本發(fā)明屬于動(dòng)物飼料領(lǐng)域，具體涉及一種用于水產(chǎn)動(dòng)物飼料的益生菌組合物及其制備方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展過程中存在片面追求產(chǎn)量，不重視質(zhì)量、安全、環(huán)境和持續(xù)發(fā)展等問題，導(dǎo)致出現(xiàn)濫用和錯(cuò)用水產(chǎn)飼料添加劑情況，引起一系列消費(fèi)者關(guān)注的水產(chǎn)品安全事件。另外，我國規(guī)模化’高密度水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展，工業(yè)廢水和生活污水的大量排放，使養(yǎng)殖生態(tài)環(huán)境遭到嚴(yán)重破壞，導(dǎo)致養(yǎng)殖病害頻繁發(fā)生。目前最主要的疾病防治方法是使用化學(xué)藥物，但使用不當(dāng)會(huì)使病原微生物產(chǎn)生抗藥性，并會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物體的免疫功能降低，產(chǎn)品中的藥物殘留和養(yǎng)殖水體的藥物污染也嚴(yán)重威脅著水產(chǎn)品消費(fèi)者——人類的健康與安全。這也提示水產(chǎn)飼料從業(yè)者，可以考慮從營養(yǎng)學(xué)的角度，使用改善魚體腸道菌群功能的添加劑代替無序使用化學(xué)藥物，來解決類似藥殘和水產(chǎn)品安全問題。大量試驗(yàn)證實(shí)，益生菌組合物添加劑能夠促進(jìn)水產(chǎn)動(dòng)物攝食和生長，提高餌料轉(zhuǎn)化率，增強(qiáng)水產(chǎn)動(dòng)物體質(zhì)，降低發(fā)病率和死亡率等。并且益生菌組合物添加劑作為綠色飼料添加劑具備無毒副作用，無藥物和有害物質(zhì)在畜產(chǎn)品中殘留，對人類生存環(huán)境不構(gòu)成潛在污染危害以及其能為養(yǎng)殖業(yè)生產(chǎn)綠色水產(chǎn)品帶來巨大的經(jīng)濟(jì)效益的優(yōu)點(diǎn)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：有鑒于此，為克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種用于水產(chǎn)動(dòng)物飼料的益生菌組合物，該組合物能夠有效促進(jìn)水產(chǎn)動(dòng)物攝食和生長，提高餌料轉(zhuǎn)化率，增強(qiáng)水產(chǎn)動(dòng)物體質(zhì)，降低發(fā)病率和死亡率等。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的用于水產(chǎn)動(dòng)物飼料的益生菌組合物，其特征在于：包含如下按質(zhì)量百分比計(jì)的組分：益生菌干粉55～70％，低聚果糖粉10～15％、低聚木糖粉10～15％、大豆低聚糖粉10～15％。作為優(yōu)選方案，該益生菌組合物包含如下按質(zhì)量百分比計(jì)的組分：益生菌干粉65％，低聚果糖粉10％、低聚木糖粉10％、大豆低聚糖粉15％。進(jìn)一步地，所述益生菌干粉由枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、乳桿菌按質(zhì)量比為1:1:1的比例組成。本發(fā)明的另一目的在于提供上述用于水產(chǎn)動(dòng)物飼料的益生菌組合物的制備方法。為實(shí)現(xiàn)該目的，本發(fā)明提供的制備用于水產(chǎn)動(dòng)物飼料的益生菌組合物的方法，其特征在于：它包含如下步驟：(1)選料：選取含有枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、乳桿菌的益生菌干粉，低聚果糖粉、低聚木糖粉、大豆低聚糖粉；(2)過篩：將選好的益生菌干粉、低聚果糖粉、低聚木糖粉、大豆低聚糖粉分別過80～100目篩；(3)配料：將過篩后的益生菌干粉、低聚果糖粉、低聚木糖粉、大豆低聚糖粉稱量備用；所述各組分質(zhì)量百分比為益生菌干粉55～70％，低聚果糖粉10～15％、低聚木糖粉10～15％、大豆低聚糖粉10～15％；(4)混合：將配好的原料于三維混合機(jī)中混合至色澤均勻一致，無色差，即得到用于水產(chǎn)動(dòng)物飼料的益生菌組合物。進(jìn)一步地，所述益生菌干粉制備方法步驟如下：1)分別將枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、乳桿菌經(jīng)培養(yǎng)基活化后，接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)，使菌體濃度達(dá)到對數(shù)生長期0.5～1.0×109cfu/ml；2)將步驟1)中各菌種發(fā)酵液混合后離心，棄上清，菌體沉淀洗滌，離心，滅菌，得菌泥；3)配制干粉保護(hù)劑；所述干粉保護(hù)劑的配方組成為：β-環(huán)狀糊精10g、乳糖2-5g、海藻糖0.5-2g、酵母膏0.5-2g、維生素E0.05-0.1g、蒸餾水100mL；4)將干粉保護(hù)劑和菌泥混合，進(jìn)行成膜反應(yīng)，然后將混合物預(yù)凍，再冷凍干燥，制成具有包埋層的活性益生菌干粉。本發(fā)明的再一目的在于提供上述用于水產(chǎn)動(dòng)物飼料的益生菌組合物在制備水產(chǎn)動(dòng)物飼料中的應(yīng)用。本發(fā)明所述的水產(chǎn)動(dòng)物飼料，它包含上述的用于水產(chǎn)動(dòng)物飼料的益生菌組合物。低聚果糖又稱蔗果低聚糖，是由1～3個(gè)果糖基通過β(2—1)糖苷鍵與蔗糖中的果糖基結(jié)合生成的蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖等的混合物。100克干重菊芋中約有60—70克菊粉，菊粉是通過線性的β—2，1—糖苷鏈連接的果聚糖，其末端為一蔗糖基。故以菊芋粉為原料用菊糖內(nèi)切酶水解作用，經(jīng)精制最終可得低聚果糖漿。是具有調(diào)節(jié)腸道菌群，增殖雙歧桿菌，促進(jìn)鈣的吸收，調(diào)節(jié)血脂，免疫調(diào)節(jié)，抗齲齒等保健功能的新型甜味劑，被譽(yù)為繼抗生素時(shí)代后最具潛力的新一代添加劑——促生物質(zhì)。低聚木糖又稱木寡糖，是由2-7個(gè)木糖分子以β-1,4糖苷鍵結(jié)合而成的功能性聚合糖。與通常人們所用的大豆低聚糖、低聚果糖、低聚異麥芽糖等相比具有獨(dú)特的優(yōu)勢，它可以選擇性地促進(jìn)腸道雙歧桿菌的增殖活性。其雙歧因子功能是其它聚合糖類的10-20倍。低聚木糖是聚合糖類中增殖雙歧桿菌功能最強(qiáng)的品種之一，它的功效性是其他聚合糖類的近20倍，促進(jìn)雙歧桿菌增殖同時(shí)產(chǎn)生多種有機(jī)酸。降低腸道PH值，抑制有害菌生長，使益生菌在腸道大量增殖。大豆低聚糖是指其分子結(jié)構(gòu)由2～10個(gè)單糖分子以糖苷鍵相連接而形成的糖類總稱。分子量300～2000，界于單糖(葡萄糖、果糖、半乳糖)和多糖(纖維、淀粉)之間，又有二糖、三糖、四糖之分。作為"特定保健用食品"的低聚糖是指具有特殊生物學(xué)功能，特別有益于胃腸健康的一類低聚糖，故又稱"功能性低聚糖"。大豆低聚糖是大豆中可溶性糖質(zhì)的總稱。主要成分是指單糖數(shù)為3～4的蔗糖(雙糖)、棉子糖(三糖)和水蘇糖(四糖)等。其主要功效是將糖類分解為乙酸、乳酸和一些抗生素類物質(zhì)，從而抑制有害菌的生長。大豆低聚糖是雙歧桿菌增殖的食料，而其他有害菌幾乎不能利用低聚糖，因此，可以阻止致病菌的定居和繁殖。本發(fā)明中使用的低聚果糖粉、低聚木糖粉、大豆低聚糖粉均已在市場上廣泛應(yīng)用，各種寡聚糖的制備是已有的技術(shù)，得到的產(chǎn)品只是在物質(zhì)濃度上有所差別，其各種產(chǎn)品均可在本發(fā)明中實(shí)施應(yīng)用。低聚果糖、低聚木糖、大豆低聚糖這些寡聚糖的作用機(jī)理，主要表現(xiàn)在3個(gè)方面：促進(jìn)機(jī)體腸道內(nèi)健康菌相的形成；結(jié)合、吸收外源性病原菌；調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫系統(tǒng)；因寡聚糖耐高溫、耐胃酸等，使其應(yīng)用性更為廣泛，在粉料、顆粒料和膨化料中均可使用。寡聚糖中的有效成分在進(jìn)入腸道之后不可避免地與腸道菌群發(fā)生關(guān)聯(lián)，某些成分經(jīng)相應(yīng)細(xì)菌的作用發(fā)生生物轉(zhuǎn)化后被吸收，因此，體內(nèi)環(huán)境中腸道菌群是完成寡聚糖有效成分生物轉(zhuǎn)化的重要因素之一。有益菌和寡聚糖是兩類國際公認(rèn)的益生物質(zhì)，兩者在基本理論觀點(diǎn)上極為相似、一脈相通；在作用機(jī)理上顯示極大的統(tǒng)一性；在具體使用過程中也能完美互補(bǔ)，共同發(fā)揮優(yōu)勢。因而寡聚糖對于有益菌而言，是絕佳的益生元。本發(fā)明將益生菌與寡聚糖完美結(jié)合，找出了可以用于水產(chǎn)動(dòng)物飼料的益生菌組合物配方。本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明的益生菌組合物以益生菌干粉、低聚果糖粉、低聚木糖粉、大豆低聚糖粉為原料直接投料，按重量科學(xué)配比而成。其含有維生素K，維生素B12、吡哆醇、生物素、葉酸、煙酸和硫胺素等營養(yǎng)成分，制備工藝簡單，避免了提取時(shí)造成的藥物損失和由于原藥材質(zhì)量差異造成的不同產(chǎn)品質(zhì)量差異較大的缺點(diǎn)，使產(chǎn)品純度更高，雜質(zhì)少，安全性更高，且不同批次間質(zhì)量差異小，質(zhì)量更均勻穩(wěn)定。通過寡聚糖與益生菌合理配比，經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，用于水產(chǎn)動(dòng)物飼料的效果優(yōu)于單獨(dú)使用任何一種原料。【具體實(shí)施方式】為了更好地理解本發(fā)明，以下將結(jié)合具體實(shí)例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的說明。本發(fā)明中益生菌干粉可以通過購買上市的原料或自行摸索制備工藝的方式獲得，本發(fā)明對所選的益生菌干粉的制備工藝進(jìn)行了優(yōu)選；所述的益生菌干粉制備方法步驟優(yōu)選如下：1)分別將枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、乳桿菌經(jīng)培養(yǎng)基活化后，接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)，使菌體濃度達(dá)到對數(shù)生長期0.5～1.0×109cfu/ml；2)將各菌種發(fā)酵液混合后離心，棄上清，菌體沉淀洗滌，離心，滅菌，得菌泥；3)配制干粉保護(hù)劑；4)將干粉保護(hù)劑和菌泥混合，進(jìn)行成膜反應(yīng)，然后，將混合物預(yù)凍，再冷凍干燥，制成具有包埋層的活性益生菌干粉；其中，步驟1)所述的乳桿菌為保加利亞乳桿菌、德氏乳桿菌乳亞種和嗜酸乳桿菌中的至少兩種等比例混合菌，優(yōu)選保加利亞乳桿菌、嗜酸乳桿菌兩種等比例混合菌。其中，步驟3)所述的干粉保護(hù)劑的配方組成為：β-環(huán)狀糊精10g、乳糖2-5g、海藻糖0.5-2g、酵母膏0.5-2g、維生素E0.05-0.1g、蒸餾水100mL。芽孢桿菌種子液的制備：取出菌種保藏管，用LB固體培養(yǎng)基劃平板進(jìn)行復(fù)蘇，37度培養(yǎng)48小時(shí)。在平板下挑取單個(gè)菌落接種50毫升LB培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)箱中37度震蕩培養(yǎng)24小時(shí)。種子采用5％的接種量，接種至5L大三角瓶中(裝液量為2L)，37度震蕩培養(yǎng)小時(shí)，檢測其菌液濃度，芽孢含量超過60億/毫升，即可作為納豆芽孢桿菌液體菌種接種。其中所述LB培養(yǎng)基：蛋白胨5g，牛肉膏3g，氯化鈉5g，水1000mL，pH7.2，固體培養(yǎng)基中加入瓊脂2％。其中所述納豆芽孢桿菌液體菌種培養(yǎng)基：葡萄糖10g/L，玉米粉8g/L，豆粕粉25g/L，硫酸鎂0.5g/L，硫酸錳0.5g/L，磷酸二氫鈉0.5g/L，磷酸氫二鈉2.3g/L，pH7.2。各培養(yǎng)基滅菌的條件為：121℃滅菌30分鐘。乳桿菌種子液的制備：取出菌種保藏管，用MRS固體培養(yǎng)基劃平板進(jìn)行復(fù)蘇，37度厭氧培養(yǎng)48小時(shí)。在平板下挑取單個(gè)菌落接種250毫升MRS培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)箱中37度厭氧培養(yǎng)24小時(shí)。種子采用5％的接種量，接種至10L大三角瓶中(裝液量為9L)，37度厭氧培養(yǎng)20-28小時(shí)，檢測其菌液濃度，菌含量超過100億/毫升，即可作為乳桿菌液體菌種接種。其中所述的MRS培養(yǎng)基：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，牛肉膏10g/L，葡萄糖20g/L，醋酸鈉5g/L，檸檬酸二銨2g/L，吐溫-801ml/L，硫酸鎂0.6g/L，硫酸錳0.05g/L，磷酸氫二鉀2g/L，瓊脂20g/L，碳酸鈣20g/L，固體培養(yǎng)基中加入瓊脂2％。其中所述的乳酸菌種子培養(yǎng)基：葡萄糖5％，蛋白胨1.5％，牛肉膏0.75％，氯化鈉0.1％，硫酸錳0.001％，硫酸鎂0.02％，醋酸鈉0.05％，碳酸鈣1％，pH6.0。各培養(yǎng)基滅菌的條件為：0.10-0.15MPa，121℃滅菌30分鐘。具體實(shí)施例如下：實(shí)施例1(1)選料制備益生菌干粉：1)分別將枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、乳桿菌經(jīng)培養(yǎng)基活化后，接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)，使菌體濃度達(dá)到對數(shù)生長期0.5～1.0×109cfu/ml；2)將各菌種發(fā)酵液混合后離心，棄上清，菌體沉淀洗滌，離心，滅菌，得菌泥；3)配制干粉保護(hù)劑；4)將干粉保護(hù)劑和菌泥混合，進(jìn)行成膜反應(yīng)，然后，將混合物預(yù)凍，再冷凍干燥，制成具有包埋層的活性益生菌干粉；低聚果糖粉、低聚木糖粉、大豆低聚糖粉均購自西安天一生物技術(shù)有限公司。(2)過篩將步驟(1)中的益生菌干粉、低聚果糖粉、低聚木糖粉、大豆低聚糖粉分別過80～100目篩。(3)配料稱量過篩后的原料，按益生菌干粉65％、低聚果糖粉10％、低聚木糖粉10％、大豆低聚糖粉15％配料，以上含量均為重量百分比含量。(4)混合將配好的益生菌干粉、低聚果糖粉、低聚木糖粉、大豆低聚糖粉于三維混合機(jī)中混合至色澤均勻一致，無色差，即得到用于水產(chǎn)動(dòng)物飼料的益生菌組合物。實(shí)施例2具體步驟同實(shí)施例1，不同之處在于：步驟(3)中配料：稱量過篩后的原料，按益生菌干粉55％、低聚果糖粉15％、低聚木糖粉15％、大豆低聚糖粉15％配料，以上含量均為重量百分比含量。實(shí)施例3具體步驟同實(shí)施例1，不同之處在于：步驟(3)中配料：稱量過篩后的原料，按益生菌干粉60％、低聚果糖粉10％、低聚木糖粉15％、大豆低聚糖粉15％配料，以上含量均為重量百分比含量。實(shí)施例4具體步驟同實(shí)施例1，不同之處在于：步驟(3)中配料：稱量過篩后的原料，按益生菌干粉70％、低聚果糖粉10％、低聚木糖粉10％、大豆低聚糖粉10％配料，以上含量均為重量百分比含量。實(shí)施例5具體步驟同實(shí)施例1，不同之處在于：步驟(3)中配料：稱量過篩后的原料，按益生菌干粉65％、低聚果糖粉11％、低聚木糖粉11％、大豆低聚糖粉13％配料，以上含量均為重量百分比含量。實(shí)驗(yàn)例1用于水產(chǎn)動(dòng)物飼料的益生菌組合物對鯽魚生長性能的影響(1)鯽魚模型的建立實(shí)驗(yàn)用鯽魚購于武漢市漁場,體態(tài)正常,健康無病,每尾鯽魚平均體重為(15士0.5)g。購后置于武漢大學(xué)水產(chǎn)養(yǎng)殖溫室的12個(gè)玻璃水族箱(50cmx50cmx80cm)飼養(yǎng)。(2)分組與給藥將240尾暫養(yǎng)后的鯽魚隨機(jī)分成空白對照A組和試驗(yàn)B、C、D組四個(gè)組,分別飼喂基礎(chǔ)日糧和試驗(yàn)日糧,如表1所示,每組設(shè)3個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)20尾,組間無顯著性差異(P>0.05),試驗(yàn)持續(xù)50d。試驗(yàn)鯽魚先在水族箱內(nèi)暫養(yǎng),以基礎(chǔ)日糧投喂,1周后開始正式試驗(yàn)。每天分別在09:00－10:00、16:30－17:00投喂1次,按試驗(yàn)魚體重4％－5％投喂飼料。飼養(yǎng)前用強(qiáng)氯精進(jìn)行消毒。表1實(shí)驗(yàn)各組益生菌組合物添加量組別基礎(chǔ)日糧益生菌粉寡聚糖粉對照組A基礎(chǔ)日糧00試驗(yàn)組B基礎(chǔ)日糧1％0試驗(yàn)組C基礎(chǔ)日糧01％試驗(yàn)組D基礎(chǔ)日糧0.5％0.5％益生菌組合物對鯽魚生長性能的影響實(shí)施例1組合物和益生菌干粉都能顯著降低大鼠的體重，其中實(shí)施例1組合表1益生菌組合物對肥胖大鼠體重的影響，n＝8。注：益生菌粉和寡聚糖粉按實(shí)施例1的配比。(3)數(shù)據(jù)測量生長試驗(yàn)42d,試驗(yàn)魚日喂2次(09:00一10:00、16:30一17:00),飼養(yǎng)0d、42d稱重,并以此計(jì)算增重率,公式如下:增重率％＝(平均末質(zhì)量－平均初質(zhì)量)/平均初質(zhì)量(4)結(jié)果分析試驗(yàn)結(jié)束后進(jìn)行各組鯽魚生長指標(biāo)的測定，從表2可以看出，試驗(yàn)D組的鯽魚增重率與空白試驗(yàn)A組(P<0.05)，其它各組之間差異不明顯(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)表明，不同益生菌組合物對鯽魚生長有一定的促進(jìn)作用，其中益生菌與寡聚糖配合使用效果最好。表2不同益生菌組合對鯽魚生長性能的影響組別A組B組C組D組初質(zhì)量(g)16.92±0.315.34±0.315.12±0.316.03±0.5末質(zhì)量(g)40.23±1.244.12±2.945.35±3.149.31±1.9增重率(％)137.8±0.3187.6±0.3199.9±0.3207.6±0.5實(shí)驗(yàn)例2不同益生菌組合對凡納濱對蝦腸道蛋白酶、淀粉酶活力的影響(1)動(dòng)物飼養(yǎng)與管理實(shí)驗(yàn)蝦來自武漢水生所，初始體質(zhì)量為(0.11±0.00)g，隨機(jī)分為6組，每組3個(gè)重復(fù)，每水泥池放養(yǎng)300尾蝦，養(yǎng)殖前期投喂1.0mm粒徑的飼料，后期投喂1.5mm粒徑的飼料。投餌量為體質(zhì)量的5％～10％，分4次投喂，投喂時(shí)間分別為06∶00、10∶30、18∶00、22∶00，各時(shí)間點(diǎn)投喂量占日總投餌量的比值分別為30％、20％、30％、20％。飼養(yǎng)期水溫(29±3)℃，鹽度26±3，連續(xù)充氣。前15d不換水，每天排污1次，養(yǎng)殖水體深度從剛開始的60cm逐漸加深到120cm。養(yǎng)殖后期2～5d換水1次。每次換水量為20％～30％，嚴(yán)格控制每次換水的深度，使每池?fù)Q水量基本一致。養(yǎng)殖時(shí)間持續(xù)10周。(2)腸道消化酶活力測定養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，每水泥池隨機(jī)取15尾對蝦，取其腸道。去除腸道糞便，用去離子水沖洗后濾紙吸干，稱質(zhì)量，搗碎后移入電動(dòng)勻漿器內(nèi)冰水浴勻漿，在4℃下離心30min(10000r/min)，取上清液備用，24h分析完畢。蛋白酶活性測定采用福林-酚試劑法，以每mg酶蛋白37℃每分鐘水解生成1μg酪氨酸作為1個(gè)酶活性單位；淀粉酶活性采用碘-淀粉比色法，以每mg酶蛋白在37℃與底物作用30min，水解10mg淀粉為1個(gè)酶活性單位。腸道酶液蛋白含量以牛血清蛋白做標(biāo)準(zhǔn)，用考馬斯亮藍(lán)法測定。(3)實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析飼料中添加益生菌能提高腸道蛋白酶和淀粉酶活力(表3)。其中益生菌組合物組有比單一益生菌組和單一寡聚糖組更高的腸道蛋白酶和淀粉酶活力。與對照組相比，添加益生菌組合物均能顯著提高腸道淀粉酶活力(P<0.05)，但單一益生菌組和單一寡聚糖組腸道蛋白酶和淀粉酶活力差異不顯著(P>0.05)。表3不同益生菌組合對凡納濱對蝦腸道蛋白酶、淀粉酶活力的影響組合蛋白酶淀粉酶對照組19.21±0.784.78±1.09單一益生菌組24.65±0.348.23±0.56單一寡聚糖組23.91±0.987.58±1.90益生菌組合物組25.11±0.569.31±1.28當(dāng)前第1頁1 2 3