一種牛奶小分子生物活性肽及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種牛奶小分子生物活性肽，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。其由如下方法制得：最適牛奶蛋白水解酶的篩選、最適蛋白水解條件的篩選、葡聚糖凝膠分離純化牛奶小分子肽、高效液相色譜測(cè)定牛奶小分子肽分子量、牛奶小分子肽DPPH自由基清除率和羥基自由基清除率測(cè)定。本發(fā)明牛奶小分子肽具有易吸收、溶解性好、生物功能等特點(diǎn)。本發(fā)明對(duì)牛奶小分子肽的開發(fā)利用提供了技術(shù)支持，同時(shí)也提高了牛奶品質(zhì)和附加值，具有很好的應(yīng)用前景。
【專利說(shuō)明】一種牛奶小分子生物活性肽及其制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種牛奶小分子生物活性肽。

【背景技術(shù)】
[0002] 小分子肽，又稱超低分子量寡肽，僅由2?9個(gè)氨基酸構(gòu)成的高活性肽。研究表明 小分子肽具有豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和保健功效，具有和蛋白質(zhì)相同的氨基酸組成且其吸收效率 要高于蛋白質(zhì)和其他氨基酸，利用這一營(yíng)養(yǎng)功能，小分子肽可以作為腸道營(yíng)養(yǎng)劑和流態(tài)食 物作為康復(fù)期病人、消化功能衰退的老年人以及消化功能未成熟的嬰幼兒的最佳營(yíng)養(yǎng)源選 擇。
[0003] 從來(lái)源上可以將小分子活性肽分為：植物源性活性肽、乳源性活性肽、海洋生物活 性肽以及家禽動(dòng)物源性活性肽。從功能上可以將活性肽分為：生理功能活性肽(抗菌肽、神 經(jīng)活性肽、激素肽、激素調(diào)節(jié)肽、酶調(diào)節(jié)劑和抑制劑、免疫活性肽、抗氧化肽）和食品感官肽 (口味肽、表面活性肽、營(yíng)養(yǎng)肽)。
[0004] 近年來(lái)，隨著科技的進(jìn)步和人們生活水平的提高，天然產(chǎn)物和功能性多肽成為研 究熱點(diǎn)。目前研究較多的則是抗菌肽、抗壓肽、抗氧化肽等，這些在醫(yī)療保健、食品加工等行 業(yè)有著較大的影響。
[0005] 牛奶小分子肽是利用一定的方式將牛奶蛋白水解成小分子肽，它的分子質(zhì)量介于 氨基酸和多肽之間，不像其他蛋白一樣要經(jīng)過(guò)水解后才能被機(jī)體消化吸收，而是以小肽的 形式直接被吸收利用，這樣既可以避免氨基酸之間的競(jìng)爭(zhēng)吸收，又可以減少滲透壓對(duì)人體 帶來(lái)的不良影響，這樣有利于發(fā)揮小分子肽的功能效應(yīng)，其在功能性食品的開發(fā)中有著很 好的發(fā)展前景。
[0006] 目前對(duì)功能性小分子肽的提取方法的研究主要從生物體中直接分離提取天然生 物活性肽；通過(guò)體外水解蛋白質(zhì)得到生物活性肽；利用化學(xué)法合成或重組DNA技術(shù)合成活 性肽?；瘜W(xué)法主要是利用酸堿對(duì)蛋白進(jìn)行水解，這種方法操作簡(jiǎn)單，反應(yīng)條件劇烈，獲得的 小分子肽不能夠很好的控制，對(duì)后續(xù)分離純化也有一定的影響；酶法水解蛋白是利用生物 酶對(duì)特定的肽鍵進(jìn)行剪切，該方法作用條件溫和，可以利用特定的酶定向生產(chǎn)小分子肽，但 是該方法水解時(shí)間較長(zhǎng)；利用DNA技術(shù)合成生物活性肽實(shí)現(xiàn)了小分子肽的定向生產(chǎn)，該方 法主要是利用質(zhì)粒、噬菌體等載體實(shí)現(xiàn)基因工程手段的，但是該方法的安全性不可控。所以 篩選出一種作用條件溫和、小分子肽含量高的牛奶小分子肽制備工藝有著重要的意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是提供一種牛奶小分子活性肽及其制備方法。
[0008] 本發(fā)明所用的牛奶來(lái)自臨沂格瑞食品有限公司自有牧場(chǎng)。
[0009] 本發(fā)明一種牛奶小分子生物活性肽，由以下工藝步驟制得： 1) 最適牛奶蛋白水解酶為：中性蛋白酶； 2) 最適蛋白水解條件的篩選：溫度45-55°C，pH=6-8,酶解時(shí)間6-8h，酶添加量 2. 5-3. 5% ； 3) 葡聚糖凝膠分離純化牛奶小分子肽：所述葡聚糖凝膠分離純化牛奶小分子肽，選用 SephadexG25對(duì)牛奶蛋白酶解液進(jìn)行純化，流動(dòng)相采用0. 2mol/L磷酸二氫鉀，流速0. 5mL/ min，每管收集5mL，考馬斯亮藍(lán)比色法進(jìn)行跟蹤檢測(cè)； 4) 高效液相色譜測(cè)定牛奶小分子肽分子量； 5) 牛奶小分子肽DPPH自由基清除率和羥基自由基清除率測(cè)定：采用高效液相色譜法 測(cè)定牛奶小分子肽分子量，測(cè)得牛奶小分肽分子量范圍為470-1130Da，牛奶小分子肽DPPH 自由基和羥基自由基清除率分別為18. 07%、65. 47%。
[0010] 所述牛奶小分子生物活性肽，所述最適蛋白水解條件為：溫度50°c、pH7、酶解時(shí) 間7h、酶添加量3%，在所述水解條件下的多肽得率為96. 6%、水解度為39. 12%。
[0011] 本發(fā)明牛奶小分子生物活性肽的制備方法，包括以下工藝步驟： 1) 最適牛奶蛋白水解酶為：中性蛋白酶； 2) 最適蛋白水解條件的篩選：溫度45-55°C，pH=6-8,酶解時(shí)間6-8h，酶添加量 2. 5-3. 5% ； 3) 葡聚糖凝膠分離純化牛奶小分子肽：所述葡聚糖凝膠分離純化牛奶小分子肽，選用 SephadexG25對(duì)牛奶蛋白酶解液進(jìn)行純化，流動(dòng)相采用0. 2mol/L磷酸二氫鉀，流速0. 5mL/ min，每管收集5mL，考馬斯亮藍(lán)比色法進(jìn)行跟蹤檢測(cè)； 4) 高效液相色譜測(cè)定牛奶小分子肽分子量； 5) 牛奶小分子肽DPPH自由基清除率和羥基自由基清除率測(cè)定：采用高效液相色譜法 測(cè)定牛奶小分子肽分子量，測(cè)得牛奶小分肽分子量范圍為470-1130Da，牛奶小分子肽DPPH 自由基和羥基自由基清除率分別為18. 07%、65. 47%。
[0012] 本發(fā)明根據(jù)GB2760-2011選擇合適的蛋白質(zhì)水解酶（胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性 蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶)，根據(jù)各種酶最適酶解pH值、酶解時(shí)間和酶解溫度按照 3%的添加量水解5 h，以各種酶酶解得出的小分子肽得率作為篩選的檢測(cè)指標(biāo)。最終確定 中性蛋白酶為最適的牛奶蛋白水解酶。
[0013] 本發(fā)明所述最適中性蛋白酶酶解條件： 溫度45-55°C，pH=6-8,酶解時(shí)間6-8h，酶添加量2. 5-3. 5%。
[0014] 本發(fā)明采用半微量凱氏定氮法與甲醛法滴定氨基態(tài)氮聯(lián)合測(cè)定牛奶小分子肽的 得率。
[0015] 牛奶小分子肽的分離純化： 取上述經(jīng)過(guò)脫脂和水解處理過(guò)的牛奶樣品，置于的透析袋中對(duì)純水透析，主要是利用 透析袋把大分子蛋白質(zhì)與小分子化合物分開，透析結(jié)束后，再用聚乙二醇6000濃縮至原體 積的1/5,收集備用，即為牛奶中的多肽物質(zhì)，飽和的硫酸銨溶液沉淀牛奶小分子肽，膜過(guò)濾 脫鹽濃縮牛奶小分子肽，經(jīng)濃縮過(guò)的小分子肽用Sephadex G-25葡聚糖凝膠純化牛奶小分 子肽，最后通過(guò)液相檢測(cè)小分子肽的分子量范圍。
[0016] 小分子肽生物活性檢測(cè)： 牛奶小分子肽活性檢測(cè)主要通過(guò)其對(duì)羥基自由基和DPPH自由基的清除能力來(lái)評(píng)價(jià)。
[0017] 按照上述方法制備得到其分子量范圍為475-1127Da牛奶小分子肽，采用本方法 比化學(xué)方法小分子肽得率有顯著提高，小分子肽所占比例也顯著提升，本發(fā)明以公司自有 奶源為原料，通過(guò)水解、脫脂、濃縮沉淀、柱層析、液相實(shí)現(xiàn)了對(duì)牛奶小分子肽的分離純化和 分子量的測(cè)定，所得到的牛奶小分子肽具有較高的純度和品質(zhì)。
[0018] 本發(fā)明利用中性蛋白酶水解牛奶小分子肽，提高了牛奶蛋白的水解度，降低了牛 奶中的大分子肽蛋白，所得的牛奶小分子肽具有易吸收、溶解性好、生物功能等特點(diǎn)，本發(fā) 明對(duì)牛奶小分子肽的開發(fā)利用提供了技術(shù)支持，同時(shí)也提高了牛奶品質(zhì)和附加值，具有很 好的應(yīng)用前景。
[0019] 附圖 圖1是本發(fā)明牛奶小分子肽制備工藝流程； 圖2是本發(fā)明牛奶小分子肽液相圖譜； 圖3是本發(fā)明標(biāo)準(zhǔn)品液相圖譜(注：1、胰島素，2、酵母核糖核酸，3、桿菌肽，4、還原性谷 胱甘肽）； 圖4是本發(fā)明SephadexG25凝膠柱層析洗脫曲線。

【具體實(shí)施方式】
[0020] 一、最適牛奶蛋白酶的篩選 1、材料預(yù)處理 脂肪的去除 取一定量牛奶3000r/min離心15~20min，然后將離心管放冰箱冷卻數(shù)小時(shí)，使上層的 乳脂凝結(jié)，用紗布過(guò)濾，得脫脂牛奶。

【權(quán)利要求】
1. 一種牛奶小分子生物活性肽，其特征在于由以下工藝步驟制得： 1) 最適牛奶蛋白水解酶為：中性蛋白酶； 2) 最適蛋白水解條件的篩選：溫度45-55°C，pH=6-8,酶解時(shí)間6-8h，酶添加量 2. 5-3. 5% ； 3) 葡聚糖凝膠分離純化牛奶小分子肽：所述葡聚糖凝膠分離純化牛奶小分子肽，選用 Sephadex G25對(duì)牛奶蛋白酶解液進(jìn)行純化，流動(dòng)相采用0. 2mol/L磷酸二氫鉀，流速0. 5mL/ min，每管收集5mL，考馬斯亮藍(lán)比色法進(jìn)行跟蹤檢測(cè)； 4) 高效液相色譜測(cè)定牛奶小分子肽分子量； 5) 牛奶小分子肽DPPH自由基清除率和羥基自由基清除率測(cè)定：采用高效液相色譜法 測(cè)定牛奶小分子肽分子量，測(cè)得牛奶小分肽分子量范圍為470-1130Da，牛奶小分子肽DPPH 自由基和羥基自由基清除率分別為18. 07%、65. 47%。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述牛奶小分子生物活性肽，其特征在于：所述最適蛋白水解條件 為：溫度50°C、pH 7、酶解時(shí)間7h、酶添加量3%，在所述水解條件下的多肽得率為96. 6%、水 解度為39. 12%。
3. -種如權(quán)利要求1所述牛奶小分子生物活性肽的制備方法，其特征在于包括以下工 藝步驟： 1) 最適牛奶蛋白水解酶為：中性蛋白酶； 2) 最適蛋白水解條件的篩選：溫度45-55°C，pH=6-8,酶解時(shí)間6-8h，酶添加量 2. 5-3. 5% ； 3) 葡聚糖凝膠分離純化牛奶小分子肽：所述葡聚糖凝膠分離純化牛奶小分子肽，選用 Sephadex G25對(duì)牛奶蛋白酶解液進(jìn)行純化，流動(dòng)相采用0. 2mol/L磷酸二氫鉀，流速0. 5mL/ min，每管收集5mL，考馬斯亮藍(lán)比色法進(jìn)行跟蹤檢測(cè)； 4) 高效液相色譜測(cè)定牛奶小分子肽分子量； 5) 牛奶小分子肽DPPH自由基清除率和羥基自由基清除率測(cè)定：采用高效液相色譜法 測(cè)定牛奶小分子肽分子量，測(cè)得牛奶小分肽分子量范圍為470-1130Da，牛奶小分子肽DPPH 自由基和羥基自由基清除率分別為18. 07%、65. 47%。
【文檔編號(hào)】C12P21/06GK104450848SQ201410845495
【公開日】2015年3月25日 申請(qǐng)日期:2014年12月31日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月31日
【發(fā)明者】趙迎慶 申請(qǐng)人:臨沂格瑞食品有限公司