專利名稱：改造基因OsbZIP46CA1在控制水稻抗旱性中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及水稻基因工程領(lǐng)域。具體涉及(I)通過基因操作改造了水稻bZIP家族基因0sbZIP46，克隆到一種能夠提高水稻對(duì)干旱耐受能力的基因0sbZIP46CAl，(2)基因0sbZIP46CAl在水稻抗旱性遺傳改良中的應(yīng)用。本發(fā)明采用基因改造的方法，克隆了水稻bZIP家族基因0sbZIP46缺失內(nèi)部297個(gè)堿基后的片段0sbZIP46CAl，實(shí)驗(yàn)證明0sbZIP46CAl具有強(qiáng)轉(zhuǎn)錄激活活性，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)超量表達(dá)0sbZIP46CAl基因后增強(qiáng)了水稻抗旱的能力，證實(shí)了該基因的功能及應(yīng)用途徑。
背景技術(shù)：
水稻是世界上最重要的糧食作物之一，隨著環(huán)境問題日益嚴(yán)重，水稻生產(chǎn)也面臨許多新的挑戰(zhàn)，其中非常重要的一個(gè)就是各種非生物逆境對(duì)水稻生長(zhǎng)發(fā)育的影響。水資源短缺以及土壤鹽潰化是目前制約農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的一個(gè)全球性問題，全球很多耕地為干旱、半干 旱地區(qū)，而且很多受到鹽害威脅。在自然條件下，由于環(huán)境脅迫而嚴(yán)重影響了水稻等作物生長(zhǎng)發(fā)育，其遺傳潛力難以發(fā)揮，造成作物減產(chǎn)，并使生態(tài)環(huán)境日益惡化。因此，提高水稻的抗旱、耐鹽能力已經(jīng)成為現(xiàn)代植物研究工作中急需解決的關(guān)鍵問題之一。通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)對(duì)水稻品種進(jìn)行抗逆性遺傳改良顯得越發(fā)重要，尋找水稻中可真正用于抗逆性遺傳改良的基因是其中的關(guān)鍵。植物對(duì)逆境有著復(fù)雜的應(yīng)答系統(tǒng)，涉及的基因有非常多的種類，包括調(diào)節(jié)基因和一些下游的功能基因等。轉(zhuǎn)錄因子對(duì)植物逆境反應(yīng)有非常重要的調(diào)控作用，其中很重要的一類就是bZIP家族(Jakoby等，2002)，bZIP轉(zhuǎn)錄因子含有堿性亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域，通過依賴于ABA的途徑廣泛參與植物對(duì)非生物逆境的應(yīng)答。非生物逆境以及外源ABA能誘導(dǎo)植物體內(nèi)ABA的合成，bZIP蛋白也隨之被激活并與ABA應(yīng)答元件ABRE (ABA responsiveelement)結(jié)合，啟動(dòng)下游基因的表達(dá)(Choi等，2000)。擬南芥中和水稻中都已鑒定了一些參與逆境應(yīng)答的bZIP轉(zhuǎn)錄因子，包括ABFl/2/3、ABI5、0sbZIP23等。其他轉(zhuǎn)錄因子家族(如DREB, NAC, Zinc finger等)也鑒定了許多逆境相關(guān)的成員，例如擬南芥中的CBF1/2/3，水稻中的SNACUDST1等。這些轉(zhuǎn)錄因子通過感受上游逆境信號(hào)之后，直接結(jié)合到下游靶基因的啟動(dòng)子區(qū)，調(diào)控這些下游基因的表達(dá)，從而控制植物對(duì)逆境的適應(yīng)能力。在鑒定逆境應(yīng)答基因得過程中，發(fā)現(xiàn)許多基因直接參與逆境應(yīng)答的調(diào)控，也有許多基因自然狀態(tài)下的形式并不能參與逆境應(yīng)答或不能完全表現(xiàn)出它的功能，需要經(jīng)過一定的人工修飾后才能完全體現(xiàn)出調(diào)控逆境應(yīng)答的能力，這些基因在植株體內(nèi)的作用過程可能需要一些依賴逆境調(diào)控的對(duì)基因的加工，或需要對(duì)基因表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行相關(guān)修飾、構(gòu)象變化。如擬南芥的轉(zhuǎn)錄因子DREB2A全長(zhǎng)形式表現(xiàn)出較弱的轉(zhuǎn)錄激活活性，超表達(dá)DREB2A并不能顯著誘導(dǎo)下游基因的表達(dá)，超表達(dá)植株的抗逆性也無顯著改變，而當(dāng)將DREB2A中間的一個(gè)NRD(negative regulatory domain)區(qū)段缺失后,表現(xiàn)出很強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄激活活性,對(duì)其超表達(dá)后顯著增強(qiáng)了下游基因的表達(dá)，增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因植株的抗旱性(Yoh Sakuma等，2006)。本發(fā)明涉及的0sbZIP46基因是水稻中bZIP家族成員之一。0sbZIP46全長(zhǎng)形式并沒有轉(zhuǎn)錄激活活性，將0sbZIP46基因全長(zhǎng)超表達(dá)水稻并沒有提高轉(zhuǎn)基因植株的抗旱性。申請(qǐng)人通過基因改造的方法，克隆了 0sbZIP46缺失內(nèi)部297個(gè)堿基后的片段0sbZIP46CAl，實(shí)驗(yàn)證明0sbZIP46CAl具有強(qiáng)轉(zhuǎn)錄激活活性，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)超量表達(dá)0sbZIP46CAl基因后增強(qiáng)了水稻抗旱的能力，因此本發(fā)明建立一種能顯著增強(qiáng)水稻抗旱性的0sbZIP46基因的新形式0sbZIP46CAl，對(duì)于水稻抗旱遺傳改良具有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的涉及一個(gè)bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族成員0sbZIP46的新形式基因0sbZIP46CAl在控制水稻抗旱性改良中的應(yīng)用。申請(qǐng)人克隆了水稻bZIP轉(zhuǎn)錄因子0sbZIP46缺失第361位至第657位堿基(共297個(gè)堿基，涉及編碼99個(gè)氨基酸的部分)后的片段，將該基因命名為0sbZIP46CAl (0sbZIP46Constitutive Activeform)。本發(fā)明克隆和應(yīng)用一種包含0sbZIP46CAl基因的DNA片段，該片段賦予水稻在干旱脅迫條件下抗旱性增強(qiáng)的能力。其中，所述的含有0sbZIP46CAl基因的核苷酸序列如序列表SEQ NO :1所示，序列長(zhǎng)度為678bp，它對(duì)應(yīng)的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示，其氨基酸序列為225個(gè)。 攜帶有本發(fā)明0sbZIP46CAl基因的表達(dá)載體可通過使用Ti質(zhì)粒，植物病毒載體，直接DNA轉(zhuǎn)化，微注射，電穿孔等常規(guī)生物技術(shù)方法導(dǎo)入植物細(xì)胞(Weissbach，1998，Method for Plant Molecular Biology VIII, Academy Press, New York, pp. 411—463 ;Geiserson and Corey,1998, Plant Molecular Biology(2nd Edition))。可使用包括本發(fā)明的0sbZIP46CAl基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主(包括水稻在內(nèi)多種植物)，培育抗旱植物品種。本發(fā)明基因是受干旱誘導(dǎo)表達(dá)的，因此可將本發(fā)明的基因與任何感興趣的干旱誘導(dǎo)啟動(dòng)子結(jié)合后連入合適的表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化植物宿主，在干旱條件下可誘導(dǎo)表達(dá)基因，提高植物抗旱性。下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明。


序列表SEQ ID N0:1是本發(fā)明改造、克隆的包含有0sbZIP46CAl基因編碼區(qū)的核苷酸序列，序列長(zhǎng)度為678bp，它對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)的氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示，氨基酸序列為225個(gè)。圖I. 0sbZIP46CAl蛋白轉(zhuǎn)錄激活活性研究。根據(jù)序列分析，0sbZIP46轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)含a-d四個(gè)保守區(qū)域，其中缺失d區(qū)域的蛋白(dC5，dC6，CAl)具有強(qiáng)轉(zhuǎn)錄激活活性。圖2. 0sbZIP46CAl超表達(dá)載體示意圖及超表達(dá)植株的轉(zhuǎn)基因表達(dá)量檢測(cè)，WT為野生型對(duì)照。圖3. 0sbZIP46CAl的超表達(dá)植株干旱脅迫下的表型，0X1、0X7為超表達(dá)家系，ZHl I
為野生型。圖4. 0sbZIP46CAl的超表達(dá)植株干旱脅迫下的存活率統(tǒng)計(jì)，0X1、0X7為超表達(dá)家系，ZHll為野生型。圖5. 0sbZIP46CAl的超表達(dá)植株離體葉片失水速率測(cè)定，CAlU-I OX, CA1U-3 OX為超表達(dá)家系，CA1U-4 NOX為轉(zhuǎn)基因陰性家系，ZHll為野生型對(duì)照。
圖6. 0sbZIP46CAl 的超表達(dá)植株滲透脅迫表型，0sbZIP46CAlU_l，0sbZIP46CAlU_5為0sbZIP46CAl超表達(dá)家系，0sbZIP46U-15為0sbZIP46全長(zhǎng)的超表達(dá)家系(作為對(duì)照)，ZHll為野生型對(duì)照。圖7. 0sbZIP46CAl的超表達(dá)植株滲透脅迫下株高統(tǒng)計(jì)，15_0X、2_0X為超表達(dá)家系，15-NCK.2-NCK為分離出來的轉(zhuǎn)基因陰性家系。圖8. 0sbZIP46CAl超表達(dá)植株中下游基因的誘導(dǎo)情況，CA10X-2，CA10X-5為0sbZIP46CAl超表達(dá)家系，F(xiàn)L0X-9, FLOX-15為0sbZIP46全長(zhǎng)的超表達(dá)家系(作為對(duì)照)，ZHll為野生型對(duì)照。
具體實(shí)施方式
以下實(shí)施例定義了本發(fā)明，并描述了本發(fā)明在分離、克隆包含有0sbZIP46CAl基因完整編碼區(qū)段的DNA片段，以及驗(yàn)證0sbZIP46CAl基因功能的方法。根據(jù)以下的描述的全部或部分實(shí)施步驟，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定本發(fā)明的基本特征，并且在不偏離本發(fā)明精神和范圍的情況下，可以對(duì)本發(fā)明做出各種改變和修改，以使其適用不同的用途和條件。l、0sbZIP46CAl蛋白轉(zhuǎn)錄激活活性研究申請(qǐng)人:的發(fā)明人用 ProQuest Two-Hybrid System(Invitrogen, Carlsbad, CA,USA)在酵母中做了 0sbZIP46CAl蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄激活活性分析。首先通過PCR得到了 0sbZIP46基因的全長(zhǎng)以及一系列缺失片段。通過查找在水稻基因組注釋網(wǎng)站 TIGR (http: //rice, plantbiology. msu. edu/) 0sbZIP46 基因的注釋號(hào)L0C_0s06gl0880,與 KOME (http://cdnaOl. dna. affrc. go. jp/cDNA/) 0sbZIP46基因的注釋號(hào)AK103188，在華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的明恢63全生育期平衡化cDNA文庫(Chu等，2003)中檢索到一個(gè)含有0sbZIP46基因編碼區(qū)5 ’部分序列的cDNA克隆(克隆號(hào)BI 103-013)(該文庫對(duì)外公開的網(wǎng)址http: //redb. ncpgr. cn/modules/redbtools/),從文庫中挑取該克隆，抽提質(zhì)粒，利用通用引物SP6(5’ -AITTAGGTGACACTATA-3’)、T7(5’ -TAATACGACTCACTATAGGG-3’ )從兩端進(jìn)行了測(cè)序驗(yàn)證，測(cè)序工作在本室ABI7500儀器上完成。然后與KOME數(shù)據(jù)庫中的0sbZIP46基因的全長(zhǎng)cDNA進(jìn)行序列比較，確定克隆BI 103-013包含0sbZIP46基因的完整開放閱讀框。利用上述克隆為模板，使用正向引物 0sbZIP46p32Fl_attBl (5’-ggacaagtttgtacaaaaaagcaggctTGGAGITGCCGGCGGATG-3’)，和下列的I個(gè)反向引物分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，0sbZIP46p32Rl_attB2(5’-ggaccactttgtacaagaaagctgggtTCAGCATGGACCAGTCAGTG-3 ’),0sbZIP46p32R2_attB2(5’-ggaccactttgtacaagaaagctgggtTCMGTGATTCTCTCCATGAC-3 ’),0sbZIP46p32R4_attB2(5’-ggaccactttgtacaagaaagctgggtTCACTCGACGGTAGGGCCCTTC-3，)，0sbZIP46p32R5_attB2 (5，-ggaccactttgtacaagaaagctgggtTCACAGCATCCCGTTGGCGAGC-3，)，0sbZIP46CA0R-attB2(5，-ggaccactttgtacaagaaagctgggtTCACATGTCCTCCCGCACGAC-3’),0sbZIP46p32R6_attB2(5’-ggaccactttgtacaagaaagctgggtTCACGCAGCCGCCGCCGCCGCGGGGTC-3’)，0sbZIP46p32R7_attB2(5，-ggaccactttgtacaagaaagctgggtTCACGCCGCCGGCGCTATGGCCTG-3，)，反應(yīng)條件為94°C 預(yù)變性5min ；94°C 30sec，55°C 30sec，72°C lmin，32 個(gè)循環(huán);72°C延伸 5min。得到的片段分別命名為 FL, dCl，dC3，dC4, dC4. 5，dC5, dC6，分別指代 0sbZIP46 全長(zhǎng)、缺失 0sbZIP46 的 3，端 19、85、144、175、204、264個(gè)氨基酸的片段。0sbZIP46CAl的克隆使用交錯(cuò)延伸PCR的方法，仍以上述克隆 BI 103-013 為模板，分別用兩對(duì)引物 0sbZIP46p32Fl-attBl(5’_ggacaagtttgtacaaaaaagcaggctTGGAGTTGCCGGCGGATG-3’)/0sbZIP46CuActRl(5’-CGCAGCCGCCGCCGCCGCGGGGTC-3，)和 0sbZIP46CuActFl(5， -GACCCCGCGGCGGCGGCGGCTGCGTCGCCGGTGCCTTACCCA-3， )/0sbZIP46p32Rl_attB2 (5，-ggaccactttgtacaagaaagctgggtTCAGCATGGACCAGTCAGT6_3，)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性 5min ；94°C 30sec,55°C 30sec,72°C lmin，32 個(gè)循環(huán)；72°C延伸5min。再以將上輪PCR反應(yīng)的兩個(gè)PCR產(chǎn)物混合作為為模板，以引物0sbZIP46p32Fl_attBl(5，-ggacaagtttgtacaaaaaagcaggctTGGAGTTGCCGGCGGATG-3，)/0sbZIP46p32Rl-attB2 (5，-ggaccactttgtacaagaaagctgggtTCAGCATGGACCAGTCAGTG-3，)進(jìn)行第二輪 PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性 5min ；94°C 30sec,55°C 30sec,72°C lmin，35 個(gè)循環(huán)；72°C延伸5min,弓丨物再第8個(gè)循環(huán)時(shí)加入，PCR擴(kuò)增得到的片段命名為0sbZIP46CAl，即缺失0sbZIP46第361位至第657位堿基(涉及編碼0sbZIP46的第121至219位氨基酸的部分)。然后將這些片段克隆到相應(yīng)的載體中去并轉(zhuǎn)化酵母進(jìn)行轉(zhuǎn)錄活性研究，具體步驟如下擴(kuò)增片段通過BP反應(yīng)進(jìn)入中間載體pD0NR221(購(gòu)自Invitrogen公司)，分別命名為 FL/dCl/dC3/dC4/dC4. 5/dC5/dC6/0sbZIP46CAl_p221 并測(cè)序驗(yàn)證，然后通過 LR 重組反應(yīng)到酵母GAL4-DB融合表達(dá)載體pDEST32 (購(gòu)自Invitrogen公司)，分別命名為FL/dCl/dC3/dC4/dC4. 5/dC5/dC6/0sbZIP46CAl-p32。然后轉(zhuǎn)化酵母菌株May203 (購(gòu)自 Invitrogen 公司，生態(tài)型為 MATa，leu2_3，112，trpl-901，his3 A200,ade2-101, gal4A , gal80A , SPALlO::URA3, GALl::lacZ, HIS3UAS GALl::HIS30LYS2，canlR, cyh2R)。經(jīng)和 Colony-lift filter 檢測(cè) 3-Galactosidase 酶活性，以酵母是否顯藍(lán)色確定報(bào)告基因LacZ的表達(dá)，從而確定基因是否具有轉(zhuǎn)錄激活功能(具體步驟參照Invitrogen公司操作手冊(cè))(圖I)。試驗(yàn)結(jié)果顯示，0sbZIP46全長(zhǎng)和缺失3’端19、85、144、175個(gè)氨基酸的片段都無轉(zhuǎn)錄激活活性，而缺失3’端204個(gè)氨基酸(dC6)、缺失3’端264個(gè)氨基酸(dC7)或缺失第121至219位氨基酸(0sbZIP46CAl)的片段都表現(xiàn)出很強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄活性，推論0sbZIP46的第120至149位氨基酸之間存在一段負(fù)調(diào)控0sbZIP46轉(zhuǎn)錄激活活性的區(qū)段，而0sbZIP46CAl為人工改造的去除了中間的負(fù)調(diào)控區(qū)段、具有強(qiáng)轉(zhuǎn)錄激活活性的0sbZIP46新形式，同時(shí)它也包含了 DNA結(jié)合和寡聚化所必需的bZIP (堿性亮氨酸拉鏈區(qū))結(jié)構(gòu)域，所以0sbZIP46CAl作為一種0sbZIP46的組成性活性形式，將成為本發(fā)明的主要研究對(duì)象(圖I)。2、0sbZIP46CAl基因超量表達(dá)載體的構(gòu)建和遺傳轉(zhuǎn)化超量表達(dá)載體的構(gòu)建為了研究0sbZIP46CAl基因的抗逆功能，申請(qǐng)人將其在水稻中超量表達(dá)，期望從轉(zhuǎn)基因植株的表型來研究該基因的功能。超量表達(dá)載體構(gòu)建方法如下上述試驗(yàn)我們已獲得了 0sbZIP46CAl的克隆0sbZIP46CAl_p32，以此克隆為模板，用引物 0sbZIP46-F-Kpnl (5，-ATAggtaccATGGAGITGCCGGCGGATG-3，)/0sbZIP46-R_BamHl (5’-ATAggatccTCAGCATGGACCAGTCAGTG)進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物用 KpnI 和 BamHI 雙酶切；同時(shí)，用同樣的方法酶切攜帶Ubiquitin啟動(dòng)子的遺傳轉(zhuǎn)化載體pCAMBIA1301U(pCAMBIA1301U是在國(guó)際上常用的植物遺傳轉(zhuǎn)化載體PCAMBIA1301基礎(chǔ)上改建的，攜帶具有組成型和超量表達(dá)特征的玉米u(yù)biquitin啟動(dòng)子的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化載體)，酶切完畢，用氯仿異戊醇(體積比為24 I)抽提，純化酶切產(chǎn)物。用包含0sbZIP46CAl基因的酶切片段和酶切的PCAMBIA1301U載體做連接反應(yīng)，其后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DHlO ^ (該大腸桿菌DHlOP菌株購(gòu)自Promega公司)。通過酶切篩選陽性克隆，獲得的重組質(zhì)粒載體被命名為0sbZIP46CAl-1301U(圖 2A)。遺傳轉(zhuǎn)化步驟通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化方法(其具體步驟如下所述)將上述超表達(dá)載體0sbZIP46CAl-1301U轉(zhuǎn)入到水稻品種“中花11”中，經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)、侵染、共培養(yǎng)、篩選具有潮霉素抗性的愈傷、分化、生根、練苗、移栽，得到轉(zhuǎn)基因植株。上述農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻(中花11)遺傳轉(zhuǎn)化方法(體系)在Hiei等人報(bào)道的方法(Hi ei等,Efficient transformationof rice,Oryza sativa L. ,mediated by Agrobacterium and sequence analysis of theboundaries of the T-DNA,Plant J,6 :271-282,1994)基礎(chǔ)上改良進(jìn)行。本實(shí)施例的具體遺傳轉(zhuǎn)化步驟如下(I)電轉(zhuǎn)化用1800v電壓，將最終超表達(dá)目標(biāo)載體0sbZIP46CAl_1301U電轉(zhuǎn)化入農(nóng)桿菌EHA105菌株，涂到帶有對(duì)應(yīng)抗性選擇的LA培養(yǎng)基上，篩選出陽性克隆，用于下述轉(zhuǎn)化愈傷。(2)愈傷組織誘導(dǎo)將成熟的水稻種子中花11去殼，然后依次用70%的乙醇處理I分鐘；0. 15%氯化汞(HgCl2)表面消毒15分鐘；用滅菌水洗種子4-5次；將該消過毒的種子放在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上(成分見后)；將接種后的誘導(dǎo)培養(yǎng)基置于黑暗處培養(yǎng)4周，溫度25±1°C。(3)愈傷繼代挑選亮黃色、緊實(shí)且相對(duì)干燥的胚性愈傷，放于繼代培養(yǎng)基(成分見后)上黑暗下培養(yǎng)2周，溫度25±1°C。(4)預(yù)培養(yǎng)挑選緊實(shí)且相對(duì)干燥的胚性愈傷，放于預(yù)培養(yǎng)基(成分見后)上黑暗下培養(yǎng)2周，溫度25±1°C。(5)農(nóng)桿菌培養(yǎng)在帶有對(duì)應(yīng)抗性選擇的LA培養(yǎng)基上(成分見后)預(yù)培養(yǎng)農(nóng)桿菌EHA105 (來源于CAMBIA，商用菌株，攜帶有本發(fā)明的超表達(dá)載體0sbZIP46CAl_1301U)兩天，培養(yǎng)溫度28V ;將所述的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)移至懸浮培養(yǎng)基(成分見后)，28°C搖床上培養(yǎng)2-3小時(shí)。(6)農(nóng)桿菌侵染將預(yù)培養(yǎng)的愈傷轉(zhuǎn)移至滅菌好的瓶子內(nèi)；調(diào)節(jié)農(nóng)桿菌的懸浮液至0D_ 0. 8-1. 0 ;將愈傷在農(nóng)桿菌懸浮液中浸泡30分鐘；轉(zhuǎn)移愈傷至滅菌好的濾紙上吸干；然后放置在共培養(yǎng)基(成分見后)上培養(yǎng)3天，培養(yǎng)溫度19-20°C。(7)愈傷洗漆和選擇培養(yǎng)滅菌水洗漆愈傷至看不見農(nóng)桿菌；浸泡在含400ppm羧芐青霉素(CN)的滅菌水中30分鐘；轉(zhuǎn)移愈傷至滅菌好的濾紙上吸干；轉(zhuǎn)移愈傷至選擇培養(yǎng)基(成分見后)上選擇2-3次，每次2周(第一次篩選羧芐青霉素濃度為400ppm，第二次以后為250ppm,潮霉素濃度250ppm)。(8)分化將抗性愈傷轉(zhuǎn)移至預(yù)分化培養(yǎng)基(成分見后)上黑暗處培養(yǎng)5-7天；轉(zhuǎn)移預(yù)分化培養(yǎng)的愈傷至分化培養(yǎng)基上(成分見后)，光照(35001uX)下培養(yǎng)，溫度26°C。(9)生根剪掉分化時(shí)產(chǎn)生的根；然后將其轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基中光照下培養(yǎng)2-3周，溫度26°C。(10)移栽洗掉根上的殘留培養(yǎng)基，將具有良好根系的幼苗轉(zhuǎn)入溫室，同時(shí)在最初的幾天保持水分濕潤(rùn)。
培養(yǎng)基組分及其配方(I)試劑和溶液縮寫本發(fā)明中培養(yǎng)基所用到的植物激素的縮寫表示如下6-BA (6-BenzyIaminoPurine, 6-節(jié)基腺嘌呤)；CN (Carbenici 11 in,羧節(jié)青霉素)；KT (Kinetin,激動(dòng)素)；NAA (Napthalene acetic acid,萘乙酸)；IAA(Indole-3_aceticacid, 口引哚乙酸)；2,4-D (2,4-Dichlorophenoxyacetic acid, 2,4- 二氯苯氧乙酸)；AS(Acetosringone,乙酸丁香酮)；CH(Casein Enzymatic Hydrolysate,水解酪蛋白)；HN(Hygromycin B,潮霉素)；DMS0 (Dimethyl Sulfoxide, 二甲基亞諷)；N6max (N6 大量成分溶液);N6mix (N6微量成分溶液);MSmax (MS大量成分溶液);MSmix (MS微量成分溶液)。(2)主要溶液配方1)N6培養(yǎng)基大量元素母液[10倍濃縮液(IOX)]的配制
硝酸鉀(KNO3)28.3 g
磷酸二氫鉀(KH2PO4)4.0 g
硫酸銨((NH4)2SO4)4.63 g
硫酸鎂(MgSO4IH2O)1.85 g
氯化鈣(CaCl2 OH2O)1.66 g逐一溶解,然后室溫下定容至1000ml。2) N6培養(yǎng)基微量元素母液[100倍濃縮液(100X)]的配制
碘化鉀(KI)0.08 g
硼酸(H3BO3)0.16 g
硫酸錳(MnSO4MH2O)0.44 g
硫酸鋅(ZnS04.7H20)0.15 g室溫下溶解并定容至1000ml。3)鐵鹽(Fe2EDTA)貯存液(100X)的配制準(zhǔn)備800ml雙蒸水并加熱至70°C，加入乙二銨四乙酸二鈉(Na2EDTA 2H20) 3. 73克，充分溶解后在70°C水浴中保持2小時(shí)，定容至1000ml，4°C保存?zhèn)溆谩?)維生素貯存液(100X)配制
煙酸(Nicotinicacid)0.1 g
維生素BI (Thiamine HCD0.1 g
維生素B6 (Pyridoxine HCl)0.1 g
甘氨酸(Glycine)0.2 g
肌醇(Inositol)IOg加水定容至1000ml，4°C保存?zhèn)溆谩?)MS培養(yǎng)基大量元素母液(IOX)的配制硝酸銨(NH4NO3)16.5 g
硝酸鉀19.0 g
磷酸二氫鉀1.7 g
硫酸鎂3.7 g
氯化鈣4.4 g室溫下溶解并定容至1000ml。6)MS培養(yǎng)基微量元素母液(100X)的配制
碘化鉀0.083 g
硼酸0.62 g
硫酸錳0.86 g
鉬酸鈉(Na2MoO4JH2O)0.025 g
硫酸銅(CuSCV5H20)0.0025 g室溫下溶解并定容至1000ml。7)2,4-D|C存液(lmg/ml)的配制稱取2，4-D lOOmg，用Iml IN氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加IOml蒸餾水溶解完全后定容至IOOml,于室溫下保存。8)6-BA|C存液(lmg/ml)的配制稱取6-BA IOOmg,用ImllN氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加IOml蒸餾水溶解完全后定容至100ml，室溫保存。9)萘乙酸(NAA)貯存液(lmg/ml)的配制稱取NAA IOOmg,用ImllN氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加IOml蒸餾水溶解完全后定容至IOOml，4°C保存?zhèn)溆谩?0)吲哚乙酸(IAA)貯存液(lmg/ml)的配制稱取IAA lOOmg，用ImllN氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加IOml蒸餾水溶解完全后定容至100ml，4°C保存?zhèn)湓谝粋€(gè)大三角瓶中加入300ml蒸餾水和硫酸鐵(FeSO4 *7H20)2. 78g。在另一個(gè)大三角瓶中加入300ml蒸餾水用。11)葡萄糖貯存液(0. 5g/ml)的配制稱取葡萄糖125g，然后用蒸餾水溶解定容至250ml，滅菌后4°C保存?zhèn)溆谩?2) AS貯存液的配制稱取AS 0. 392g, DMSO 10ml，分裝至I. 5ml離心管內(nèi)，4°C保存?zhèn)溆谩?3) IN氫氧化鉀貯存液稱取氫氧化鉀5. 6g，并用蒸餾水溶解定容至100ml，室溫保存?zhèn)溆谩?3)用于水稻遺傳轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)基配方I)誘導(dǎo)培養(yǎng)基N6max 母液(IOX)100 ml
N6mix 母液(100X)IOml
Fe2+EDTA 貯存液(100X)IOml
維生素IC存液(100X)IOml
2，4-D 貯存液2.5 ml
脯氨酸(Proline)0.3 g
CH0.6 g
鹿糖(Sucrose)30g
Phytagel3 g加蒸餾水至900ml，IN氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5. 9，煮沸并定容至1000ml，分裝到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口滅菌。2)繼代培養(yǎng)基
N6max 母液(IOX)IOOml
N6mix 母液(100X)IOml
Fe2+EDTA 貯存液(100X)IOml
維生素貯存液(100X)IOml
2,4-D 貯存液2.0 ml
脯氨酸0.5 g
CH0.6 g
蔗糖30 g
Phytagel3 g加蒸餾水至900ml，IN氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5. 9，煮沸并定容至1000ml，分裝到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口滅菌。3)預(yù)培養(yǎng)基
N6max 母液(IOX)12.5 ml
N6mix 母液(100X)1.25 ml
Fe2+EDTA 貯存液(100X)2.5 ml
維生素存液(100X)2.5 ml
2,4-D 貯存液0.75 ml
CH0.15 g
蔗糖5 g
瓊脂粉(Agarose)1.75 g加蒸餾水至250ml，IN氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5. 6，封口滅菌。使用前加熱溶解培養(yǎng)基并加入5ml葡萄糖貯存液和250 u I AS貯存液，分裝倒入培養(yǎng)皿中(25ml/皿)。4)共培養(yǎng)基
N6max 母液(IOX)12.5 ml
N6mix 母液(100X)1.25ml
Fe2+EDTA 貯存液(100X)2.5 ml
維生素貯存液(100X)2.5 ml
2.4-D貯存液0.75 ml CH0.2 g 蔗糖5g 瓊脂粉1.75 g加蒸餾水至250ml，IN氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5. 6，封口滅菌。使用前加熱溶解培養(yǎng)基并加入5ml葡萄糖貯存液和250 u I AS貯存液，分裝倒入培養(yǎng)皿中(25ml/每皿)。5)懸浮培養(yǎng)基
N6max 母液(IOX)5 ml
N6mix 母液(100X)0.5 ml
Fe2+EDTA 貯存液(100X)0.5 ml
維生素貯存液(100X)I ml
2,4-D 貯存液0.2 ml
CH0.08 g
蔗糖2 g加蒸餾水至100ml，調(diào)節(jié)pH值到5. 4，分裝到兩個(gè)IOOml的三角瓶中，封口滅菌。使用前加入Iml葡萄糖貯存液和100 u I AS貯存液。6)選擇培養(yǎng)基
N6max 母液(IOX)25 ml
N6mix 母液(100X)2.5 ml
Fe2+EDTA 貯存液(100X)2.5 ml
維生素貯存液(100X)2.5 ml
2.4-D存液0.625 ml CH0.15 g
蔗糖7.5 g
瓊脂粉1.75 g加蒸餾 水至250ml，調(diào)節(jié)pH值到6. 0，封口滅菌。使用前溶解培養(yǎng)基，加入250 U IHN和400ppm CN,分裝倒入培養(yǎng)皿中(25ml/皿)。7)預(yù)分化培養(yǎng)基
N6max 母液(IOX)25 ml
N6mix 母液(100X)2.5 ml
Fe2+EDTA 貯存液(100X)2.5 ml
維生素貯存液(100X)2.5 ml
6-BA貯存液0.5 ml
KT貯存液0.5 ml
NAA貯存液50 nl
IAA C存液50 pi
CH0.15 g
蔗糖7.5 g
瓊脂粉1.75 g加蒸餾水至250ml，IN氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5. 9，封口滅菌。使用前溶解培養(yǎng)基，加入250 u IHN和200ppm CN,分裝倒入培養(yǎng)皿中(25ml/ M )。 8)分化培養(yǎng)基
N6max 母液(IOX)IOOml
N6mix 母液(100X)IOml
Fe2+EDTA 貯存液(100X)IOml
維生素貯存液(100X)IOml
6-BA貯存液2 ml
KT貯存液2 ml
NAA貯存液0.2 ml
IAA貯存液0.2 ml
CHIg
蔗糖30 g
Phytagel3 g 加蒸餾水至900ml，IN氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到6. O。煮沸并定容至1000ml，分裝到50ml三角瓶(50ml/瓶)，封口滅菌。9)生根培養(yǎng)基
MSmax 母液(IOX)50 ml
MSmix 母液(100X)5 ml
Fe2+EDTA 貯存液(100X)5 ml

維生素貯存液(IOOX)5 ml
蔗糖30 g
Phytagel3 g加蒸餾水至900ml，IN氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5. 8。煮沸并定容至1000ml，分裝到生根管中(25ml/管)，封口滅菌。3、0sbZIP46CAl超表達(dá)植株的表達(dá)量鑒定本發(fā)明采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR方法對(duì)上述第2步獲得的轉(zhuǎn)基因水稻植株中0sbZIP46CAl基因的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)?？俁NA的提取采用TRIZOL試劑(購(gòu)自Invitrogen公司)提取，提取方法按照TRIZOL試劑說明書，利用反轉(zhuǎn)錄酶SSIII (購(gòu)自Invitrogen公司)將其反轉(zhuǎn)錄合成cDNA(方法根據(jù)Invitrogen公司反轉(zhuǎn)錄酶試劑說明書)，反應(yīng)條件為65°C 5min,50°C 60min,70°C IOmin0以上述反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，用引物 (0sbZIP46rtNTterminalF :5’ -AAGCGCCGAGAAGGATTTC-3’ 和 0sbZIP46rtNTterminalR :5，-CCGCCGTCCAGATGTTG-3，)對(duì)0sbZIP46CAl基因進(jìn)行特異的PCR擴(kuò)增。同時(shí)用引物(actin76F :5，-TGGCATCTCTCAGCACATTCC-3，和 actin76R :5，-TGCACAATGGATGGGTCAGA-3，)對(duì)水稻Actinl基因(登錄號(hào)X16280)做特異擴(kuò)增(擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)76bp)，以作為內(nèi)對(duì)照進(jìn)行定量分析。反應(yīng)條件為95°C IOsec ；95°C 5sec，60°C 34sec，45個(gè)循環(huán)。反應(yīng)過程中進(jìn)行熒光檢測(cè)實(shí)時(shí)定量分析。表達(dá)量檢測(cè)結(jié)果顯示，大部分轉(zhuǎn)基因植株中0sbZIP46CAl基因的表達(dá)量相對(duì)于野生型顯著提高(圖2B)。4、0sbZIP46CAl超表達(dá)植株的干旱脅迫表型鑒定為了驗(yàn)證0sbZIP46CAl超表達(dá)植株的抗旱性，我們對(duì)超表達(dá)植株進(jìn)行了干旱脅迫表型鑒定，將兩個(gè)超表達(dá)家系(0X7，0X1)和野生型家系(ZHll)種子去殼消毒(濃度為70%酒精處理lmin，0. 15%氯化汞處理lOmin，無菌水清洗數(shù)次)，在含有100mg/L潮霉素的1/2MS培養(yǎng)基上發(fā)芽，中花Il(ZHll)家系晚一天播于不含潮霉素的1/2MS培養(yǎng)基上，4-5天后挑選發(fā)芽好且長(zhǎng)勢(shì)一致的植株種到小圓桶中，每桶種轉(zhuǎn)基因植株和野生型對(duì)照各25株。試驗(yàn)用的土壤為泥土與粗沙按體積比為2 3混合而成，每圓桶等量均勻沙土加等體積水，水自行滲漏確保土壤的緊實(shí)度一致，試驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。植株生長(zhǎng)到三至四葉期時(shí)對(duì)每個(gè)小紅桶中進(jìn)行斷水處理。斷水至葉片全卷，葉尖開始發(fā)白(一般6-10天，具體根據(jù)天氣情況而定)，然后復(fù)水恢復(fù)5-7天，觀察表型并統(tǒng)計(jì)植株的存活率。結(jié)果顯示，在干旱脅迫過程中，野生型對(duì)照的葉片卷曲，失綠，萎蔫的速度要快于超表達(dá)植株。在復(fù)水并恢復(fù)生長(zhǎng)一段時(shí)間之后，野生型對(duì)照幾乎都枯死而超量表達(dá)家系大部分植株仍然活著，且能很快恢復(fù)生長(zhǎng)新的綠葉。進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)存活率發(fā)現(xiàn)野生型對(duì)照存活率低于10%，而超表達(dá)植株的存活率顯著高于同桶種植的野生型對(duì)照(在50%以上)。與野生型對(duì)照相比，超表達(dá)植株對(duì)干旱脅迫表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗性，說明0sbZIP46CAl超表達(dá)后提高了植株的抗旱性(圖3和圖4)。5、0sbZIP46CAl離體葉片失水速率測(cè)定為了進(jìn)一步驗(yàn)證0sbZIP46CAl超表達(dá)植株的抗旱性，我們對(duì)超表達(dá)植株進(jìn)行了離 體葉片失水速率的測(cè)定，將分蘗期植株的部分葉片剪下，置于室溫條件下，分別在不同的時(shí)間點(diǎn)稱量葉片的重量，統(tǒng)計(jì)其失水速率的快慢。失水率的計(jì)算公式為失水率y(%)=(XO-Xn)/XOX 100，XO為開始時(shí)植株的重量，Xn為某時(shí)間點(diǎn)植株的重量。結(jié)果顯示，超表達(dá)植株(CA1U-1 OX, CA1U-3 OX)的葉片失水速率顯著低于轉(zhuǎn)基因陰性對(duì)照(CA1U-4 NOX)和野生型對(duì)照(ZHll)(圖5)。6、0sbZIP46CAl超表達(dá)植株在滲透脅迫下的表型本實(shí)施例選取兩個(gè)超表達(dá)家系(0sbZIP46CAlU-l，0sbZIP46CAlU_5)和野生型家系(ZHll)以及一個(gè)0sbZIP46全長(zhǎng)超表達(dá)家系(0sbZIP46U-15)種子去殼消毒(濃度為70%酒精處理lmin，0. 15%氯化汞處理lOmin，無菌水清洗數(shù)次)，在含有100mg/L潮霉素的1/2MS培養(yǎng)基上發(fā)芽，中花Il(ZHll)家系晚一天播于不含潮霉素的1/2MS培養(yǎng)基上，2-3天后挑選發(fā)芽好且長(zhǎng)勢(shì)一致的種子轉(zhuǎn)移到含有或不含150mM甘露醇的1/2MS培養(yǎng)基中繼續(xù)生長(zhǎng)。7天后拍照并調(diào)查植株的株高。因?yàn)樵诓缓事洞寂囵B(yǎng)基上超量表達(dá)植株與對(duì)照的長(zhǎng)勢(shì)不一致，用相對(duì)株高(甘露醇培養(yǎng)基上生長(zhǎng)植株的株高除以正常培養(yǎng)基上生長(zhǎng)植株的株高)來衡量植株對(duì)滲透脅迫的抗性。0sbZIP46CAl超量表達(dá)植株的相對(duì)株高顯著高于野生 型和0sbZIP46全長(zhǎng)超表達(dá)家系(圖6和圖7)，說明超表達(dá)0sbZIP46CAl基因提高了轉(zhuǎn)基因植株抗?jié)B透脅迫的能力。7、0sbZIP46CAl超表達(dá)植株下游基因的誘導(dǎo)情況采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR方法(方法同第3步所述)對(duì)0sbZIP46CAl超表達(dá)植株中的三個(gè)下游基因及0sbZIP46基因本身表達(dá)量進(jìn)行了檢測(cè)，選取兩個(gè)0sbZIP46CAl超表達(dá)家系(CA10X-2，CA10X-5)為檢測(cè)對(duì)象，兩個(gè)0sbZIP46全長(zhǎng)的超表達(dá)家系(FL0X-9，F(xiàn)LOX-15)以及野生型(ZHll)為對(duì)照，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，兩個(gè)0sbZIP46CAl超表達(dá)家系和兩個(gè)0sbZIP46全長(zhǎng)的超表達(dá)家系的0sbZIP46基因或0sbZIP46CAl基因超表達(dá)量基本相當(dāng)，但0sbZIP46CAl超表達(dá)家系中的下游基因相比野生型對(duì)照受到強(qiáng)烈的誘導(dǎo)，而0sbZIP46全長(zhǎng)的超表達(dá)家系中的下游基因相比野生型對(duì)照誘導(dǎo)很微弱或基本不誘導(dǎo)，而這些下游基因大都是參與抗旱應(yīng)答的。說明超表達(dá)0sbZIP46CAl相比超表達(dá)0sbZIP46全長(zhǎng)更能提升植株的抗旱應(yīng)答響應(yīng)(圖8)。
權(quán)利要求
1.人工改造的0sbZIP46CAl基因在水稻抗旱性遺傳改良中的應(yīng)用，其特征在于該基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO 1所示。
2.人工改造的0sbZIP46CAl基因在水稻抗旱性遺傳改良中的應(yīng)用，其特征在于該基因的編碼的氨基酸序列如序列表SEQ ID N0:2所示。
3.人工改造的0sbZIP46CAl基因在水稻抗旱性遺傳改良中的應(yīng)用，其特征在于該基因的編碼的蛋白質(zhì)缺失了 0sbZIP46蛋白的負(fù)調(diào)控區(qū)域且具有組成型轉(zhuǎn)錄激活活性。
全文摘要
本發(fā)明屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及一種人工改造的OsbZIP46CA1基因在水稻抗旱性遺傳改良中的應(yīng)用。所述的基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO1所示，該基因的編碼的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO2所示。本發(fā)明采用基因改造的方法，克隆了水稻bZIP家族基因OsbZIP46缺失內(nèi)部297個(gè)堿基后的片段OsbZIP46CA1，實(shí)驗(yàn)證明OsbZIP46CA1具有強(qiáng)轉(zhuǎn)錄激活活性，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)超量表達(dá)OsbZIP46CA1基因后增強(qiáng)了水稻抗旱的能力，證實(shí)了該基因的功能及應(yīng)用途徑。
文檔編號(hào)C07K14/415GK102747098SQ20111009968
公開日2012年10月24日 申請(qǐng)日期2011年4月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月21日
發(fā)明者唐寧, 熊立仲 申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)