干擾lcyb、lcye表達(dá)同時(shí)超量表達(dá)gl3在制備花瓣呈紅色蕓薹屬植物中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了干擾LCYB、LCYE表達(dá)同時(shí)超量表達(dá)GL3在制備花瓣呈紅色蕓薹屬植物中的應(yīng)用，還公開(kāi)了干擾LCYB、LCYE基因表達(dá)同時(shí)超量表達(dá)GL3基因的表達(dá)載體和該表達(dá)載體的制備方法，通過(guò)干擾LCYB、LCYE基因表達(dá)抑制黃色類胡蘿卜素并積累紅色番茄紅素，而超量表達(dá)GL3基因能夠促進(jìn)花青素苷積累，從而使花瓣呈紅色，成功制備了花瓣顯紅色的蕓薹屬植物，豐富了蕓薹屬植物的花色。
【專利說(shuō)明】干擾LCYB、LCYE表達(dá)同時(shí)超量表達(dá)GL3在制備花瓣呈紅色 蕓薹屬植物中的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及干擾LCYB、LCYE基因表達(dá)同時(shí)超量表達(dá)GL3 基因在制備花瓣呈紅色蕓薹屬植物中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 油菜是重要的油料作物，栽培歷史悠久、經(jīng)濟(jì)價(jià)值高、用途廣泛、適應(yīng)性強(qiáng)，是我國(guó) 的第一大油料作物，也是世界性的重要油料作物。物種分類學(xué)上，油菜由蕓薹屬的三個(gè)物種 構(gòu)成，分別為甘藍(lán)型油菜（Brassica napus，2n = 38，AACC)、白菜型油菜（Brassica rapa ssp. oleifera syn. B. campestris, 2n = 20, AA)、芥菜型油菜（Brassica juncea, 2n = 36, AABB)。甘藍(lán)型油菜油菜是由白菜（Brassica rapa)與甘藍(lán)（Brassica oleracea，2n = 18, CC)通過(guò)自然種間雜交后雙二倍化進(jìn)化而來(lái)的一種復(fù)合種，雖然栽培歷史僅有幾百年， 但由于其生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)，豐產(chǎn)性高，已占世界及我國(guó)油菜種植面積90%的以上。白菜型油菜是 蕓薹屬最早被馴化的物種之一，原產(chǎn)于我國(guó)西北地區(qū)的大白菜演化而來(lái)，世界范圍內(nèi)有廣 泛的分布面積和悠久的栽培歷史。芥菜型油菜是由白菜與黑芥（Brassica nigra，2n = 16, BB)天然雜交后再自然加倍形成的雙二倍體復(fù)合種，中國(guó)是其原始起源與分化中心，種 植范圍遍布世界。
[0003] 隨著經(jīng)濟(jì)水平的持續(xù)發(fā)展和社會(huì)現(xiàn)代化程度的不斷提升，大眾對(duì)生活品味的追求 也與日俱增，不僅傳統(tǒng)的名山大川式的旅游越來(lái)越火，田園休閑觀光產(chǎn)業(yè)的發(fā)展也很迅速。 油菜大面積生產(chǎn)上形成金黃色花的海洋，是越來(lái)越重要的田園生態(tài)旅游資源。油菜花觀賞 的時(shí)間為每年的十二月底到來(lái)年夏季。每個(gè)地方因?yàn)榉N植的時(shí)間略有不同，花期會(huì)有一點(diǎn) 差異。在我國(guó)已形成幾十個(gè)知名油菜花觀賞地區(qū)，油菜花開(kāi)時(shí)，競(jìng)相怒放、流金溢彩、綿延數(shù) 十里，好似金浪滔滔的海洋。
[0004] 自然界花舟顏色雖然種類繁多，但除芥藍(lán)（B. oleracea var. alboglabra)的花瓣 是乳白色以外，蕓薹屬植物的花瓣普遍為黃色系列，商業(yè)油菜品種全是黃色花瓣，過(guò)于單 調(diào)。隨著油菜花色田園生態(tài)觀光產(chǎn)業(yè)的迅猛發(fā)展，迫切需要多姿多彩的花色性狀，使之還可 以開(kāi)出紅色、藍(lán)色等，在不影響油菜菜籽的出油率和其他傳統(tǒng)用途之外，增加其賞花價(jià)值， 助推生態(tài)觀光旅游。此外，特定的花色還是油菜育種界渴望的選擇標(biāo)記性狀，而且花色的非 黃色化還有助于減少露尾甲等蟲(chóng)害。因此，需要解析油菜花色性狀的分子機(jī)理，并開(kāi)展新花 色的分子育種。
[0005] 蘿卜（Raphanus sativus)屬于蘿卜屬，近年來(lái)的分子證據(jù)表明蘿卜與白菜、甘藍(lán)、 甘藍(lán)型油菜的距離甚至遠(yuǎn)小于黑芥與它們的距離，意思是說(shuō)蘿卜與蕓薹屬核心物種的距離 小于蕓薹屬內(nèi)部的種間距離。但另一方面，蘿卜能開(kāi)出紅色系的花色，而蕓薹屬和眾多近緣 屬（如白芥屬）則只能開(kāi)出黃色系的花。這是一個(gè)奇怪的現(xiàn)象，因此開(kāi)展蕓薹屬與蘿卜花 色性狀的比較研究，不僅是這些生物花色性狀基礎(chǔ)研究的需要，也可為油菜等蕓薹屬植物 花色性狀的遺傳改良提供指導(dǎo)。
[0006] 重要觀花植物的花色分子機(jī)理和分子育種已取得顯著進(jìn)展，為研究其它植物花色 機(jī)理和開(kāi)展分子育種提供了重要參考。花色主要由類黃酮（flavonoids)和類胡蘿卜素 (carotenoids)兩大類色素決定。
[0007] 類黃酮是最見(jiàn)的花色素，貢獻(xiàn)黃色、橙色、紅色到紫色的一系列色系。類黃酮 為水溶性物質(zhì)，具有一個(gè)C15骨架，按結(jié)構(gòu)主要分為9類：查爾酮（chalcones)、橙酮 (aurones)、異黃酮（isoflavonoids)、黃酮（flavones)、黃酮醇（flavonols)、黃燒雙醇 (flavandiols)、花色苷（anthocyanins)、縮合單寧（condensed tannins，即原花青素， proanthocyanins)和縣酐（phlobaphenes)，它們中對(duì)植物著色貢獻(xiàn)最大的是花色苷、黃酮 醇、查爾酮和橙酮?；ㄉ帐亲畲蟮囊活愵慄S酮物質(zhì)，為花朵或其它組織貢獻(xiàn)品紅、紅色、 紫色、藍(lán)色等色調(diào)，積累于細(xì)胞的液泡或色素細(xì)胞中，天竺葵素（pelargonidin)、矢車(chē)菊素 (cyanidin)、飛燕草素（delphinidin)是最常見(jiàn)的三類花色苷；而黃色色調(diào)則由查爾酮、橙 酮、黃酮醇、黃酮提供。
[0008] 矮牽牛、玉米、金魚(yú)草、擬南芥等植物中的類黃酮生物合成途徑已被充分解析。它 是公共體丙烷生物合成途徑下游的一個(gè)重要分支途徑，苯丙烷途徑通過(guò)其它分支途徑合成 木質(zhì)素、芪類、香豆素、植保素等多種次生物質(zhì)。類黃酮途徑的第一步是由查酮合酶（CHS) 催化1分子P-香豆酰-CoA與3分子丙二酰-CoA縮合形成淺黃色的4, 2'，4'，6' -四羥基 查爾酮。花色苷配基如天竺葵素、矢車(chē)菊素、飛燕草素等是以查爾酮為底物，經(jīng)羥化、還原、 氧化、側(cè)基修飾等幾步酶的催化反應(yīng)而形成，依次涉及CHI (查爾酮異構(gòu)酶）、F3H(黃烷酮 3-羥化酶）、F3' H(類黃酮3' -羥化酶）、F3' 5' H(類黃酮3'，5' -羥化酶）、DFR/FNR(二 氫黃酮醇4-還原酶/黃烷酮4-還原酶）、ANS (花青素合成酶）等。由F3' H和F3' 5' H 決定的花青素（anthocyanidins)的B-環(huán)上的輕基越多，則顏色越偏向藍(lán)色。通常情況下， 查爾酮和花青素被進(jìn)一步修飾，如糖基化（糖基轉(zhuǎn)移酶，GT)、甲基化（甲基轉(zhuǎn)移酶，MT)、酰 基化（?；D(zhuǎn)移酶，AT)，然后轉(zhuǎn)運(yùn)（谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶，GST)到液泡中貯存。在黃色金魚(yú) 草花的液泡中，查爾酮4' -0-葡萄糖苷被金魚(yú)草素合成酶（AS)轉(zhuǎn)變成亮黃色的金魚(yú)草素 (6-0-葡萄糖苷）。艷桐草等植物的橙色至紅色花朵中，黃烷酮經(jīng)過(guò)幾步反應(yīng)而合成3-脫 氧花色苷。此外，黃酮和黃酮醇也對(duì)花色起一定貢獻(xiàn)，它們?yōu)闊o(wú)色或淺黃色，可通過(guò)所謂共 色作用來(lái)促進(jìn)藍(lán)色花色苷的形成和穩(wěn)定。黃酮和黃酮醇分別是以黃烷酮和二氫黃酮醇為底 物，在黃酮合酶（FNS)和黃酮醇合酶（FLS)的催化下合成的。除花青素外，黃酮醇、查爾酮 等其它類黃酮物質(zhì)也可能涉及糖基化等修飾。
[0009] 模式生物的研究表明，類黃酮途徑結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)是被一個(gè)由R2R3-MYB (有PAP、 PFG、TT2 等）、堿性螺旋-環(huán)-螺旋（basic helix-loop-helix, bHLH，有 TT8、GL3、EGL3 等） 和WD40重復(fù)（WDR，有TTGl等）形成的轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物所調(diào)控的，該三元復(fù)合物調(diào)控了觀花 植物金魚(yú)草、矮牽牛、牽?；?、非洲菊和龍膽花的花瓣中花色苷著色的過(guò)程，調(diào)控行為受器 官、組織等體內(nèi)信號(hào)和光、紫外線等外部信號(hào)所影響。擬南芥的研究表明，黃色調(diào)的黃酮醇 (苷）生物合成途徑的表達(dá)則由PFG基因特異調(diào)控，其中成員MYB11、MYB12、MYB111在器官 特異性上發(fā)生明顯分工。
[0010] 類胡蘿卜素（carotenoids)是脂溶性的紅色、橙色和黃色色素，嵌合在葉綠體和 有色體的膜中。類胡蘿卜素是C40-四萜類化合物，由C5-異戊二烯基礎(chǔ)單元合成而來(lái)，植 物、真菌、藻類和細(xì)菌均可合成，動(dòng)物雖不能合成，但可從食物中攝入并用作色素和維生素 A 的前體物。類胡蘿卜素為許多花色貢獻(xiàn)了黃色色系，并單獨(dú)或與花色苷一道為玫瑰、菊花 等一些植物的花瓣貢獻(xiàn)了橙/紅、黃褐色和褐色色調(diào)。迄今，植物類胡蘿卜素生物合成途徑 的幾乎全部關(guān)鍵酶基因已被克隆和鑒定，整個(gè)途徑起始于質(zhì)體中的C5的異戊二烯焦磷酸 (isopentenyl pyrophosphate, IPP)單元，據(jù)認(rèn)為該途徑的有關(guān)酶之間形成復(fù)合物并結(jié)合 于質(zhì)體膜上，4分子IPP縮合為1分子C20的香葉基香葉基焦磷酸（GGPP)，在八氫番茄紅素 合酶（PSY)的催化下2分子GGPP頭對(duì)頭地偶合成C40的無(wú)色的八氫番茄紅素，它是第一個(gè) 類胡蘿卜素。隨后，八氫番茄紅素脫飽和酶（TOS)和ζ-胡蘿卜素脫飽和酶（ZDS)向分子 中順序引入共軛雙鏈，先后形成無(wú)色的六氫番茄紅素、淺黃色的胡蘿卜素、橙黃色的鏈 孢紅素、紅色的番茄紅素。隨著共軛雙鏈數(shù)的增加，吸收波長(zhǎng)向長(zhǎng)波方向移動(dòng)。脫飽和過(guò)程 中產(chǎn)生的一些順式構(gòu)象被類胡蘿卜素異構(gòu)酶（CRTIS0、Ζ-ISO)催化轉(zhuǎn)變?yōu)槿词綐?gòu)象。番 茄紅素可被番茄紅素 β -環(huán)化酶（LCYB)或番茄紅素 ε -環(huán)化酶（LCYE)環(huán)化，這是該途徑的 一個(gè)分支點(diǎn)。除半結(jié)球萵苣等植物外，絕大多數(shù)植物中LCYE只能給番茄紅素加入ε-環(huán)， 合成黃色的含有1個(gè)β-環(huán)和1個(gè)ε-環(huán)的α-胡蘿卜素和其衍生物。β -和α -胡蘿卜 素可發(fā)生進(jìn)一步的羥化或環(huán)氧化修飾，產(chǎn)生許多新結(jié)構(gòu)。胡蘿卜素的加氧產(chǎn)物稱為葉黃質(zhì)， β -環(huán)和ε -環(huán)的羥化過(guò)程分別由β -環(huán)羥化酶（CHYB)和ε -環(huán)羥化酶（CHYE)完成。PSY、 GGPS和LCYB存在花特異型和果實(shí)特異型，顯示存在一條有色體特異的類胡蘿卜素合成途 徑。玉米黃素環(huán)氧酶（ZEP)催化玉米黃素發(fā)生C5, 6和C5'，6'位的環(huán)氧化，形成黃色的花 藥黃質(zhì)和紫黃質(zhì)，它又可在新黃質(zhì)合成酶（NSY)的催化下轉(zhuǎn)變成新黃質(zhì)。9-順式-紫黃質(zhì) 和9-順式-新黃質(zhì)還可用于合成脫落酸（ABA)。
[0011] 類胡蘿卜素合成途徑的調(diào)控基因克隆還有待加強(qiáng)，但研究表明該途徑的調(diào)節(jié)主要 發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平上，受體內(nèi)和環(huán)境因素影響，PSY是重要限速酶調(diào)控點(diǎn)，光信號(hào)通路參與對(duì) 類蘿卜素途徑的調(diào)控，而且類胡蘿卜素裂解雙加氧酶（CCD)/NCED (9-順式-環(huán)氧類胡蘿卜 素雙加氧酶）從分解的角度參與重要調(diào)節(jié)作用。此外，VDE(紫黃質(zhì)脫環(huán)氧化酶）催化紫黃 質(zhì)和花藥黃質(zhì)轉(zhuǎn)化為玉米黃質(zhì)。擬南芥AtRAP2. 2對(duì)特定組織中的類胡蘿卜素積累有弱的 促進(jìn)作用，但最近研究表明它的功能主要是調(diào)控組織的耐缺氧存活能力。番茄DDBl和DETl 通過(guò)對(duì)光反應(yīng)信號(hào)途徑的負(fù)調(diào)控而抑制類胡蘿卜素途徑，而甘藍(lán)OR(Orange)和番茄HSP21 則是通過(guò)調(diào)控有色體的形成而促進(jìn)類胡蘿卜素的積累。
[0012] 此外，還存在第3類植物色素，即甜菜素（betalains)，是一類存在于液泡中 的水溶性生物堿，可分為紅紫色系的甜菜紅素（betacyanins)和黃色色系的甜菜黃素 (betaxanthins)，但甜菜素只發(fā)現(xiàn)于石竹目的10個(gè)科的植物和少數(shù)高等真菌中，其它植物 中還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)，而且從未發(fā)現(xiàn)甜菜素與花色苷并存于同一種植物中。
[0013] 由于多數(shù)重要觀花植物的花色并不全，存在花色上的重要缺陷，因此花色分子育 種的代謝工程具有重要應(yīng)用前景。但是包括油菜在內(nèi)的整個(gè)蕓薹屬中，未見(jiàn)利用分子育種 的代謝工程改造油菜花色的報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0014] 有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供干擾蕓薹屬植物花瓣中β-環(huán)化酶基因 LCYB、ε -環(huán)化酶基因 LCYE表達(dá)同時(shí)超量表達(dá)GL3基因在制備花瓣呈紅色的蕓薹屬植物 品種中的應(yīng)用；本發(fā)明的目的之二在于提供干擾蕓薹屬植物花瓣中β-環(huán)化酶基因 LCYB、 ε -環(huán)化酶基因 LCYE表達(dá)同時(shí)超量表達(dá)GL3基因的植物表達(dá)載體；本發(fā)明的目的之三在于 提供上述植物表達(dá)載體的制備方法；本發(fā)明的目的之四在于提供利用上述植物表達(dá)載體制 備花瓣呈紅色的蕓薹屬植物品種的方法。
[0015] 為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：
[0016] 1、干擾蕓薹屬植物花瓣中β -環(huán)化酶基因 LCYB、ε -環(huán)化酶基因 LCYE表達(dá)同時(shí)超 量表達(dá)GL3基因在制備花瓣呈紅色的蕓薹屬植物品種中的應(yīng)用。
[0017] 優(yōu)選的，所述干擾蕓薹屬植物花瓣中環(huán)化酶基因 LCYB、ε-環(huán)化酶基因 LCYE 表達(dá)的序列如SEQ ID NO. 2所示，所述超量表達(dá)GL3基因的序列如SEQ ID NO. 3所示。
[0018] 優(yōu)選的，所述干擾蕓薹屬植物花瓣中環(huán)化酶基因 LCYB、ε-環(huán)化酶基因 LCYE 表達(dá)的序列由擬南芥花瓣特異啟動(dòng)子PAtAP3介導(dǎo)表達(dá)，所述花瓣特異啟動(dòng)子PAtAP3的核 苷酸序列如SEQ ID NO. 1第267位至第1044位所示。
[0019] 最優(yōu)選的，所述蕓薹屬植物為甘藍(lán)型油菜（Brassica napus)。
[0020] 2、干擾蕓薹屬植物花瓣中β -環(huán)化酶基因 LCYB、ε -環(huán)化酶基因 LCYE表達(dá)同時(shí)超 量表達(dá)GL3基因的植物表達(dá)載體，所述植物載體包括由花瓣特異啟動(dòng)子介導(dǎo)的表達(dá)β -環(huán) 化酶基因 LCYB和ε-環(huán)化酶基因 LCYE RNA干擾序列的表達(dá)框和由組成型啟動(dòng)子介導(dǎo)表達(dá) GL3基因的表達(dá)框。
[0021] 優(yōu)選的，所述花瓣特異啟動(dòng)子介導(dǎo)表達(dá)β -環(huán)化酶基因 LCYB、ε -環(huán)化酶基因 LCYE RNA干擾序列的表達(dá)框依次由花瓣特異啟動(dòng)子PAtAP3、SEQ ID NO. 2所示的序列、間隔序列、 SEQ ID NO. 2所示的反向互補(bǔ)序列和NOS終止子組成。
[0022] 更優(yōu)選的，所述由組成型啟動(dòng)子介導(dǎo)表達(dá)GL3基因的表達(dá)框依次由CaMV35S啟動(dòng) 子，SEQ ID NO. 3所示序列和NOS終止子組成。
[0023] 3、所述植物表達(dá)載體的制備方法，包括如下步驟：將SEQ ID NO. 1所示序列 經(jīng)AscI和SwaI雙酶切后連入經(jīng)同樣酶切的pFGC5941M質(zhì)粒，得pFGC5941CEPE質(zhì)粒， 然后將SEQ ID NO. 2所示的序列連入pFGC5941CEPE載體的PAtAP3啟動(dòng)子與間隔序列 之間，形成中間載體pFGC5941CEPE-B2RNAia，再將SEQ ID NO. 2所示序列反向連入中間 載體 pFGC5941CEPE-B2RNAia 的間隔序列與 OCS 終止子之間，得 pFGC5941CEPE-B2RNAi 載體，最后將SEQ ID NO. 3所示序列通過(guò)NcoI和AscI酶切位點(diǎn)連入經(jīng)同樣酶切的 pFGC5941CEPE-B2RNAi載體，得干擾蕓薹屬植物花瓣中β -環(huán)化酶基因 LCYB、ε -環(huán)化酶基 因 LCYE表達(dá)同時(shí)超量表達(dá)GL3基因的植物表達(dá)載體。
[0024] 優(yōu)選的，所述間隔序列為甘藍(lán)型油菜ΡΑΡ2基因第2內(nèi)含子。
[0025] 4、利用所述植物表達(dá)載體制備花瓣呈紅色的蕓薹屬植物品種的方法，包括如下步 驟：
[0026] a.將權(quán)利要求5-7任一項(xiàng)所述植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，制得工程菌；
[0027] b.將步驟a所得工程菌轉(zhuǎn)化蕓薹屬植物無(wú)菌苗的下胚軸，共培養(yǎng)后，在Basta除草 劑抗性下誘導(dǎo)分化獲得再生苗，篩選陽(yáng)性苗轉(zhuǎn)基因苗得花瓣呈紅色的蕓薹屬植物品種。
[0028] 本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明提供了油菜等蕓薹屬核心物種及蘿卜花色機(jī)理， 明確了黃花、白花、紅花之間的關(guān)鍵性差異表達(dá)基因位點(diǎn)，由此本發(fā)明克隆花瓣特異啟動(dòng)子 并改造獲得一種適合于花色基因工程的新型植物表達(dá)平臺(tái)載體，然后克隆相關(guān)基因或基因 片段，構(gòu)建獲得一種在花瓣中抑制黃色類胡蘿卜素并積累番茄紅素和花青素苷的植物表達(dá) 載體，轉(zhuǎn)化油菜后創(chuàng)造出紅色油菜花表型的新型資源材料，該技術(shù)策略是油菜等蕓薹屬花 色基因工程中的首創(chuàng)，也是通過(guò)類胡蘿卜素和類黃酮途徑聯(lián)合代謝工程修飾植物花色的首 例。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0029] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果更加清楚，本發(fā)明提供如下附圖：
[0030] 圖1為蕓薹屬和蘿卜花瓣的顯微觀察結(jié)果（A :甘藍(lán)型油菜（BnY) ;B :甘藍(lán)型油菜 (BnW) ;C :芥菜型油菜（BjY) ;D :白菜型油菜（BrY) ;E :甘藍(lán)（BoY) ;F :芥藍(lán)（BoW) ;G :蘿卜 (RsR))〇
[0031] 圖2為0?1?、178、61^3461^3在蕓薹屬花瓣與蘿卜花瓣間的差異表達(dá)仏為0?1?在蕓 薹屬花瓣與蘿卜花瓣間的差異表達(dá)；B為T(mén)T8在蕓薹屬花瓣與蘿卜花瓣間的差異表達(dá)；C為 GL3在蕓薹屬花瓣與蘿卜花瓣間的差異表達(dá)；D為EGL3在蕓薹屬花瓣與蘿卜花瓣間的差異 表達(dá)；BnYPe :甘藍(lán)型油菜黃花瓣；BnWPe :甘藍(lán)型油菜白花瓣；BjYPe :芥菜型油菜黃花瓣； BrYPe :白菜型油菜黃花瓣；BoYPe :羽衣甘藍(lán)黃花瓣；BoWPe :芥藍(lán)白花瓣；RsRPe :蘿卜紅紫 花瓣）。
[0032] 圖3為OR、CXDl在蕓薹屬花瓣和蘿卜花瓣間的差異表達(dá)（BnYPe :甘藍(lán)型油菜黃 花瓣；BnWPe :甘藍(lán)型油菜白花瓣；BjYPe :芥菜型油菜黃花瓣；BrYPe :白菜型油菜黃花瓣； BoYPe :羽衣甘藍(lán)黃花瓣；BoWPe :芥藍(lán)白花瓣；RsRPe :蘿卜紅紫花瓣）。
[0033] 圖 4 為 N0S-PAtAP3、B2RNAi 和 BnGL3-lPCR 擴(kuò)增結(jié)果（A :N0S-PAtAP3 ;B :B2RNAi ; C:BnGL3-l)。
[0034] 圖5pFGC5941CEPE和pBLycoRF5載體構(gòu)建過(guò)程中酶切結(jié)果（A :AscI和SwaI 雙酶切 PFGC5941M ;B :AscI 和 SwaI 雙酶切 pMD19-T-N0S-PAtAP3 ;C :SwaI 和 AatI 雙酶 切 PFGC5941CEPE ;D :SwaI 和 AatII 雙酶切 pMD19-T-B2RNAi ;E :BamHI 和 XbaI 雙酶切 pMD19-T-B2RNAi ;F :BamHI 和 XbaI 雙酶切 pFGC5941CEPE-B2RNAia ;G :NcoI 和 AscI 雙酶切 pFGC5941CEPE-B2RNAi ;H :NcoI 和 AscI 雙酶切 pMD19-T-BnGL3-l)。
[0035] 圖6為pBLyc〇RF5轉(zhuǎn)化油菜植株的花瓣顏色（A :對(duì)照組；B :轉(zhuǎn)基因油菜）。

【具體實(shí)施方式】
[0036] 下面將結(jié)合附圖，對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。實(shí)施例中未注明具體 條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆實(shí)驗(yàn)指南（第三版，J.薩姆布魯克等 著）中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0037] 本發(fā)明實(shí)施例采用的植物材料：甘藍(lán)型油菜黃花瓣和發(fā)育中期種子（中雙9號(hào)品 種）、甘藍(lán)型油菜乳花瓣、白菜型油菜黃花瓣^Y733品系）、芥菜型油菜黃花瓣（CNG12011 品系）、羽衣甘藍(lán)（B. oleracea var. acephala ftricolor，Κ10-3品系）黃花瓣、芥藍(lán)變種 白花瓣（R9057品系）、蘿卜紅花瓣均取自西南大學(xué)重慶市油菜工程技術(shù)研究中心歇馬基地 的常規(guī)試驗(yàn)植株。擬南芥（Arabidopsis thaliana，Columbia野生型）種子購(gòu)自國(guó)際擬南 芥中心，種植于室內(nèi)人工氣候室。
[0038] 本發(fā)明實(shí)施例采用的試劑及試劑盒：PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)、SYBR? Premix Ex Taq? II (Tli RNaseH Plus) ROX plus、 DNA Ligation Kit、pMD19_T、Taq DNA 聚合酶、DNase I (RNase-free)及 buffer、RNase Inhibitor、DL-2000及λ-HindIII DNA Marker購(gòu)自大連寶生物（TaKaRa)生物工程有限公 司；RNAprep Pure植物總RNA提取試劑盒為天根生化科技（北京）有限公司產(chǎn)品；膠回收 試劑盒、小量法質(zhì)粒抽提試劑盒購(gòu)自上海華舜生物技術(shù)有限公司；限制性內(nèi)切酶購(gòu)自立陶 宛MBI Fermentas 公司；MS (Murashige&Skoog medium, including vitamins)培養(yǎng)基為荷蘭 Duchefa公司產(chǎn)品；DL_2000plus、Easy-Taq酶、dNTPs等試劑購(gòu)自北京全式金（Transgen) 生物技術(shù)有限公司；X -Gluc (5-brom〇-4-chlor〇-3-indolyl-β -D-glucuronic acid)、利福 平（Rif)、鏈霉素（Str)、卡那霉素（Kan)、氨芐青霉素（Amp)、瓊脂糖、Tris、CTAB、Tris飽和 酚（pH = 8. 0)、Tryptone、Yeast Extract、X-gal、IPTG、CTAB 等其它生化與分子生物學(xué)試 劑購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；植物激素購(gòu)自上海稼豐園藝用品等公司。
[0039] 本發(fā)明實(shí)施例采用的主要儀器：Veriti?多重控溫PCR儀購(gòu)自美國(guó)Applied Biosystems公司；CFX96熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；以及分子生物學(xué)和基因工 程的其它設(shè)備設(shè)施。
[0040] 優(yōu)選實(shí)施例所用PCR引物合成和測(cè)序由上海英駿/英濰捷基公司、上海生工、北京 六合華大等公司商業(yè)完成。
[0041] 實(shí)施例1、蕓薹屬和蘿卜花瓣顯色亞細(xì)胞器的顯微觀察
[0042] 分別采取新鮮的甘藍(lán)型油菜黃花瓣（BnY);甘藍(lán)型油菜乳花瓣（BnW);芥菜型油菜 黃花瓣（BjY);白菜型油菜黃花瓣（BrY);羽衣甘藍(lán)黃花瓣（BoY);芥藍(lán)白花瓣（BoW);蘿卜 紅花瓣（RsR)，放在冰面冷鮮保存運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，然后徒手切片，用低倍鏡觀察快速篩查，挑選 合格切片進(jìn)行仔細(xì)觀察與照相，結(jié)果如圖1所示。結(jié)果顯示，蕓薹屬幾個(gè)物種的黃花瓣中顯 黃色的物質(zhì)在一個(gè)細(xì)胞中呈現(xiàn)為眾多小顆粒狀，不均勻地分布于細(xì)胞內(nèi)，被液泡擠壓到貼 壁的位置，說(shuō)明黃色花瓣中顯色細(xì)胞器為有色體，其色素為黃色類胡蘿卜素。甘藍(lán)型油菜乳 花瓣中也有一些細(xì)胞擁有淺黃色有色體，但總體數(shù)量少且細(xì)胞間不一致，芥藍(lán)白花瓣中幾 乎看不到有色體，說(shuō)明是有色體的減少或消失導(dǎo)致其黃色變淺或消失。蘿卜花瓣中紫紅色 色素均勻分布于每個(gè)細(xì)胞的中央位置，越是中央越濃，越偏離中央越淡，說(shuō)明蘿卜花瓣的顯 色亞細(xì)胞器為液泡,顯色物質(zhì)為花青素苷。
[0043] 實(shí)施例2、檢測(cè)蕓薹屬和蘿卜花瓣色素
[0044] 在盛花期早晨分別取剛開(kāi)放的甘藍(lán)型油菜黃花瓣（BnY);甘藍(lán)型油菜乳花瓣 (BnW);芥菜型油菜黃花瓣（BjY);白菜型油菜黃花瓣（BrY);羽衣甘藍(lán)黃花瓣（BoY);芥藍(lán) 白花瓣（BoW);蘿卜紅花瓣（RsR)，立即陰涼保鮮運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，50?60°C烘干，研成粉末后過(guò) 60目篩，避光干燥保存。
[0045] 1、石油醚、鹽酸和氨水測(cè)試結(jié)果
[0046] 稱取保存的花瓣粉末0. 100g，分別放入編有號(hào)碼的具塞試管中，分別加入石油醚、 10 %鹽酸、30 %氨水各約10mL，輕輕混勻，過(guò)濾，觀察顏色變化，結(jié)果如下：
[0047] (1)石油醚反應(yīng)：甘藍(lán)型油菜、白菜型油菜、芥菜型油菜都表現(xiàn)出亮黃色，表明類 胡蘿卜含量的含量高；羽衣甘藍(lán)表現(xiàn)出淺黃色，說(shuō)明其含有少量的類胡蘿卜素；而芥藍(lán)和 蘿卜花表現(xiàn)出無(wú)色，表明不含類胡蘿卜素。
[0048] (2)鹽酸測(cè)試：只有蘿卜紅花瓣表現(xiàn)出粉紅色，說(shuō)明含有花青素苷，而甘藍(lán)型油 菜、白菜型油菜、芥菜型油菜花瓣表現(xiàn)出不同程度的黃色，說(shuō)明含黃酮（醇）而不含花青素。 芥藍(lán)白和羽衣甘藍(lán)表現(xiàn)近無(wú)色，說(shuō)明不含有花青素，而且黃酮（醇）也很少。
[0049] (3)氨水測(cè)試：蕓薹屬各材料均表現(xiàn)出不同程度的黃色，說(shuō)明其含有或多或少的 黃酮（醇），而蘿卜花表現(xiàn)出的黃綠色，該顏色是由花色苷呈現(xiàn)的藍(lán)色和類黃酮呈現(xiàn)的黃色 混合而成，但所有材料均不表現(xiàn)橙紅色或紅色，說(shuō)明不含橙酮。
[0050] 2、類黃酮的顯色反應(yīng)
[0051] 取保存的花瓣粉末0. l〇〇g，用甲醇提取24h，過(guò)濾，定容至50mL，各取2mL提取液， 然后進(jìn)行下列顏色反應(yīng)，觀察顏色變化。
[0052] (1)濃鹽酸-鎂粉反應(yīng)：加入少量鎂粉，再后加入濃鹽酸5滴，輕輕搖勻，靜置lh。 結(jié)果顯示，甘藍(lán)型油菜、芥藍(lán)顯示無(wú)色，可能含有查爾酮、橙酮；甘藍(lán)型油菜、白菜型油菜、芥 菜型油菜顯示極淡紫紅和微紫紅，說(shuō)明不含查爾酮、橙酮和兒茶素，可能含有黃酮、黃酮醇、 二氫黃酮醇、二氫黃酮；蘿卜花顯現(xiàn)出粉紅色，說(shuō)明含有花青素。
[0053] ⑵濃鹽酸-鋅粉反應(yīng)：加入少量鋅粉，再加入濃鹽酸10滴，輕輕搖勻，靜置lh。 結(jié)果顯示，蘿卜花呈現(xiàn)粉紅色，說(shuō)明含有花青素苷。其余均無(wú)色或者黃色，說(shuō)明不含花青素 苷。
[0054] (3)醋酸鉛反應(yīng)：加1.0%醋酸鉛2mL，輕輕搖勻，靜置2h。結(jié)果顯示，所有蕓薹屬 材料均出現(xiàn)不同程度的黃色沉淀，說(shuō)明類黃酮具備酚羥基而且不含查耳酮和橙酮，可能具 有鄰二酚羥基或者兼有4-酮基、3-0H或者4-酮基、5-0H結(jié)構(gòu)；蘿卜花出現(xiàn)綠色沉淀，說(shuō)明 含有花青素苷。
[0055] (4)三氯化鐵反應(yīng)：加5. 0%三氯化鐵2ml，輕輕搖勻。結(jié)果顯示，所有材料都出現(xiàn) 黃色，說(shuō)明色素分子中不含酚羥基。
[0056] (5)三氯化鋁反應(yīng)：加1. 0%三氯化鋁甲醇溶液I ml。結(jié)果顯示，所有材料都呈現(xiàn) 程度不同的黃色，說(shuō)明含類黃酮物質(zhì)。
[0057] (6)濃硫酸反應(yīng)：加 I. 5mL濃H2SO4,輕輕搖勻，再置沸水浴5min。所有蕓薹屬材料 均呈現(xiàn)不同程度的黃色，說(shuō)明含黃酮（醇），沸水中5min顏色不改變，說(shuō)明不含查爾酮、橙 酮，可能不含二氫黃酮，可能含異黃酮和二氫異黃酮。蘿卜花出現(xiàn)橙黃色，說(shuō)明含有花青素。
[0058] (7)四氫硼鈉反應(yīng)：加四氫硼鈉8mg，再加1. 0%鹽酸2mL，輕輕搖勻，靜置此。所 有蕓薹屬材料均呈現(xiàn)程度不同的黃色，說(shuō)明不含二氫黃酮和二氫黃酮醇。蘿卜花呈現(xiàn)極淡 粉紅色，說(shuō)明含有二氫黃酮和/或二氫黃酮醇。
[0059] (8)堿性試劑反應(yīng)：加5% Na2CO3 3ml，輕輕搖勻，密閉靜置30min，通空氣lOmin。 所有材料均呈現(xiàn)程度不同的黃色，通空氣后顏色不變，說(shuō)明不含二氫黃酮醇。
[0060] (9)氨性氯化銫反應(yīng)：取甲醇IOml,加氨水定容至25ml,成為被氨水飽和的甲醇溶 液。向樣品液中加入〇. 〇lmol/L氯化鍶甲醇液10滴，再加被氨水飽和的甲醇液10滴，用手 輕輕搖勻，靜置lh。蘿卜花呈現(xiàn)出沉淀，說(shuō)明有3'，4' -二羥基取代。
[0061] (10)硼酸反應(yīng)：加1.0%硼酸10滴，再加2.0% H3BO3 3ml，芥藍(lán)白花瓣呈現(xiàn)出無(wú) 色，說(shuō)明芥藍(lán)白花瓣類黃酮可能不含c5-oh。
[0062] 3、花瓣色素成分的紫外-可見(jiàn)光譜分析
[0063] (1)葉綠素：稱取保存的花瓣0. 100g，迅速用液氮研磨至粉末，采用體積分?jǐn)?shù)為 90%的丙酮：乙醇（4:1，V/V)提取24h，過(guò)濾，定容至25ml，采用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)在 200?700nm范圍內(nèi)掃描。結(jié)果表明，所有樣品在662nm和644nm處均無(wú)吸收峰，說(shuō)明均不 含葉綠素。
[0064] (2)類胡蘿卜素：稱取保存的花瓣0. 100g，迅速用液氮研磨至粉末，加入石油醚： 丙酮（I: I，V/V)提取24h，過(guò)濾，定容至25ml，采用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)在200?700nm 范圍內(nèi)掃描。結(jié)果表明，甘藍(lán)型油菜、白菜型油菜、芥菜型油菜、羽衣甘藍(lán)在440和470nm 左右都有吸收峰，說(shuō)明含有類胡蘿卜素，定量分析測(cè)定的含量分別為6. 824、6. 712、5. 548、 I. 248mg/g。而芥藍(lán)和蘿卜花瓣則沒(méi)有特征吸收峰，說(shuō)明不含有類胡蘿卜素。
[0065] (3)類黃酮：稱取保存的花瓣0. 100g，迅速用液氮研磨至粉末，加入鹽酸化甲醇 (pH = 3) 2ml置于4 °C冰箱中提取24h，過(guò)濾，定容至25ml，用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)在 220?600nm范圍內(nèi)掃描。結(jié)果表明，甘藍(lán)型油菜、白菜型油菜、芥菜型油菜、羽衣甘藍(lán)、芥 藍(lán)、蘿卜花瓣的提取液在330和270nm均有吸收峰，說(shuō)明他們都含有類黃酮化合物，定量分 析測(cè)定的含量分別為 483、7· 651、7· 001、L 391、L 003、8· 373mg/g。
[0066] (4)花青素苷：稱取保存的花瓣0. 100g，迅速用液氮研磨至粉末，加入甲醇提取 24h，過(guò)濾，定容至50ml，用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)在200?700nm范圍內(nèi)掃描。結(jié)果表 明，蘿卜花瓣色素在532nm左右有較明顯的花色苷特征吸收峰，是花色苷帶I吸收峰，在 260-270nm區(qū)域內(nèi)以一個(gè)不太強(qiáng)帶II的峰，定量分析測(cè)定的含量為237. 27mg/100g。所有 蕓薹屬樣本均無(wú)花色苷吸收峰，即不含花色苷。
[0067] 實(shí)施例3、蕓薹屬和蘿卜花瓣色素生物合成途徑的分子鑒定
[0068] (1)蕓薹屬和蘿卜花瓣類黃酮途徑基因的表達(dá)特征
[0069] 為研究蕓薹屬和蘿卜花瓣色素出現(xiàn)差異的分子機(jī)理，設(shè)計(jì)蕓薹屬和蘿卜類黃酮途 徑基因的RT-PCR檢測(cè)引物，并以5SrRNA作為內(nèi)參，具體如表1所示：
[0070] 表1、類黃酮途徑RT-PCR檢測(cè)引物
[0071]

【權(quán)利要求】
1. 干擾蕓薹屬植物花瓣中0 -環(huán)化酶基因LCYB、e -環(huán)化酶基因LCYE表達(dá)同時(shí)超量 表達(dá)GL3基因在制備花瓣呈紅色的蕓薹屬植物品種中的應(yīng)用。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于：所述干擾蕓薹屬植物花瓣中￠-環(huán)化酶 基因LCYB、e -環(huán)化酶基因LCYE表達(dá)的序列如SEQ ID NO. 2所示，所述超量表達(dá)GL3基因 的序列如SEQ ID NO. 3所示。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于：所述干擾蕓薹屬植物花瓣中￠-環(huán)化酶 基因LCYB、e -環(huán)化酶基因LCYE表達(dá)的序列由擬南芥花瓣特異啟動(dòng)子PAtAP3介導(dǎo)表達(dá)，所 述花瓣特異啟動(dòng)子PAtAP3的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1第267位至第1044位所示。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于：所述蕓薹屬植物為甘藍(lán)型油菜 (Brassica napus)〇
5. 干擾蕓薹屬植物花瓣中P -環(huán)化酶基因LCYB、e -環(huán)化酶基因LCYE表達(dá)同時(shí)超量 表達(dá)GL3基因的植物表達(dá)載體，其特征在于：所述植物載體包括由花瓣特異啟動(dòng)子介導(dǎo)的 表達(dá)0 -環(huán)化酶基因LCYB、e -環(huán)化酶基因LCYE RNA干擾序列的表達(dá)框和由組成型啟動(dòng)子 介導(dǎo)表達(dá)GL3基因的表達(dá)框。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的植物表達(dá)載體，其特征在于：所述花瓣特異啟動(dòng)子介導(dǎo)表達(dá) 3 -環(huán)化酶基因LCYB、e -環(huán)化酶基因LCYE RNA干擾序列的表達(dá)框依次由花瓣特異啟動(dòng)子 PAtAP3、SEQ ID NO. 2所不的序列、間隔序列、SEQ ID NO. 2所不的反向互補(bǔ)序列和NOS終止 子組成。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的植物表達(dá)載體，其特征在于：所述由組成型啟動(dòng)子介導(dǎo)表達(dá) GL3基因的表達(dá)框依次由CaMV35S啟動(dòng)子，SEQ ID NO. 3所示序列和N0S終止子組成。
8. 權(quán)利要求5-7任一項(xiàng)所述植物表達(dá)載體的制備方法，其特征在于，包括如下步 驟：將SEQ ID NO. 1所示序列經(jīng)AscI和Swal雙酶切后連入經(jīng)同樣酶切的pFGC5941M質(zhì) 粒，得PFGC5941CEPE質(zhì)粒，然后將SEQ ID NO. 2所示的序列連入pFGC5941CEPE載體的 PAtAP3啟動(dòng)子與間隔序列之間，形成中間載體pFGC5941CEPE-B2RNAia，再將SEQ ID NO. 2 所示序列反向連入中間載體PFGC5941 CEPE-B2RNAia的間隔序列與0CS終止子之間，得 pFGC5941CEPE-B2RNAi載體，最后將SEQ ID NO. 3所示序列通過(guò)Ncol和AscI酶切位點(diǎn)連入 經(jīng)同樣酶切的pFGC5941CEPE-B2RNAi載體，得干擾蕓薹屬植物花瓣中0 -環(huán)化酶基因LCYB、 e -環(huán)化酶基因LCYE基因表達(dá)同時(shí)超量表達(dá)GL3基因的植物表達(dá)載體。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的制備方法，其特征在于：所述間隔序列為甘藍(lán)型油菜PAP2基 因第2內(nèi)含子。
10. 利用權(quán)利要求5-7任一項(xiàng)所述植物表達(dá)載體制備花瓣呈紅色的蕓薹屬植物品種的 方法，其特征在于，包括如下步驟： a. 將權(quán)利要求5-7任一項(xiàng)所述植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，制得工程菌； b. 將步驟a所得工程菌轉(zhuǎn)化蕓薹屬植物無(wú)菌苗的下胚軸，共培養(yǎng)后，在Basta除草劑抗 性下誘導(dǎo)分化獲得再生苗，篩選陽(yáng)性苗轉(zhuǎn)基因苗得花瓣呈紅色的蕓薹屬植物品種。
【文檔編號(hào)】C12N15/82GK104404079SQ201410793847
【公開(kāi)日】2015年3月11日 申請(qǐng)日期:2014年12月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月19日
【發(fā)明者】劉雪, 柴友榮, 廖霏霏, 董博, 付春, 薛雨飛, 王伯驍, 譚莉, 周清源, 周羽 申請(qǐng)人:西南大學(xué)