專利名稱：一種結(jié)核桿菌蛋白抗原的表位肽及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種結(jié)核桿菌蛋白抗原的表位肽及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
y S T細胞由于在抗結(jié)核免疫中發(fā)揮重要的作用引起越來越多的關(guān)注，磷酸抗原被認(rèn)為是Y S T細胞識別的主要抗原，但磷酸抗原活化的Y S T細胞缺乏對結(jié)核桿菌有效的免疫保護。相比而言，結(jié)核桿菌的蛋白抗原有著更有效的免疫保護作用。一直以來，研究者采取不同的方法獲取Y S T細胞識別的結(jié)核桿菌的蛋白抗原，早期的方法是通過不同的方式處理結(jié)核桿菌，通過質(zhì)譜分析活化Y S T細胞的蛋白成分，粗略地鑒定出活化Y S T細胞的結(jié)核蛋白抗原成分集中在10-14KD的范圍內(nèi)。但應(yīng)用此種方法并沒有得到特定的結(jié)核抗原成分。Alderson的課題組以結(jié)核病人的抗血清和結(jié)核桿菌反應(yīng)性的⑶4+T淋巴細胞為 探針，通過篩選結(jié)核桿菌的基因表達文庫中發(fā)現(xiàn)了與之發(fā)生特異性結(jié)合的抗原表位，為獲得有效的結(jié)核亞單位疫苗奠定了基礎(chǔ)。但到目前為止，以Y S T淋巴細胞為探針釣取抗原表位的研究未見報道。由于分離得到的結(jié)核病人外周血Y 6 T細胞在體外存活時間較短，如果沒有其他細胞因子和抗Y S TCR抗體的刺激作用僅能存活2周左右，不能滿足篩選文庫的需要，因此如能夠在體外建立結(jié)核特異性Y S T細胞系，作為釣取抗原表位的探針，將能夠滿足篩選
Y6 T細胞識別的結(jié)核桿菌抗原表位的需要。缺陷型T淋巴瘤細胞系J. RT3-T3. 5細胞恰恰能夠滿足這種需要，此種細胞系不表達有功能的TCR，但可接受外源的TCR鏈，形成有功能的均一化的Y S TCR轉(zhuǎn)染細胞系。此種細胞系在外源抗原的刺激下，活化表達IL-2。因此，根據(jù)轉(zhuǎn)染細胞系IL-2的分泌情況，可以判斷Y 6 T細胞對相應(yīng)抗原的識別及在Y 6 TCR識別抗原的過程中，關(guān)鍵的識別位點(Xi XY, et al. 2009. J. Bio. Chem. 284 27449-27455. Xi XY, et al.2010.International Immunology 22 :299-306.)。但以
YS TCR轉(zhuǎn)染細胞系為探針，篩選文庫的研究未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種多肽及其應(yīng)用，可以用來作為結(jié)核桿菌蛋白抗原的候選表位肽。本發(fā)明提供的多肽，是具有如下氨基酸殘基序列之一的多肽(a)由序列表中序列5所示的氨基酸序列組成的多肽；(b)將序列表中序列5所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能由(a)衍生的多肽。所述一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加為不超過10個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。編碼所述多肽的基因也是本發(fā)明保護的范圍。所述基因是如下⑴或⑵或⑶的DNA分子
(I)序列表中序列6所示的DNA分子；(2)在嚴(yán)格條件下與(I)限定的DNA序列雜交且編碼具有相同功能的多肽的DNA分子;(3)與⑴限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且編碼具有相同功能的多肽的DNA分子。含有所述基因的重組載體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細胞系或重組菌也是本發(fā)明保護的范圍。所述多肽或所述基因或所述的重組載體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細胞系或重組菌在制備促進Y S T細胞分泌IL-2的促進劑中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護的范圍。所述多肽在制備促進Y 6 T細胞的增值的促進劑中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護的范 圍。所述多肽在制備結(jié)核桿菌疫苗中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護的范圍。所述多肽在制備抗結(jié)核桿菌產(chǎn)品中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護的范圍。所述產(chǎn)品為藥物。本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明建立了一種篩選Y ST細胞識別的結(jié)核蛋白抗原的新策略，以體外建立結(jié)核反應(yīng)性Y S TCR轉(zhuǎn)染細胞系為探針在噬菌體隨機文庫中釣取
YS TCR識別的結(jié)核抗原表位，功能驗證的結(jié)果顯示表位TPl是可能的Y S T細胞識別的結(jié)核表位，為開發(fā)新型結(jié)核疫苗或佐劑成分提供新的思路。


圖I為構(gòu)建結(jié)核特異性和非特異性Y 6 TCR轉(zhuǎn)染細胞圖2為以轉(zhuǎn)染細胞為探針，篩選噬菌體十二肽庫的操作流程圖3為優(yōu)勢表位肽TPl與結(jié)核特異性Y 6 TCR轉(zhuǎn)染細胞的結(jié)合能力鑒定圖4為優(yōu)勢表位肽TPl與結(jié)核病人外周血中Y 6 T細胞的結(jié)合能力鑒定
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。下述實施例中實驗均重復(fù)三次，結(jié)果取平均值。實施例I、y S T細胞識別的結(jié)核桿菌的抗原表位的獲得I、構(gòu)建結(jié)核特異性和非特異性Y S TCR轉(zhuǎn)染細胞系取結(jié)核病人肝素抗凝新鮮靜脈血(由北京胸科醫(yī)院獲得，患者知情。)5毫升，加入等體積RPMI-1640培養(yǎng)液(Hyclone公司，Catalog SH30809)輕輕混勻，將上述混合液緩慢加至預(yù)先已加入等體積淋巴細胞分離液的試管中，避免破壞界面，500Xg離心20分鐘；取試管中白色界面層于另一試管中，加入等體積RPMI-1640培養(yǎng)液(Hyclone公司，Catalog SH30809)清洗二次。離心后加入Trizol，靜置5分鐘，加入200 U I氯仿，劇烈振動后于室溫(25°C )放置3分鐘，12，000Xg，4°C離心15分鐘。小心吸取上層水相，轉(zhuǎn)移至一新離心管，加入500 ill異丙醇，上下顛倒混勻，室溫放置10分鐘。12，000Xg，4°C離心15分鐘，棄上清，加入Iml 75%的乙醇，振蕩，7，500Xg，4°C離心5分鐘，棄上清。室溫干燥沉淀，溶于適量DEPC處理的水。取RNA樣品12 ill加入Oligo(ClT)15 (500 ii g/ml) I iil，70°C加熱變性5分鐘，取出后立即置于冰上，待冷卻后依次加入5XBuffer 5 iil、dNTP (IOmM) 5 yl、RNA酶抑制劑I yl，MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶I U 1，總體積為25 u 1，42°C孵育60分鐘進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成外周血PBMC的cDNA第一鏈。根據(jù)結(jié)核反應(yīng)性Y 6 T細胞的⑶R3區(qū)序列，設(shè)計合成Y 9和S 2鏈上段搭橋引物和下段搭橋引物，具體序列見表I。表I健康人及結(jié)核病人優(yōu)勢Y 9/ S 2鏈的⑶R3序列
權(quán)利要求
1.一種多肽，是具有如下氨基酸殘基序列之一的多肽 (a)由序列表中序列5所示的氨基酸序列組成的多肽； (b)將序列表中序列5所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能由(a)衍生的多肽。
2.編碼權(quán)利要求I所述多肽的基因。
3.如權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于所述基因是如下⑴或⑵或(3)的DNA分子 (1)序列表中序列6所示的DNA分子； (2)在嚴(yán)格條件下與(I)限定的DNA序列雜交且編碼具有相同功能的多肽的DNA分子； (3)與(I)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且編碼具有相同功能的多肽的DNA分子。
4.含有權(quán)利要求2或3所述基因的重組載體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細胞系或重組菌。
5.權(quán)利要求I所述多肽或權(quán)利要求2或3所述基因或權(quán)利要求4所述的重組載體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細胞系或重組菌在制備促進Y 6 T細胞分泌IL-2的促進劑中的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求I所述多肽或權(quán)利要求2或3所述基因或權(quán)利要求4所述的重組載體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細胞系或重組菌在制備促進Y ST細胞的增值的促進劑中的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求I所述多肽或權(quán)利要求2或3所述基因或權(quán)利要求4所述的重組載體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細胞系或重組菌在制備結(jié)核桿菌疫苗中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求I所述多肽或權(quán)利要求2或3所述基因或權(quán)利要求4所述的重組載體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細胞系或重組菌在制備抗結(jié)核桿菌產(chǎn)品中的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于所述產(chǎn)品為藥物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種結(jié)核桿菌蛋白抗原的表位肽及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的多肽，是具有如下氨基酸殘基序列之一的多肽(a)由序列表中序列5；(b)將序列表中序列5所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能由(a)衍生的多肽。本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)的結(jié)核抗原表位TP1，可能的γδT細胞識別的結(jié)核表位，為開發(fā)新型結(jié)核疫苗或佐劑成分提供新的思路。
文檔編號C07K7/08GK102746377SQ20111009946
公開日2012年10月24日 申請日期2011年4月20日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月20日
發(fā)明者何維, 趙振東, 郗雪艷 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院病原生物學(xué)研究所