本發(fā)明屬涉及一種高純度生物防腐劑，具體涉及一種高純?nèi)樗徭溓蚓厝芤旱纳a(chǎn)方法。

背景技術(shù)：

乳酸鏈球菌素是一種高分子多肽，它的分子式為C₁₄₃H₂₂₈N₄₂O₃₇S₇，由34個(gè)氨基酸組成，英文名為Nisin，Nisin在酸性條件下極為穩(wěn)定，pH為2.0條件下可耐受高溫處理(12l℃，15min)，無(wú)活力損失，而在中性或堿性條件下即發(fā)生失活。乳酸鏈球菌素能有效地殺死或抑制引起食品腐敗變質(zhì)的革蘭氏陽(yáng)性菌，特別是細(xì)菌孢子，如葡萄球菌、鏈球菌、乳桿菌、小球菌、明串珠菌、芽抱桿菌等均對(duì)乳酸鏈球菌素很敏感。乳酸鏈球菌素作為一種天然、無(wú)毒的防腐劑，在食品工業(yè)中的應(yīng)用相當(dāng)廣泛，如乳制品、肉制品、釀酒、果汁飲料、焙烤食品等。

日益受重視的食品安全問(wèn)題，使得消費(fèi)者傾向于摒棄不了解的或含化學(xué)添加劑的食品，青睞諸如天然，新鮮，綠色有機(jī)，少雜蛋白，少鹽，以及無(wú)過(guò)敏原或非轉(zhuǎn)基因等清潔標(biāo)簽的食品?，F(xiàn)有技術(shù)中要么提純率低，要么采用化學(xué)提純方法提純獲得較高純度的乳酸鏈球菌素，不符合消費(fèi)者的需求。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)中的不足，本發(fā)明提供了一種使產(chǎn)品更純、更清潔綠色的高純?nèi)樗徭溓蚓厝芤旱纳a(chǎn)方法。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案：

一種高純?nèi)樗徭溓蚓厝芤旱纳a(chǎn)方法，包括如下步驟：

S1、取市售的乳酸鏈球菌素粗粉溶于有機(jī)酸溶液中；

S2、攪拌靜止，置于離心萃取機(jī)中離心分層，除去雜蛋白和粗漿，取粗品溶液——乳酸鏈球菌素層；

S3、接著對(duì)S2中所得的乳酸鏈球菌素層利用柱層析進(jìn)行純化除雜，干燥后得到純度為50％～100％的乳酸鏈球菌素粉；

S4、接著對(duì)S3中所得的乳酸鏈球菌素粉加入有機(jī)酸溶液后，得到清澈透明的高純?nèi)樗徭溓蚓厝芤骸?/p>

優(yōu)選的，步驟S1中，所述有機(jī)酸溶液的PH控制為3～6。

進(jìn)一步的，步驟S1中，所述有機(jī)酸溶液為羧酸類(lèi)。

優(yōu)選的，步驟S1中，所述有機(jī)酸的體積與粗粉的質(zhì)量比為(5～10):1，單位為ml/mg。

優(yōu)選的，步驟S3中，取50L S2所得的粗品溶液至體積為150L的層析柱中用S1中的有機(jī)酸溶液上樣，采用0.2～2mol/L的鹽溶液作為洗脫液梯度洗脫1小時(shí)進(jìn)行柱層析，洗脫速率為1ml/min，回收干燥得到純度為50％～100％的乳酸鏈球菌素純粉。

進(jìn)一步的，步驟S3中，柱層析進(jìn)行65分鐘之后，回收干燥得到純度為99％及以上的乳酸鏈球菌素純粉。

優(yōu)選的，步驟S4中，有機(jī)酸溶液采用乳酸溶液、丙酸溶液或發(fā)酵糖醋溶液中的任一種；當(dāng)采用發(fā)酵糖醋溶液時(shí)，S3中所得的乳酸鏈球菌素粉加入脫色后的發(fā)酵糖醋中。

進(jìn)一步的，步驟S4中，發(fā)酵糖醋溶液以玉米、甘蔗或甜菜的天然材料作為培養(yǎng)基、以益生菌為菌種發(fā)酵而成。

進(jìn)一步的，步驟S4中，所述益生菌采用凝結(jié)芽孢桿菌、丙酸桿菌和副干酪乳桿菌。

優(yōu)選的，步驟S4中，采用活性炭或膨潤(rùn)土進(jìn)行脫色。

本發(fā)明的有益效果在于：

1)、本發(fā)明提供的方法簡(jiǎn)單，將經(jīng)過(guò)柱層析得到的純度為50％～100％的乳酸鏈球菌素粉溶于有機(jī)酸(乳酸溶液、丙酸溶液或發(fā)酵糖醋溶液)中均可制備得到高純?nèi)樗徭溓蚓厍逡?；?dāng)符合消費(fèi)者對(duì)天然，清新，綠色有機(jī)，少雜蛋白，少鹽，以及無(wú)過(guò)敏原或非轉(zhuǎn)基因等清潔標(biāo)簽的青睞。

2)、本發(fā)明方法可獲得高純?nèi)樗徭溓蚓厍逡?，通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明其具有集束的抑菌活性和強(qiáng)有力的擴(kuò)散度，能夠高效抑制革蘭氏陽(yáng)性菌生長(zhǎng)，預(yù)防腫瘤，增強(qiáng)食品品質(zhì)和保質(zhì)期；同時(shí)，本發(fā)明方法獲得的高純?nèi)樗徭溓蚓厍逡呵宄和该?，使用量低，不影響食品原有色澤和風(fēng)味，適合高品質(zhì)的綠色食品。

3)、本發(fā)明方法獲得的高純?nèi)樗徭溓蚓厍逡涸谒锌勺o(hù)色，穩(wěn)定花青素，具有酸化作用；在透明飲料中，由于其澄清的特性和超強(qiáng)的孢子抑菌效果，更顯示了其無(wú)與倫比的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)。

4)、國(guó)內(nèi)普通的乳酸鏈球菌素具有如下的劣勢(shì)：含有氯化鈉及對(duì)人體存在潛在風(fēng)險(xiǎn)的雜蛋白；抑制革蘭氏陽(yáng)性菌的功效受脂肪及乳化劑的影響；并且加入后會(huì)溶液渾濁，溶液底部會(huì)出現(xiàn)明顯的沉淀；而本發(fā)明方法獲得的高純?nèi)樗徭溓蚓厍逡簬缀醪缓s蛋白和氯化鈉雜質(zhì)，是純天然乳酸鏈球菌素清液；對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的抑制效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)普通乳酸鏈球菌素，對(duì)革蘭氏陰性菌的抑制效果更強(qiáng)，且更少受脂肪及乳化劑的影響；并且溶液澄清，口感無(wú)味。

5)、綜上所述，本發(fā)明方法獲得的產(chǎn)品具有更安全健康的配料，具有更高的貨架期保護(hù)，成本性?xún)r(jià)比也更高；并能夠保持產(chǎn)品原有的色澤口感，具有非常大的應(yīng)用市場(chǎng)，適合工業(yè)生產(chǎn)。

附圖說(shuō)明

圖1、2為本發(fā)明應(yīng)用在再制乳酪中的試驗(yàn)結(jié)果圖。

圖3為本發(fā)明應(yīng)用在蘋(píng)果汁中的試驗(yàn)結(jié)果圖。

圖4為本發(fā)明應(yīng)用在蘋(píng)果汁中的溶液狀態(tài)圖。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例中的附圖，對(duì)本發(fā)明中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述。以下實(shí)施例僅用于更加清楚地說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案，而不能以此來(lái)限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。

一種高純?nèi)樗徭溓蚓厝芤旱纳a(chǎn)方法，包括如下步驟：

S1、取市售的乳酸鏈球菌素粗粉溶于有機(jī)酸溶液中，有機(jī)酸溶液的PH控制為3～6；

S2、攪拌靜止，置于離心萃取機(jī)中離心分層，除去雜蛋白和粗漿，取粗品溶液——乳酸鏈球菌素層；

S3、接著對(duì)S2中所得的乳酸鏈球菌素層利用柱層析進(jìn)行純化除雜，干燥后得到純度為50％～100％的乳酸鏈球菌素粉；

S4、接著對(duì)S3中所得的乳酸鏈球菌素粉加入有機(jī)酸溶液后，得到清澈透明的高純?nèi)樗徭溓蚓厝芤骸?/p>

步驟S1中，所述有機(jī)酸溶液為羧酸類(lèi)，其中，所述有機(jī)酸的體積與粗粉的質(zhì)量比為(5～10):1，單位為ml/mg。

步驟S3中，取50L S2所得的粗品溶液至體積為150L的層析柱中用S1中的有機(jī)酸溶液上樣，采用0.2～2mol/L的鹽溶液作為洗脫液梯度洗脫1小時(shí)進(jìn)行柱層析，洗脫速率為1ml/min，回收干燥得到純度為50％～100％的乳酸鏈球菌素純粉。其中，當(dāng)柱層析進(jìn)行65分鐘之后，回收干燥得到純度為99％及以上的乳酸鏈球菌素純粉。

步驟S4中，有機(jī)酸溶液采用乳酸溶液，丙酸溶液或發(fā)酵糖醋溶液；；當(dāng)采用發(fā)酵糖醋溶液時(shí)，S3中所得的乳酸鏈球菌素粉加入脫色后的發(fā)酵糖醋中。其中，發(fā)酵糖醋溶液以玉米、甘蔗或甜菜的天然材料作為培養(yǎng)基、以益生菌為菌種發(fā)酵而成；所述益生菌采用凝結(jié)芽孢桿菌、丙酸桿菌和副干酪乳桿菌。

步驟S4中，采用傳統(tǒng)的液體脫色技術(shù)比如活性炭或膨潤(rùn)土對(duì)褐色的溶液進(jìn)行脫色，得到清澈透明的高純?nèi)樗徭溓蚓厝芤骸?/p>

其中，步驟S4中，所述發(fā)酵糖醋的加工方法，包括如下步驟：

S1、蒸煮糊化：以玉米為原料，進(jìn)行蒸煮糊化，其蒸煮的溫度為100～120℃，取出冷卻到25～35℃；

S2、發(fā)酵培養(yǎng)基的制備：以g/L計(jì)，上述蒸煮糊化的原料40，酵母膏1～5，酵母蛋白胨1～5，精制玉米糖漿10～25，K₂HPO₄ 5～10，NH₃·H₂O 0.3～0.6，Ca(OH)₂ 0.02～0.025，按0.2％～0.5％比例拌入凝固芽孢桿菌，且每隔8～10h補(bǔ)加一次原料；

S3、用去離子水配料，配制好培養(yǎng)基后經(jīng)過(guò)過(guò)濾器去除大顆粒雜質(zhì)后，倒入發(fā)酵罐中，進(jìn)行120℃、30min的高溫滅菌，降溫至25～30℃；加入進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，過(guò)程中流加淀粉水解糖15～25g/L，發(fā)酵周期為5天，得酒精發(fā)酵液；

S4、接著，調(diào)配到酒精度在8°～9°之間，泵入下一級(jí)發(fā)酵罐進(jìn)入醋酸發(fā)酵階段，加入醋酸菌和副干酪乳桿菌、丙酸桿菌協(xié)同發(fā)酵，溫度控制在35℃～45℃之間，得到最終發(fā)酵液；

S5、將上述發(fā)酵液進(jìn)行濃縮，過(guò)濾，分離，制得發(fā)酵玉米糖醋。

將原料玉米換成甜菜或甘蔗也可得到相應(yīng)的發(fā)酵糖醋。

其中，丙酸桿菌采用經(jīng)鑒定為生物安全級(jí)別(GRAS)的菌種產(chǎn)丙酸丙酸桿菌。所述丙酸桿菌和副干酪乳桿菌的用量比為1：(2～4)。

本發(fā)明生產(chǎn)所用有機(jī)原料淀粉水解糖采用葡萄糖、酵母膏來(lái)自釀酒酵母浸提物、酵母蛋白胨來(lái)自釀酒酵母細(xì)胞、精制糖漿來(lái)自淀粉加工副產(chǎn)物，均為天然來(lái)源，無(wú)石化來(lái)源的成分。

應(yīng)用例1

再制乳酪

蠟樣芽孢桿菌和酪酸梭菌導(dǎo)致的“起泡”是引起再制乳酪變質(zhì)的主因。將上述實(shí)施例得到的高純?nèi)樗徭溓蚓厍逡簯?yīng)用在再制乳酪中。在PH5.4,105℃下作用10分鐘之后，對(duì)蠟樣芽孢桿菌和酪酸梭菌的含量分別進(jìn)行監(jiān)測(cè)，試驗(yàn)結(jié)果分別如圖1、2所示，控制組作為參照未添加任何物質(zhì)，表明，添加高純?nèi)樗徭溓蚓厍逡耗茱@著的抑制這些細(xì)菌的生長(zhǎng)，延長(zhǎng)保質(zhì)期。且在一定范圍內(nèi)，加入的量越多，抑制效果更明顯。

應(yīng)用例2

鮮榨蘋(píng)果汁

導(dǎo)致新鮮蘋(píng)果汁變味的主要腐敗菌為酸土環(huán)脂芽孢桿菌。在常溫下的新鮮蘋(píng)果汁中分別加入普通乳酸鏈球菌素和本發(fā)明產(chǎn)品(高純?nèi)樗徭溓蚓厍逡?，試驗(yàn)結(jié)果如圖3、4所示，對(duì)照組作為參照未添加任何物質(zhì)，圖3表明僅1/4的本產(chǎn)品比普通乳酸鏈球菌素能更高效的抑制酸土環(huán)脂芽孢桿菌，使蘋(píng)果汁保鮮期大幅提高，且溶液澄清。圖4表明添加本發(fā)明產(chǎn)品的鮮榨蘋(píng)果汁始終保持著透明的溶液，相反，隨著時(shí)間的推移，普通乳酸鏈球菌素逐漸沉淀到瓶底，伴隨其包含的雜蛋白很有可能導(dǎo)致新鮮蘋(píng)果汁產(chǎn)生漂浮的云團(tuán)，減少貨架期。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選應(yīng)用實(shí)施例，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和變形，這些改進(jìn)和變形也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。