(zhì)狀態(tài)，研究顯示亞健康人群具有免疫力絕對(duì)低下(低于正常值)或相對(duì)低下(處于正常值下限附近)的特點(diǎn)：細(xì)胞免疫中CD3⁺T細(xì)胞、CD4⁺T細(xì)胞及CD8⁺T細(xì)胞計(jì)數(shù)或百分率減少，CD4⁺T細(xì)胞/CD8⁺T細(xì)胞比值降低；體液免疫中，占血清大多數(shù)的免疫球蛋白IgG、IgA和IgM含量絕對(duì)減少(低于正常值下限)或部分相對(duì)減少(處于正常值下限附近)；NK細(xì)胞殺傷活性相對(duì)降低；外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)偏低。亞健康狀態(tài)與機(jī)體疾病易感性(例如腫瘤的易感性、多種慢性炎癥的發(fā)生、普通感冒)密切相關(guān)，現(xiàn)有研究提示亞健康人群免疫力低下(絕對(duì)或相對(duì)低下)是造成疾病易感性風(fēng)險(xiǎn)增加的主要原因之一，因此增強(qiáng)機(jī)體免疫力功能以增強(qiáng)機(jī)體抗病能力具有必要性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明提供一種多糖組合物及其用途?？梢燥@著增強(qiáng)免疫抑制小鼠細(xì)胞免疫、體液免疫和固有免疫功能；而且該多糖組合物增強(qiáng)免疫抑制小鼠免疫力的作用與每種多糖單獨(dú)使用比較，作用更全面，效果更顯著。因此本發(fā)明的多糖組合物應(yīng)用于制備健康食品或保健食品，可以增強(qiáng)亞健人群等免疫力低下者的免疫功能。

為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供了一種組合物，由枸杞多糖、絞股藍(lán)多糖和山藥多糖組成。

在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方法中，以質(zhì)量份計(jì)，所述組合物由枸杞多糖10～30份、絞股藍(lán)多糖10～30份和山藥多糖10～30份組成。

在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方法中，所述枸杞多糖、所述絞股藍(lán)多糖和所述山藥多糖的質(zhì)量比為1:1:1、3:1:3、3:1:1或1:3:1。本發(fā)明還提供了所述組合物在制備增強(qiáng)動(dòng)物胸腺指數(shù)和/或脾指數(shù)的藥物和/或食品中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了所述組合物在制備增強(qiáng)動(dòng)物T細(xì)胞介導(dǎo)的遲發(fā)型超敏反應(yīng)的藥物和/或食品中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了所述組合物在制備增強(qiáng)動(dòng)物巨噬細(xì)胞吞噬功能和/或NK細(xì)胞殺傷活性的藥物和/或食品中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了所述組合物在制備增強(qiáng)動(dòng)物血清溶血素(抗體)和/或腸道sIgA生成水平的藥物和/或食品中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了所述組合物在制備調(diào)節(jié)細(xì)胞因子分泌水平和/或增強(qiáng)T、B淋巴細(xì)胞增殖能力的藥物和/或食品中的應(yīng)用。具體的，本發(fā)明提供了所述組合物在制備調(diào)節(jié)細(xì)胞因子IL-2、IFN-γ和TGF-β1分泌水平的藥物和/或食品中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了所述組合物在制備增強(qiáng)動(dòng)物細(xì)胞免疫功能和/或體液免疫功能的藥物和/或食品中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了所述組合物在制備增強(qiáng)動(dòng)物機(jī)體免疫力的藥物和/或食品中的應(yīng)用。

抗體在機(jī)體免疫防御中扮演著重要角色，由B細(xì)胞分化而來的漿細(xì)胞產(chǎn)生。例如，分泌型IgA(即sIgA)在消化道和呼吸道粘膜抗感染中發(fā)揮關(guān)鍵作用，可以通過與病毒、病原菌結(jié)合等方式組織這類病原體侵入宿主。而在血循環(huán)中的抗體(即本實(shí)驗(yàn)中的血清溶血素)可以與外毒素結(jié)合，從而中和其毒性；或者通過激活補(bǔ)體，發(fā)揮溶菌和溶細(xì)胞效應(yīng)；又或者通過介導(dǎo)抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC)而殺死機(jī)體受感染或癌變的細(xì)胞。如果B細(xì)胞功能降低，抗體生成減少，體液免疫介導(dǎo)的防御功能下降，就會(huì)容易導(dǎo)致各種感染性疾病。本研究發(fā)現(xiàn)，使用枸杞多糖、絞股藍(lán)多糖和山藥多糖組合物后，免疫抑制小鼠脾T、B淋巴細(xì)胞增殖能力得到恢復(fù)，血清溶血素(即血循環(huán)抗體)和腸道sIgA分泌水平顯著恢復(fù)，表明該多糖組合具有改善免疫抑制小鼠體液免疫功能的作用。

機(jī)體免疫系統(tǒng)具有的免疫監(jiān)視功能可以有效預(yù)防腫瘤的發(fā)生。NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞(特別是CD8⁺CTL細(xì)胞)都是免疫系統(tǒng)發(fā)揮監(jiān)視功能的主要細(xì)胞。NK細(xì)胞和CD8⁺CTL細(xì)胞可以通過細(xì)胞毒作用殺死癌變的細(xì)胞，而巨噬細(xì)胞既可以分泌NO、ROS等活性物質(zhì)殺傷癌細(xì)胞，也可以通過吞噬作用殺死癌細(xì)胞。上述免疫細(xì)胞功能下降，免疫系統(tǒng)監(jiān)視功能降低，容易導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。本研究發(fā)現(xiàn)，使用枸杞多糖、絞股藍(lán)多糖和山藥多糖組合物后可以顯著提高免疫抑制小鼠NK細(xì)胞殺傷活性，增強(qiáng)T細(xì)胞介導(dǎo)遲發(fā)型超敏反應(yīng)(即增強(qiáng)了T細(xì)胞功能)，并且還可以增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬功能。這些表明枸杞多糖、絞股藍(lán)多糖和山藥多糖組合物可以有效增強(qiáng)機(jī)體免疫監(jiān)視功能。

綜合實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，由枸杞多糖、絞股藍(lán)多糖和山藥多糖組成的多糖組合物能顯著提高免疫抑制小鼠的免疫力：多糖組合物可以顯著促進(jìn)免疫抑制小鼠胸腺指數(shù)和脾指數(shù)恢復(fù)，增強(qiáng)免疫抑制小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)(即細(xì)胞免疫功能)，促進(jìn)血清溶血素和sIgA生成(即體液免疫功能)，增強(qiáng)免疫抑制小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能和NK細(xì)胞殺傷活性，并且調(diào)節(jié)細(xì)胞因子分泌水平，促進(jìn)免疫抑制小鼠T細(xì)胞、B細(xì)胞增殖能力恢復(fù)。而且多糖組合物對(duì)免疫抑制小鼠免疫力的調(diào)節(jié)作用與每種多糖單獨(dú)使用比較，作用更全面，效果更顯著。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明公開了一種多糖組合物及其用途，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。

本發(fā)明的目的在于提供一種具有增強(qiáng)免疫力功能的枸杞多糖、絞股藍(lán)多糖和山藥多糖組合物。

本發(fā)明的另一目的是為枸杞多糖、絞股藍(lán)多糖、山藥多糖用于增強(qiáng)免疫力功能提供一種新的使用方法，即將枸杞多糖、絞股藍(lán)多糖、山藥多糖按一定比例組成組合物用于增強(qiáng)免疫力。

本發(fā)明所述多糖組合物的特殊之處在于它是采用枸杞多糖10-30份、絞股藍(lán)多糖10-30份、山藥多糖10-30份復(fù)配獲得。

本發(fā)明提供的由枸杞多糖、絞股藍(lán)多糖、山藥多糖組成的組合物增強(qiáng)免疫力功能的作用主要體現(xiàn)在其可以促進(jìn)免疫抑制小鼠胸腺指數(shù)和脾指數(shù)恢復(fù)，增強(qiáng)T細(xì)胞介導(dǎo)的遲發(fā)型超敏反應(yīng)，提高機(jī)體血清溶血素(抗體)和腸道sIgA生成水平，并且增強(qiáng)NK細(xì)胞殺傷活性和巨噬細(xì)胞吞噬功能，調(diào)節(jié)細(xì)胞因子IL-2、IFN-γ和TGF-β1分泌水平，增強(qiáng)T、B淋巴細(xì)胞增殖能力。

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，由枸杞多糖、絞股藍(lán)多糖和山藥多糖組成的多糖組合物能顯著提高免疫抑制小鼠的免疫力：多糖組合物可以顯著促進(jìn)免疫抑制小鼠胸腺指數(shù)和脾指數(shù)恢復(fù)，增強(qiáng)免疫抑制小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)(即細(xì)胞免疫功能)，促進(jìn)血清溶血素和sIgA生成(即體液免疫功能)，增強(qiáng)免疫抑制小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能和NK細(xì)胞殺傷活性，并且調(diào)節(jié)細(xì)胞因子分泌水平，促進(jìn)免疫抑制小鼠T細(xì)胞、B細(xì)胞增殖能力恢復(fù)。而且多糖組合物對(duì)免疫抑制小鼠免疫力的調(diào)節(jié)作用與每種多糖單獨(dú)使用比較，作用更全面，效果更顯著。

本發(fā)明提供的多糖組合物及其用途中所用原料及試劑均可由市場購得。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：

SPF級(jí)Balb/c小鼠，體重18～22g，雌雄各半，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào):SCXK(粵)2013-0002。動(dòng)物飼養(yǎng)和給予供試品皆在廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)動(dòng)物房實(shí)施，許可證號(hào):SYXK(粵)2013-0085。

供試樣品：

枸杞多糖(生產(chǎn)日期：2014年8月15日)、絞股藍(lán)多糖(生產(chǎn)日期：2014年8月15日)、山藥多糖(生產(chǎn)日期：2014年8月15日)均由無限極(中國)有限公司提供，水提醇沉法制備(干燥藥材加入14倍蒸餾水在100℃煮沸1.5h，重復(fù)兩次，合并水提液；在80℃條件下減壓濃縮水提液，然后邊攪拌邊加入4倍體積95％乙醇，靜置12h；分離沉淀，95％乙醇洗滌沉淀3次，真空冷凍干燥獲得多糖樣品)；多糖組合I組(即實(shí)施例1，按照枸杞多糖、絞股藍(lán)多糖、山藥多糖比例為1：1：1的配比獲得)、多糖組合II組(即實(shí)施例2，按照枸杞多糖、絞股藍(lán)多糖、山藥多糖比例為3：1：3的配比獲得)、多糖組合III組(即實(shí)施例3，按照枸杞多糖、絞股藍(lán)多糖、山藥多糖比例為3：1：1的配比獲得)、多糖組合IV組(即實(shí)施例4，按照枸杞多糖、絞股藍(lán)多糖、山藥多糖比例為1：3：1的配比獲得)。將上述七種多糖樣品用生理鹽水配制成多糖溶液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

主要試劑及儀器：

二硝基氟苯溶液(2,4-Dinitrofluorobenzene，DNFB)：日本東京化成工業(yè)株式會(huì)社生產(chǎn)。

環(huán)磷酰胺注射液：山西普德藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)。

熒光微球：由Life Technologies公司出品。

牛血清白蛋白(BSA)：Roche公司產(chǎn)品，以PBS配成1％的濃度，以0.22μm濾膜過濾后置4℃保存。

綿羊紅細(xì)胞(SRBC)：浙江玉環(huán)縣南方試劑廠出品。

胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)基：美國GIBICO公司產(chǎn)品。

碘化丙啶(Propidium iodide，PI)：美國Introvigen公司產(chǎn)品。

羥基熒光素二醋酸琥珀酰亞胺酯(Carboxyfluorescein succinimidylester，CFSE)：eBioscience公司生產(chǎn)。

刀豆蛋白(ConA)：Sigma公司產(chǎn)品。

MTT：Sigma公司產(chǎn)品。

二甲基亞砜(DMSO)：廣州化學(xué)試劑廠產(chǎn)品生產(chǎn)。

脂多糖(LPS)：Sigma公司產(chǎn)品。

小鼠IL-2、IFN-γ、TGF-β1、IgA ELISA試劑盒：聯(lián)科生物公司產(chǎn)品。

打孔器(直徑8mm)：北京粵申科學(xué)儀器廠。

電子分析天平：德國Sartorius產(chǎn)品，d＝0.1mg。

微量加樣器：法國GILSON公司產(chǎn)品。

MCO-20AIC型二氧化碳培養(yǎng)箱：日本SANYO公司生產(chǎn)。

WP-UP-UV-20型超純水器：四川沃特浦科技有限公司生產(chǎn)。

倒置顯微鏡：重慶奧特光學(xué)儀器有限責(zé)任公司生產(chǎn)。

SW-CJ-1D超凈工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司生產(chǎn)。

L535-R臺(tái)式冷凍離心機(jī)：湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司生產(chǎn)。

FACSCanto Ⅱ型流式細(xì)胞儀：美國BD公司生產(chǎn)。

酶標(biāo)儀：美國THERMO公司產(chǎn)品。

脫毛劑：由硫化鋇：肥皂粉：淀粉＝3∶1∶7配比，加約15-20ml水研磨呈糊狀。

YAC-1細(xì)胞：購自中山大學(xué)細(xì)胞中心。

下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明：

實(shí)施例1

稱取枸杞多糖10g，絞股藍(lán)多糖10g，山藥多糖10g，混合制得多糖組合物。

實(shí)施例2

稱取枸杞多糖30g，絞股藍(lán)多糖10g，山藥多糖30g，混合制得多糖組合物。

實(shí)施例3

稱取枸杞多糖30g，絞股藍(lán)多糖10g，山藥多糖10g，混合制得多糖組合物。

實(shí)施例4

稱取枸杞多糖10g，絞股藍(lán)多糖30g，山藥多糖30g，混合制得多糖組合物。

實(shí)施例5

動(dòng)物分組及處理：

分組：小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組(簡稱正常組)、免疫抑制模型組(簡稱模型組)、枸杞多糖組、絞股藍(lán)多糖組、山藥多糖組、多糖組合I組、多糖組合II組、多糖組合III組、多糖組合IV組。其中，多糖組合I組(即實(shí)施例1，按照枸杞多糖、絞股藍(lán)多糖、山藥多糖比例為1：1：1的配比獲得)、多糖組合II組(即實(shí)施例2，按照枸杞多糖、絞股藍(lán)多糖、山藥多糖比例為3：1：3的配比獲得)、多糖組合III組(即實(shí)施例3，按照枸杞多糖、絞股藍(lán)多糖、山藥多糖比例為3：1：1的配比獲得)、多糖組合IV組(即實(shí)施例4，按照枸杞多糖、絞股藍(lán)多糖、山藥多糖比例為1：3：1的配比獲得)。每組動(dòng)物10只。

處理：按體重灌胃給藥，每組給藥劑量為200mg/kg，每日給藥1次，連續(xù)給藥30天，正常組和模型組給予等量生理鹽水。制備免疫抑制模型時(shí)，除正常組腹腔注射生理鹽水外，其余小鼠均腹腔注射環(huán)磷酰胺(40mg/kg)，每天1次，連續(xù)2天，末次注射給藥后第5天檢測指標(biāo)。

數(shù)據(jù)分析：

所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多個(gè)組間比較采用單因素分差分析，兩組間差異比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，數(shù)據(jù)均以Mean±SD表示。

實(shí)施例6對(duì)免疫抑制小鼠胸腺指數(shù)和脾指數(shù)的影響

免疫器官指數(shù)測定：

摘取小鼠胸腺和脾臟稱重，按以下公式計(jì)算小鼠胸腺指數(shù)和脾指數(shù)：免疫器官指數(shù)(mg/10g)＝免疫器官質(zhì)量/體重×100。

結(jié)果如表1所示，與正常組比較，模型組胸腺指數(shù)和脾指數(shù)顯著降低(P<0.01)。各多糖組與模型組相比，胸腺指數(shù)及脾臟指數(shù)趨于恢復(fù)正常(P<0.05或P<0.01)，但是絞股藍(lán)多糖組、枸杞多糖組和山藥多糖組小鼠胸腺指數(shù)與脾指數(shù)與正常組的比較仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05或P<0.01)；4個(gè)多糖組合對(duì)胸腺指數(shù)和脾指數(shù)的恢復(fù)作用明顯強(qiáng)于多糖單獨(dú)使用，且4個(gè)多糖組合組的胸腺指數(shù)和脾指數(shù)與正常組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

表1多糖對(duì)免疫抑制小鼠免疫器官指數(shù)的影響(mean±SD，n＝10)

注：與正常組比較，^#P＜0.05，^##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

實(shí)施例7對(duì)小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)的影響

遲發(fā)型超敏反應(yīng)實(shí)驗(yàn)：

試驗(yàn)第25天，在小鼠右側(cè)背中部涂擦脫毛劑脫毛。試驗(yàn)第26天，用微量加樣器在脫毛部位滴涂5％DNFB溶液20μl致敏。試驗(yàn)第30天，以1％DNFB溶液20μl滴涂小鼠左耳殼(兩面)作為攻擊；右耳滴涂丙酮液20μl作為對(duì)照。試驗(yàn)第31天(攻擊后24h)，稱體重，頸椎脫臼處死小鼠，剪下左右耳殼，用打孔器取下直徑8mm的耳片，立即稱重。以左右耳片重量之差為耳廓腫脹度反映遲發(fā)型超敏反應(yīng)的強(qiáng)度。

與正常組比較，模型組耳腫脹度明顯降低(P＜0.01)。模型組比較，各多糖組耳腫脹度均升高，趨于恢復(fù)正常，與模型組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.01.)，但是絞股藍(lán)多糖組、枸杞多糖組和山藥多糖組小鼠耳腫脹度與正常組的比較仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05或P＜0.01)，而4個(gè)組合多糖組耳腫脹度恢復(fù)最明顯，與正常組比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。多糖組與單糖組相比具有顯著差異(P＜0.05)。結(jié)果見表2。

表2多糖對(duì)免疫抑制小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)的影響(mean±SD，n＝10)

注：與正常組比較，^#P＜0.05，^##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

實(shí)施例8對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響

腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)：

(1)激活巨噬細(xì)胞：實(shí)驗(yàn)第26天給每只小鼠腹腔注射2％綿羊血紅細(xì)胞0.2ml以激活小鼠巨噬細(xì)胞。

(2)制備腹腔巨噬細(xì)胞：試驗(yàn)第31天，脫臼處死小鼠，置于70％酒精中浸泡1min，小心剪開小鼠腹部皮膚，暴露腹腔壁，用一次性注射器吸取5mlDMEM培養(yǎng)液，注入腹腔，按摩約20次后，用毛細(xì)吸管吸出腹腔液體，300g離心10min，加入1ml DMEM重懸細(xì)胞，加入六孔板中。

(3)熒光微球預(yù)調(diào)理：取熒光微球溶液210μl(約1×10⁹個(gè)微球)，與10ml1％BSA37℃孵育30min，超聲波處理5min后，加入六孔板中，每孔100μl，微球約為個(gè)1×10⁷個(gè)。

(4)吞噬試驗(yàn)：巨噬細(xì)胞及熒光微球于37℃孵育1.5h，加2ml PBS沖洗后，加500μl PBS，用細(xì)胞刮收集細(xì)胞至5ml離心管中，上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

(5)流式細(xì)胞儀檢測：收集的細(xì)胞經(jīng)FSC和SSC在二維Dot-plot圖中圈出巨噬細(xì)胞區(qū)，然后對(duì)巨噬細(xì)胞作FITC熒光強(qiáng)度檢測。每份樣本獲取10000個(gè)巨噬細(xì)胞，Dioa軟件分析吞噬熒光微球的巨噬細(xì)胞的比例，根據(jù)下列公式計(jì)算吞噬百分率和吞噬指數(shù)。

吞噬百分率(％)＝吞噬熒光微球的細(xì)胞數(shù)/計(jì)數(shù)的總細(xì)胞數(shù)×100％

吞噬指數(shù)＝被吞噬熒光微球總數(shù)/計(jì)數(shù)的總細(xì)胞數(shù)×100％

與正常組比較，模型組巨噬細(xì)胞吞噬百分率、吞噬指數(shù)顯著下降(P＜0.01)。與模型組比較，各多糖組腹腔巨噬細(xì)胞吞噬熒光微球的能力增強(qiáng)，所有多糖組與模型組相比，吞噬百分率均明顯升高(P<0.05或P<0.01)，但絞股藍(lán)多糖組、枸杞多糖組和山藥多糖組的吞噬百分率與正常組比較仍然有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，而4個(gè)多糖組合組巨噬細(xì)胞吞噬百分率已恢復(fù)到正常水平。多糖組與單糖組相比具有顯著差異(P＜0.05)。在吞噬指數(shù)方面，絞股藍(lán)多糖未見顯著提高巨噬細(xì)胞吞噬指數(shù)，而枸杞多糖、山藥多糖雖均能顯著提高巨噬細(xì)胞吞噬指數(shù)，卻與正常組比較仍然具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；4個(gè)多糖組合均顯著進(jìn)巨噬細(xì)胞吞噬指數(shù)恢復(fù)，與正常組比較沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

表3多糖對(duì)免疫抑制小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響(mean±SD，n＝10)

注：與正常組比較，^#P＜0.05，^##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

實(shí)施例9對(duì)溶血素和sIgA生成的影響

溶血素生成實(shí)驗(yàn)：

試驗(yàn)第26天，各組小鼠腹腔注射2％(v/v)的SRBC懸液0.2mL進(jìn)行免疫刺激。試驗(yàn)第31天，摘除眼球取血于離心管內(nèi)，放置約1h，將凝固血與管壁剝離，使血清充分析出，2000rpm離心10min，收集血清。用生理鹽水將血清倍比稀釋，將不同稀釋度的血清分別置于微量血凝實(shí)驗(yàn)板內(nèi)，每孔100μl，再加入100μl 0.5％(v/v)的SRBC懸液，混勻，于37℃溫箱孵育3h，觀察血球凝集程度。

血清凝集程度一般分為5級(jí)(0-Ⅳ)記錄，按下式計(jì)算抗體積數(shù)，受試樣品組的抗體積數(shù)顯著高于對(duì)模型組的抗體水平，可判定該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽性?？贵w水平＝(S1+2S2+3S3……nSn)，式中1、2、3……n代表對(duì)倍稀釋的指數(shù)，S代表凝集程度的級(jí)別，抗體積數(shù)越大，表示血清抗體越高。

ELISA檢測sIgA分泌水平：

sIgA檢測：實(shí)驗(yàn)第31天，脫頸椎處死小鼠。取出全小腸段，用帶有小鼠灌胃針頭的5ml注射器向小腸內(nèi)注射3ml生理鹽水，使生理鹽水在小腸內(nèi)保留3min，輕輕晃動(dòng)使腸腔內(nèi)容物充分混勻溶解，收集小腸沖洗液，3000rpm，離心5min，收集上清液，采用ELISA檢測試劑盒檢測小腸沖洗液中sIgA的含量。

與正常組比較，模型組溶血素和腸道sIgA生成水平顯著降低(P<0.01)。各多糖均有提高小鼠溶血素生成(抗體生成)的作用，并均能提高小鼠腸道sIgA分泌水平，但絞股藍(lán)多糖組、枸杞多糖組和山藥多糖組的抗體生成水平、sIgA分泌水平與正常組的比較仍然有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05或P<0.01)，多糖組與單糖組相比具有顯著差異(P＜0.05)。4個(gè)多糖組合組作用最顯著，抗體生成水平、sIgA分泌水平與正常組的比較沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，結(jié)果見表4。

表4多糖對(duì)免疫抑制小鼠溶血素和sIgA生成的影響(mean±SD，n＝10)

注：與正常組比較，^#P＜0.05，^##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

實(shí)施例10對(duì)NK細(xì)胞殺傷活性的影響

NK細(xì)胞殺傷活性實(shí)驗(yàn)：

(1)制備效應(yīng)細(xì)胞：無菌取脾，置于盛有適量無菌Hank's液的小平皿中，用大號(hào)注射器內(nèi)芯輕輕將脾磨碎，制成單個(gè)細(xì)胞懸液。經(jīng)200目篩網(wǎng)過濾，用Hank's液洗2次，每次離心10min(1000rpm)。棄上清將細(xì)胞漿彈起，加入0.5mL滅菌超純水20s，裂解紅細(xì)胞后再加入0.5mL2倍Hank’s液及8mL Hank’s液，1000rpm，10min離心，然后將細(xì)胞懸浮于2mL的完全培養(yǎng)液中，計(jì)數(shù)脾細(xì)胞；用1mL含10％小牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)液重懸，用1％冰醋酸稀釋后臺(tái)酚蘭染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)(95％以上為活細(xì)胞)，最后用RPMI1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為5×10⁶個(gè)/mL。

(2)靶細(xì)胞培養(yǎng)：將傳代1天后生長的YAC-1細(xì)胞，用PBS調(diào)細(xì)胞濃度至2×10⁶個(gè)/ml，加入終濃度為2mol/L的熒光染料CFSE，混勻后染色10min，離心棄上清，以含有10％胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×10⁵個(gè)/ml。

(3)NK細(xì)胞活性檢測：取效應(yīng)細(xì)胞及靶細(xì)胞各100μl，加入96孔U型板內(nèi)(效靶比例為50∶1)，200g離心3min，37℃孵育2h，收集細(xì)胞至5ml離心管中，加1ml PBS，1200rpm離心10min。棄上清后，用400μl PBS重懸細(xì)胞，加15μlPI溶液，染色5min后上流式細(xì)胞儀分析。以CFSE和PI雙陽性細(xì)胞為死亡的靶細(xì)胞，計(jì)算NK細(xì)胞殺傷活性。

NK活性(％)＝(試驗(yàn)組死亡率-自然死亡率)/(100-自然死亡率)×100

結(jié)果如表5所示，與正常組比較，模型組NK細(xì)胞殺傷活性顯著降低(P<0.01)。各多糖均能提高小鼠NK細(xì)胞殺傷活性(P<0.01或P<0.05)，但絞股藍(lán)多糖組、枸杞多糖組和山藥多糖組的NK細(xì)胞活性與正常組的比較仍然有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，而4個(gè)多糖組合組與正常組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。且多糖組與單糖組相比具有顯著差異(P＜0.05)。

表5多糖對(duì)小鼠NK細(xì)胞殺傷活性的影響(mean±SD，n＝10)

注：與正常組比較，^#P＜0.05，^##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

實(shí)施例11對(duì)細(xì)胞因子分泌水平的影響

ELISA檢測細(xì)胞因子和sIgA分泌水平：

細(xì)胞因子檢測：實(shí)驗(yàn)第31天，以摘除小鼠眼球的方法采集全血，采用干凈無菌的眼科鑷子摘取小鼠一側(cè)或雙側(cè)眼球，讓血液自由滴入裝1.5ml離心管(或商品化的抗凝管)中。靜止30min后，離心取血清。采用ELISA檢測試劑盒檢測血清中TGF-β1、IL-2和IFN-γ的含量。

與正常組比較，模型組IL-2分泌顯著減少(P<0.05)，IFN-γ和TGF-β1分泌顯著增加(P<0.05)。各多糖均有促進(jìn)IL-2、IFN-γ和TGF-β1分泌趨向正常的作用，但絞股藍(lán)多糖組、枸杞多糖組和山藥多糖組的上述三個(gè)指標(biāo)與正常組的比較仍然有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，而4個(gè)多糖組合作用最顯著，與正常組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，且多糖組與單糖組相比具有顯著差異(P＜0.05)。結(jié)果見表6所示(P<0.05)。

表6多糖對(duì)免疫抑制小鼠細(xì)胞因子分泌的影響(mean±SD，n＝10)

注：與正常組比較，^#P＜0.05，^##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

實(shí)施例12對(duì)淋巴細(xì)胞增殖能力的影響

淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)：

(1)制備脾細(xì)胞：試驗(yàn)第31天，脫頸椎處死小鼠，無菌取其脾臟，常規(guī)制備脾細(xì)胞懸液，1200rpm，離心10min，收集細(xì)胞，用消毒超純水2ml裂解紅細(xì)胞，以2ml 1.8％高滲鹽水使之恢復(fù)等滲狀態(tài)。裂解紅細(xì)胞后，用PBS4ml離心洗滌淋巴細(xì)胞兩次，用1ml 10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，并用尼龍膜過濾細(xì)胞懸液，并計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)后，將細(xì)胞懸液吸出0.3ml待用。調(diào)整細(xì)胞數(shù)為2×10⁶/ml后，將細(xì)胞懸液加入細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔190μl。

(2)ConA誘導(dǎo)的T細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)：每孔細(xì)胞加入ConA使其終濃度為5μg/ml(每孔10μl)，以未加ConA孔作對(duì)照孔，并設(shè)RPMI 1640培養(yǎng)液空白對(duì)照，各樣品加板均采用3個(gè)復(fù)孔。檢測淋巴細(xì)胞增殖：細(xì)胞置5％CO₂、37℃，飽和濕度下培養(yǎng)72h，于培養(yǎng)結(jié)束前4h左右，每孔加入20μl 5mg/ml MTT，37℃，飽和濕度下培養(yǎng)4h，吸棄上清，加入150μl DMSO溶解10min。用酶標(biāo)儀以570nm波長測定每孔OD值，計(jì)算時(shí)取復(fù)孔平均值。

(3)LPS誘導(dǎo)的B細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)：加入LPS使其終濃度為20μg/ml(每孔10μl)，以未加LPS孔作對(duì)照孔，并設(shè)RPMI 1640培養(yǎng)液空白對(duì)照，各樣品加板均采用3個(gè)復(fù)孔。

刺激指數(shù)＝刺激孔OD值-空白孔OD值/對(duì)照孔OD值-空白孔OD值。

結(jié)果如表7所示，與正常組比較，模型組T細(xì)胞和B細(xì)胞增殖指數(shù)均顯著降低(P<0.01)；與模型組比較，各多糖均有促進(jìn)T、細(xì)胞增殖的作用，但絞股藍(lán)多糖組、枸杞多糖組和山藥多糖組的T、細(xì)胞增殖與正常組的比較仍然有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05或P<0.01)，多糖組與單糖組相比具有顯著差異(P＜0.05)。4個(gè)多糖組合作用效果最明顯，T、B細(xì)胞增殖指數(shù)與正常組比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

表7多糖對(duì)免疫抑制小鼠淋巴細(xì)胞增殖能力的影響(mean±SD，n＝10)

注：與正常組比較，^#P＜0.05，^##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。