干擾lcyb、lcye表達(dá)并超量表達(dá)crtiso在制備紅色花瓣蕓薹屬植物中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了干擾LCYB、LCYE表達(dá)同時超量表達(dá)CRTISO在制備紅色花瓣蕓薹屬植物中的應(yīng)用，還公開了干擾LCYB、LCYE基因同時表達(dá)類胡蘿卜素異構(gòu)酶CRTISO的植物表達(dá)載體及該植物表達(dá)載體的制備方法，通過干擾LCYB、LCYE基因表達(dá)抑制黃色類胡蘿卜素的生物合成，超量表達(dá)類胡蘿卜素異構(gòu)酶CRTISO促進(jìn)全反式番茄紅素的積累，因而使花瓣顯紅色，成功制備了花瓣顯紅色的蕓薹屬植物，豐富了蕓薹屬植物的花色。
【專利說明】干擾LCYB、LCYE表達(dá)并超量表達(dá)CRT ISO在制備紅色花瓣蕓 薹屬植物中的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體涉及干擾LCYB、LCYE基因表達(dá)同時超量表達(dá) CRTISO基因在制備紅色花瓣蕓薹屬植物品種中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 油菜是重要的油料作物，栽培歷史悠久、經(jīng)濟(jì)價值高、用途廣泛、適應(yīng)性強(qiáng)，是我國 的第一大油料作物，也是世界性的重要油料作物。物種分類學(xué)上，油菜由蕓薹屬的）三個 物種構(gòu)成，分別為甘藍(lán)型油菜（Brassica napus，2n = 38, AACC)、白菜型油菜（Brassica rapa ssp. oleifera syn. B. campestris, 2n = 20, AA)、芥菜型油菜（Brassica juncea, 2n =36，AABB)。甘藍(lán)型油菜油菜是由白菜（Brassica rapa)與甘藍(lán)（Brassica oleracea， 2n= 18, CC)通過自然種間雜交后雙二倍化進(jìn)化而來的一種復(fù)合種，雖然栽培歷史僅有幾 百年，但由于其生長勢強(qiáng)，豐產(chǎn)性高，已占世界及我國油菜種植面積90%的以上。白菜型油 菜是蕓薹屬最早被馴化的物種之一，原產(chǎn)于我國西北地區(qū)的大白菜演化而來，世界范圍內(nèi) 有廣泛的分布面積和悠久的栽培歷史。芥菜型油菜是由白菜與黑芥（Brassica nigra，2n =16, BB)天然雜交后再自然加倍形成的雙二倍體復(fù)合種，中國是其原始起源與分化中心， 種植范圍遍布世界。
[0003] 隨著經(jīng)濟(jì)水平的持續(xù)發(fā)展和社會現(xiàn)代化程度的不斷提升，大眾對生活品味的追求 也與日俱增，不僅傳統(tǒng)的名山大川式的旅游越來越火，田園休閑觀光產(chǎn)業(yè)的發(fā)展也很迅速。 油菜大面積生產(chǎn)上形成金黃色花的海洋，是越來越重要的田園生態(tài)旅游資源。油菜花觀賞 的時間為每年的十二月底到來年夏季。每個地方因為種植的時間略有不同，花期會有一點 差異。在我國已形成幾十個知名油菜花觀賞地區(qū)，油菜花開時，競相怒放、流金溢彩、綿延數(shù) 十里，好似金浪滔滔的海洋。
[0004] 自然界花舟顏色雖然種類繁多，但除芥藍(lán)（B. oleracea var. alboglabra)的花瓣 是乳白色以外，蕓薹屬植物的花瓣普遍為黃色系列，商業(yè)油菜品種全是黃色花瓣，過于單 調(diào)。隨著油菜花色田園生態(tài)觀光產(chǎn)業(yè)的迅猛發(fā)展，迫切需要多姿多彩的花色性狀，使之還可 以開出紅色、藍(lán)色等，在不影響油菜菜籽的出油率和其他傳統(tǒng)用途之外，增加其賞花價值， 助推生態(tài)觀光旅游。此外，特定的花色還是油菜育種界渴望的選擇標(biāo)記性狀，而且花色的非 黃色化還有助于減少露尾甲等蟲害。因此，需要解析油菜花色性狀的分子機(jī)理，并開展新花 色的分子育種。
[0005] 蘿卜（Raphanus sativus)屬于蘿卜屬，近年來的分子證據(jù)表明蘿卜與白菜、甘藍(lán)、 甘藍(lán)型油菜的距離甚至遠(yuǎn)小于黑芥與它們的距離，意思是說蘿卜與蕓薹屬核心物種的距離 小于蕓薹屬內(nèi)部的種間距離。但另一方面，蘿卜能開出紅色系的花色，而蕓薹屬和眾多近緣 屬（如白芥屬）則只能開出黃色系的花。這是一個奇怪的現(xiàn)象，因此開展蕓薹屬與蘿卜花 色性狀的比較研究，不僅是這些生物花色性狀基礎(chǔ)研究的需要，也可為油菜等蕓薹屬植物 花色性狀的遺傳改良提供指導(dǎo)。
[0006] 重要觀花植物的花色分子機(jī)理和分子育種已取得顯著進(jìn)展，為研究其它植物花色 機(jī)理和開展分子育種提供了重要參考。研究發(fā)現(xiàn)，花色主要由類黃酮（flavonoids)和類 胡蘿卜素（carotenoids)兩大類色素決定。類黃酮是最見的花色素，貢獻(xiàn)黃色、橙色、紅色 到紫色的一系列色系。類黃酮為水溶性物質(zhì)，具有一個C15骨架，按結(jié)構(gòu)主要分為9類： 查爾麗（chalcones)、澄麗（aurones)、異黃麗（isofIavonoids)、黃麗（fIavones)、黃麗 醇（flavonols)、黃燒雙醇（flavandiols)、花色苷（anthocyanins)、縮合單寧（condensed tannins,即原花青素，proanthocyanins)和縣酐（phlobaphenes)，它們中對植物著色貢獻(xiàn) 最大的是花色苷、黃酮醇、查爾酮和橙酮。其中花色苷是最大的一類黃酮物質(zhì)，為花朵或其 它組織貢獻(xiàn)品紅、紅色、紫色、藍(lán)色等色調(diào)，積累于細(xì)胞的液泡或色素細(xì)胞中，黃色色調(diào)則由 查爾酮、橙酮、黃酮醇、黃酮提供。
[0007] 矮牽牛、玉米、金魚草、擬南芥等植物中的類黃酮生物合成途徑已被充分解析。它 是公共體丙烷生物合成途徑下游的一個重要分支途徑，苯丙烷途徑通過其它分支途徑合成 木質(zhì)素、芪類、香豆素、植保素等多種次生物質(zhì)。類黃酮途徑的第一步是由查酮合酶（CHS) 催化1分子P-香豆酰-CoA與3分子丙二酰-CoA縮合形成淺黃色的4, 2'，4'，6' -四羥基 查爾酮?；ㄉ张浠缣祗每?、矢車菊素、飛燕草素等是以查爾酮為底物，經(jīng)羥化、還原、 氧化、側(cè)基修飾等幾步酶的催化反應(yīng)而形成，依次涉及CHI (查爾酮異構(gòu)酶）、F3H(黃烷酮 3-羥化酶）、F3' H(類黃酮3' -羥化酶）、F3' 5' H(類黃酮3'，5' -羥化酶）、DFR/FNR(二 氫黃酮醇4-還原酶/黃烷酮4-還原酶）、ANS (花青素合成酶）等。由F3' H和F3' 5' H 決定的花青素（anthocyanidins)的B-環(huán)上的輕基越多，則顏色越偏向藍(lán)色。通常情況下， 查爾酮和花青素被進(jìn)一步修飾，如糖基化（糖基轉(zhuǎn)移酶，GT)、甲基化（甲基轉(zhuǎn)移酶，MT)、酰 基化（?；D(zhuǎn)移酶，AT)，然后轉(zhuǎn)運（谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶，GST)到液泡中貯存。在黃色金魚 草花的液泡中，查爾酮4' -0-葡萄糖苷被金魚草素合成酶（AS)轉(zhuǎn)變成亮黃色的金魚草素 (6-0-葡萄糖苷）。艷桐草等植物的橙色至紅色花朵中，黃烷酮經(jīng)過幾步反應(yīng)而合成3-脫 氧花色苷。此外，黃酮和黃酮醇也對花色起一定貢獻(xiàn)，它們?yōu)闊o色或淺黃色，可通過所謂共 色作用來促進(jìn)藍(lán)色花色苷的形成和穩(wěn)定。黃酮和黃酮醇分別是以黃烷酮和二氫黃酮醇為底 物，在黃酮合酶（FNS)和黃酮醇合酶（FLS)的催化下合成的。除花青素外，黃酮醇、查爾酮 等其它類黃酮物質(zhì)也可能涉及糖基化等修飾。
[0008] 模式生物的研究表明，類黃酮途徑結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)是被一個由R2R3_MYB(PAP、 PFG、TT2 等）、堿性螺旋-環(huán)-螺旋（basic helix-loop-helix，bHLH，有 TT8、GL3、EGL3 等） 和WD40重復(fù)（WDR，有TTGl等）形成的轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物所調(diào)控的，該三元復(fù)合物調(diào)控了觀花 植物金魚草、矮牽牛、牽?；?、非洲菊和龍膽花的花瓣中花色苷著色的過程，調(diào)控行為受器 官、組織等體內(nèi)信號和光、紫外線等外部信號所影響。擬南芥的研究表明，黃色調(diào)的黃酮醇 (苷）生物合成途徑的表達(dá)則由PFG基因特異調(diào)控，其中成員MYB11、MYB12、MYB111在器官 特異性上發(fā)生明顯分工。
[0009] 類胡蘿卜素（carotenoids)是脂溶性的紅色、橙色和黃色色素，嵌合在葉綠體和 有色體的膜中。類胡蘿卜素是C40-四萜類化合物，由C5-異戊二烯基礎(chǔ)單元合成而來，植 物、真菌、藻類和細(xì)菌均可合成，動物雖不能合成，但可從食物中攝入并用作色素和維生素 A 的前體物。類胡蘿卜素為許多花色貢獻(xiàn)了黃色色系，并單獨或與花色苷一道為玫瑰、菊花 等一些植物的花瓣貢獻(xiàn)了橙/紅、黃褐色和褐色色調(diào)。迄今，植物類胡蘿卜素生物合成途徑 的幾乎全部關(guān)鍵酶基因已被克隆和鑒定，整個途徑起始于質(zhì)體中的C5的異戊二烯焦磷酸 (isopentenyl pyrophosphate, IPP)單元，據(jù)認(rèn)為該途徑的有關(guān)酶之間形成復(fù)合物并結(jié)合 于質(zhì)體膜上，4分子IPP縮合為1分子C20的香葉基香葉基焦磷酸（GGPP)，在八氫番茄紅素 合酶（PSY)的催化下2分子GGPP頭對頭地偶合成C40的無色的八氫番茄紅素，它是第一個 類胡蘿卜素。隨后，八氫番茄紅素脫飽和酶（TOS)和ζ-胡蘿卜素脫飽和酶（ZDS)向分子 中順序引入共軛雙鏈，先后形成無色的六氫番茄紅素、淺黃色的胡蘿卜素、橙黃色的鏈 孢紅素、紅色的番茄紅素。隨著共軛雙鏈數(shù)的增加，吸收波長向長波方向移動。脫飽和過程 中產(chǎn)生的一些順式構(gòu)象被類胡蘿卜素異構(gòu)酶（CRTIS0、Ζ-ISO)催化轉(zhuǎn)變?yōu)槿词綐?gòu)象。番 茄紅素可被番茄紅素 β -環(huán)化酶（LCYB)或番茄紅素 ε -環(huán)化酶（LCYE)環(huán)化，這是該途徑的 一個分支點。除半結(jié)球萵苣等植物外，絕大多數(shù)植物中LCYE只能給番茄紅素加入ε-環(huán)， 合成黃色的含有1個β-環(huán)和1個ε-環(huán)的α-胡蘿卜素和其衍生物。β -和α -胡蘿卜 素可發(fā)生進(jìn)一步的羥化或環(huán)氧化修飾，產(chǎn)生許多新結(jié)構(gòu)。胡蘿卜素的加氧產(chǎn)物稱為葉黃質(zhì)， β -環(huán)和ε -環(huán)的羥化過程分別由β -環(huán)羥化酶（CHYB)和ε -環(huán)羥化酶（CHYE)完成。PSY、 GGPS和LCYB存在花特異型和果實特異型，顯示存在一條有色體特異的類胡蘿卜素合成途 徑。玉米黃素環(huán)氧酶（ZEP)催化玉米黃素發(fā)生C5, 6和C5'，6'位的環(huán)氧化，形成黃色的花 藥黃質(zhì)和紫黃質(zhì)，它又可在新黃質(zhì)合成酶（NSY)的催化下轉(zhuǎn)變成新黃質(zhì)。9-順式-紫黃質(zhì) 和9-順式-新黃質(zhì)還可用于合成脫落酸（ABA)。
[0010] 類胡蘿卜素合成途徑的調(diào)控基因克隆還有待加強(qiáng)，但研究表明該途徑的調(diào)節(jié)主要 發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平上，受體內(nèi)和環(huán)境因素影響，PSY是重要限速酶調(diào)控點，光信號通路參與對 類蘿卜素途徑的調(diào)控，而且類胡蘿卜素裂解雙加氧酶（CCD)/NCED (9-順式-環(huán)氧類胡蘿卜 素雙加氧酶）從分解的角度參與重要調(diào)節(jié)作用。此外，VDE(紫黃質(zhì)脫環(huán)氧化酶）催化紫黃 質(zhì)和花藥黃質(zhì)轉(zhuǎn)化為玉米黃質(zhì)。擬南芥AtRAP2. 2對特定組織中的類胡蘿卜素積累有弱的 促進(jìn)作用，但最近研究表明它的功能主要是調(diào)控組織的耐缺氧存活能力。番茄DDBl和DETl 通過對光反應(yīng)信號途徑的負(fù)調(diào)控而抑制類胡蘿卜素途徑，而甘藍(lán)OR(Orange)和番茄HSP21 則是通過調(diào)控有色體的形成而促進(jìn)類胡蘿卜素的積累。
[0011] 此外，還存在第3類植物色素，即甜菜素（betalains)，是一類存在于液泡中 的水溶性生物堿，可分為紅紫色系的甜菜紅素（betacyanins)和黃色色系的甜菜黃素 (betaxanthins)，但甜菜素只發(fā)現(xiàn)于石竹目的10個科的植物和少數(shù)高等真菌中，其它植物 中還沒有發(fā)現(xiàn)，而且從未發(fā)現(xiàn)甜菜素與花色苷并存于同一種植物中。
[0012] 由于多數(shù)重要觀花植物的花色并不全，存在花色上的重要缺陷，因此花色分子育 種的代謝工程具有重要應(yīng)用前景。但是包括油菜在內(nèi)的整個蕓薹屬中，未見利用分子育種 的代謝工程改造油菜花色的報道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0013] 有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供干擾蕓薹屬植物花瓣中β-環(huán)化酶基因 LCYB、ε -環(huán)化酶基因 LCYE表達(dá)同時超量表達(dá)類胡蘿卜素異構(gòu)酶CRTISO基因在制備花瓣 呈紅色的蕓薹屬植物品種中的應(yīng)用；本發(fā)明的目的之二在于提供干擾蕓薹屬植物花瓣中 β-環(huán)化酶基因 LCYB、ε -環(huán)化酶基因 LCYE表達(dá)同時超量表達(dá)類胡蘿卜素異構(gòu)酶CRTISO基 因的植物表達(dá)載體；本發(fā)明的目的之三在于提供上述植物表達(dá)載體的制備方法；本發(fā)明的 目的之四在于提供利用所述植物表達(dá)載體制備花瓣呈紅色的蕓薹屬植物品種的方法。
[0014] 為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：
[0015] 1、干擾蕓薹屬植物花瓣中β -環(huán)化酶基因 LCYB、ε -環(huán)化酶基因 LCYE表達(dá)同時超 量表達(dá)類胡蘿卜素異構(gòu)酶CRTISO基因在制備花瓣呈紅色的蕓薹屬植物品種中的應(yīng)用。
[0016] 優(yōu)選的，所述干擾蕓薹屬植物花瓣中環(huán)化酶基因 LCYB、ε-環(huán)化酶基因 LCYE 表達(dá)的序列如SEQ ID NO. 2所示，所述超量表達(dá)類胡蘿卜素異構(gòu)酶CRTISO基因的序列如 SEQ ID NO. 3 所示。
[0017] 更優(yōu)選的，所述干擾蕓薹屬植物花瓣中β -環(huán)化酶基因 LCYB、ε -環(huán)化酶基因 LCYE 表達(dá)的序列由擬南芥花瓣特異啟動子PAtAP3介導(dǎo)表達(dá)，所述花瓣特異啟動子PAtAP3的核 苷酸序列SEQ ID NO. 1第267位至第1044位所示。
[0018] 最優(yōu)選的，所述蕓薹屬植物為甘藍(lán)型油菜（Brassica napus)。
[0019] 2、干擾蕓薹屬植物花瓣中β -環(huán)化酶基因 LCYB、ε -環(huán)化酶基因 LCYE表達(dá)同時超 量表達(dá)類胡蘿卜素異構(gòu)酶CRTISO基因的植物表達(dá)載體，所述植物載體包括由花瓣特異啟 動子介導(dǎo)的表達(dá)β -環(huán)化酶基因 LCYB、ε -環(huán)化酶基因 LCYE基因 RNA干擾序列的表達(dá)框和 由組成型啟動子介導(dǎo)超量表達(dá)類胡蘿卜素異構(gòu)酶CRTISO基因的表達(dá)框。
[0020] 優(yōu)選的，所述花瓣特異啟動子介導(dǎo)表達(dá)β -環(huán)化酶基因 LCYB、ε -環(huán)化酶基因 LCYE RNA干擾序列的表達(dá)框依次由花瓣特異啟動子PAtAP3、SEQ ID NO. 2所示的序列、間隔序列、 SEQ ID NO. 2所示的反向互補序列和NOS終止子組成。
[0021] 更優(yōu)選的，所述由組成型啟動子介導(dǎo)超量表達(dá)類胡蘿卜素異構(gòu)酶CRTISO基因的 表達(dá)框依次由CaMV35S啟動子，SEQ ID NO. 3所示序列和NOS終止子組成。
[0022] 3、所述植物表達(dá)載體的制備方法，包括如下步驟：將SEQ ID NO. 1所示序列 經(jīng)AscI和SwaI雙酶切后連入經(jīng)同樣酶切的pFGC5941M質(zhì)粒，得pFGC5941CEPE質(zhì)粒， 然后將SEQ ID NO. 2所示的序列連入pFGC5941CEPE載體的PAtAP3啟動子與間隔序列 之間，形成中間載體pFGC5941CEPE-B2RNAia，再將SEQ ID NO. 2所示序列反向連入中間 載體 pFGC5941CEPE-B2RNAia 的間隔序列與 OCS 終止子之間，得 pFGC5941CEPE-B2RNAi 載體，最后將SEQ ID NO. 3所示序列通過NcoI和AscI酶切位點連入經(jīng)同樣酶切的 pFGC5941CEPE-B2RNAi載體，得干擾蕓薹屬植物花瓣中β -環(huán)化酶基因 LCYB、ε -環(huán)化酶基 因 LCYE表達(dá)同時超量表達(dá)類胡蘿卜素異構(gòu)酶CRTISO基因的植物表達(dá)載體。
[0023] 優(yōu)選的，所述間隔序列為甘藍(lán)型油菜ΡΑΡ2基因第2內(nèi)含子。
[0024] 4、利用所述植物表達(dá)載體制備花瓣呈紅色的蕓薹屬植物品種的方法，包括如下步 驟：
[0025] a.將所述植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，制得工程菌；
[0026] b.將步驟a所得工程菌轉(zhuǎn)化蕓薹屬植物無菌苗的下胚軸，共培養(yǎng)后，在Basta除草 劑抗性下誘導(dǎo)分化獲得再生苗，篩選陽性苗轉(zhuǎn)基因苗得花瓣呈紅色的蕓薹屬植物品種。
[0027] 本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明通過研究油菜等蕓薹屬核心物種及蘿卜花色機(jī) 理，明確了黃花、白花、紅花之間的關(guān)鍵性差異表達(dá)基因位點，由此本發(fā)明利用花瓣特異啟 動子在蕓薹屬花瓣中干擾類胡蘿卜素合成的關(guān)鍵基因 LCYB和LCYE的表達(dá)，從而抑制花瓣 中黃色類胡蘿卜素的積累，通過超量表達(dá)合成反式番茄紅素的關(guān)鍵基因 CRTIS0,使花瓣中 積累大量反式番茄紅素，僅通過對類胡蘿卜素途徑的代謝工程修飾就獲得花瓣呈紅色的蕓 薹屬植物新品種。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0028] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果更加清楚，本發(fā)明提供如下附圖：
[0029] 圖1為蕓薹屬和蘿卜花瓣的顯微觀察結(jié)果（A :甘藍(lán)型油菜（BnY) ;B :甘藍(lán)型油菜 (BnW) ;C :芥菜型油菜（BjY) ;D :白菜型油菜（BrY) ;E :甘藍(lán)（BoY) ;F :芥藍(lán)（BoW) ;G :蘿卜 (RsR))〇
[0030] 圖2為DFR、TT8、GL3、EGL3在蕓薹屬花瓣與蘿卜花瓣間的差異表達(dá)（A為DFR在蕓 薹屬花瓣與蘿卜花瓣間的差異表達(dá)；B為TT8在蕓薹屬花瓣與蘿卜花瓣間的差異表達(dá)；C為 GL3在蕓薹屬花瓣與蘿卜花瓣間的差異表達(dá)；D為EGL3在蕓薹屬花瓣與蘿卜花瓣間的差異 表達(dá)；BnYPe :甘藍(lán)型油菜黃花瓣；BnWPe :甘藍(lán)型油菜白花瓣；BjYPe :芥菜型油菜黃花瓣； BrYPe :白菜型油菜黃花瓣；BoYPe :羽衣甘藍(lán)黃花瓣；BoWPe :芥藍(lán)白花瓣；RsRPe :蘿卜紅紫 花瓣）。
[0031] 圖3為0R、(XD1在蕓薹屬花瓣和蘿卜花瓣間的差異表達(dá)（A為OR在蕓薹屬花瓣和 蘿卜花瓣間的差異表達(dá)；B為CCDl在蕓薹屬花瓣和蘿卜花瓣間的差異表達(dá)；BnYPe :甘藍(lán)型 油菜黃花瓣；BnWPe :甘藍(lán)型油菜白花瓣；BjYPe :芥菜型油菜黃花瓣；BrYPe :白菜型油菜黃 花瓣；BoYPe :羽衣甘藍(lán)黃花瓣；BoWPe :芥藍(lán)白花瓣；RsRPe :蘿卜紅紫花瓣）。
[0032] 圖 4 為 N0S-PAtAP3、B2RNAi 和 BnCRTISOIPCR 擴(kuò)增結(jié)果（A :N0S-PAtAP3 ;B : B2RNAi ；C ：BnCRTIS01) 〇
[0033] 圖5pFGC5941CEPE和pBLycoRF3載體構(gòu)建過程中酶切結(jié)果（A :AscI和SwaI 雙酶切 PFGC5941M ;B :AscI 和 SwaI 雙酶切 pMD19-T-N0S-PAtAP3 ;C :SwaI 和 AatI 雙酶 切 PFGC5941CEPE ;D :SwaI 和 AatII 雙酶切 pMD19-T-B2RNAi ;E :BamHI 和 XbaI 雙酶切 pMD19-T-B2RNAi ;F :BamHI 和 XbaI 雙酶切 pFGC5941CEPE-B2RNAia ;G :NcoI 和 AscI 雙酶切 pFGC5941CEPE-B2RNAia ;H :NcoI 和 AscI 雙酶切 pMD19-T-BnCRTIS01)。
[0034] 圖6為pBLyc〇RF3轉(zhuǎn)化甘藍(lán)型油菜結(jié)果（A :野生型甘藍(lán)型油菜；B :轉(zhuǎn)基因陽性植 株）。

【具體實施方式】
[0035] 下面將結(jié)合附圖，對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。實施例中未注明具體 條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆實驗指南（第三版，J.薩姆布魯克等 著）中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0036] 本發(fā)明實施例采用的植物材料：甘藍(lán)型油菜黃花瓣（中雙9號品種）、甘藍(lán)型油菜 乳花瓣、白菜型油菜黃花瓣（6Y733品系）、芥菜型油菜黃花瓣（CNG12011品系）、羽衣甘藍(lán) (B.oleracea var.acephala ftricolor，K10-3 品系）黃花瓣、芥藍(lán)變種白花瓣（R9057 品 系）、蘿卜紅花瓣均取自西南大學(xué)重慶市油菜工程技術(shù)研究中心歇馬基地的常規(guī)試驗植株。 擬南芥（Arabidopsis thaliana，Columbia野生型）種子購自國際擬南芥中心，種植于室內(nèi) 人工氣候室。
[0037] 實施例使用的試劑及試劑盒如下：PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)、SYBR? Premix Ex Taq? II (Tli RNaseH Plus) ROX plus、 DNA Ligation Kit、pMD19_T、Taq DNA 聚合酶、DNase I (RNase-free)及 buffer、RNase Inhibitor、DL-2000及λ-HindIII DNA Marker購自大連寶生物（TaKaRa)生物工程有限公 司；RNAprep Pure植物總RNA提取試劑盒為天根生化科技（北京）有限公司產(chǎn)品；膠回收 試劑盒、小量法質(zhì)粒抽提試劑盒購自上海華舜生物技術(shù)有限公司；限制性內(nèi)切酶購自立陶 宛MBI Fermentas 公司；MS (Murashige&Skoog medium, including vitamins)培養(yǎng)基為荷蘭 Duchefa公司產(chǎn)品；DL_2000plus、Easy-Taq酶、dNTPs等試劑購自北京全式金（Transgen) 生物技術(shù)有限公司；X -Gluc (5-brom〇-4-chlor〇-3-indolyl-β -D-glucuronic acid)、利福 平（Rif)、鏈霉素（Str)、卡那霉素（Kan)、氨芐青霉素（Amp)、瓊脂糖、Tris、CTAB、Tris飽和 酚（pH = 8. 0)、Tryptone、Yeast Extract、X-gal、IPTG、CTAB 等其它生化與分子生物學(xué)試 劑購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；植物激素購自上海稼豐園藝用品等公司。
[0038] 本發(fā)明中使用的pFGC5941M質(zhì)粒由甘藍(lán)型油菜（Brassica napus)PAP2基因第2內(nèi) 含子（BnPAP2I2)的新型間隔區(qū)取代了 pFGC5941的原有PhChsA間隔區(qū)，并在新間隔區(qū)與啟 動子之間的多克隆位點處新增了一個Aat II切點（其具體改造過程參見馬麗娟.馮瑜.江 麗萍.申敏.柴友榮；PFGC5941的改造及蕓薹屬透明種皮1基因（TTl)家族RNA干擾載體 構(gòu)建.農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報，2010年，第18卷，第6期，第1189?1196頁）。
[0039] 實施例所用PCR引物合成和測序由上海英駿/英濰捷基公司、上海生工、北京六合 華大等公司商業(yè)完成。
[0040] 實施例1、蕓薹屬和蘿卜花瓣顯色亞細(xì)胞器的顯微觀察
[0041] 分別采取新鮮的甘藍(lán)型油菜黃花瓣（BnY);甘藍(lán)型油菜乳花瓣（BnW);芥菜型油菜 黃花瓣（BjY);白菜型油菜黃花瓣（BrY);羽衣甘藍(lán)黃花瓣（BoY);芥藍(lán)白花瓣（BoW);蘿卜 紅花瓣（RsR)，放在冰面冷鮮保存運回實驗室，然后徒手切片，用低倍鏡觀察快速篩查，挑選 合格切片進(jìn)行仔細(xì)觀察與照相，結(jié)果如圖1所示。結(jié)果顯示，蕓薹屬幾個物種的黃花瓣中顯 黃色的物質(zhì)在一個細(xì)胞中呈現(xiàn)為眾多小顆粒狀，不均勻地分布于細(xì)胞內(nèi)，被液泡擠壓到貼 壁的位置，說明黃色花瓣中顯色細(xì)胞器為有色體，其色素為黃色類胡蘿卜素。甘藍(lán)型油菜乳 花瓣中也有一些細(xì)胞擁有淺黃色有色體，但總體數(shù)量少且細(xì)胞間不一致，芥藍(lán)白花瓣中幾 乎看不到有色體，說明是有色體的減少或消失導(dǎo)致其黃色變淺或消失。蘿卜花瓣中紫紅色 色素均勻分布于每個細(xì)胞的中央位置，越是中央越濃，越偏離中央越淡，說明蘿卜花瓣的顯 色亞細(xì)胞器為液泡,顯色物質(zhì)為花青素苷。
[0042] 實施例2、檢測蕓薹屬和蘿卜花瓣色素
[0043] 在盛花期早晨分別取剛開放的甘藍(lán)型油菜黃花瓣（BnY);甘藍(lán)型油菜乳花瓣 (BnW);芥菜型油菜黃花瓣（BjY);白菜型油菜黃花瓣（BrY);羽衣甘藍(lán)黃花瓣（BoY);芥藍(lán) 白花瓣（BoW);蘿卜紅花瓣（RsR)，立即陰涼保鮮運回實驗室，50?60°C烘干，研成粉末后過 60目篩，避光干燥保存。
[0044] 1、石油醚、鹽酸和氨水測試結(jié)果
[0045] 稱取保存的花瓣粉末0. 100g，分別放入編有號碼的具塞試管中，分別加入石油醚、 10 %鹽酸、30 %氨水各約10mL，輕輕混勻，過濾，觀察顏色變化，結(jié)果如下：
[0046] (1)石油醚反應(yīng)：甘藍(lán)型油菜、白菜型油菜、芥菜型油菜都表現(xiàn)出亮黃色，表明類 胡蘿卜含量的含量高；羽衣甘藍(lán)表現(xiàn)出淺黃色，說明其含有少量的類胡蘿卜素；而芥藍(lán)和 蘿卜花表現(xiàn)出無色，表明不含類胡蘿卜素。
[0047] (2)鹽酸測試：只有蘿卜紅花瓣表現(xiàn)出粉紅色，說明含有花青素苷，而甘藍(lán)型油 菜、白菜型油菜、芥菜型油菜花瓣表現(xiàn)出不同程度的黃色，說明含黃酮（醇）而不含花青素。 芥藍(lán)白和羽衣甘藍(lán)表現(xiàn)近無色，說明不含有花青素，而且黃酮（醇）也很少。
[0048] (3)氨水測試：蕓薹屬各材料均表現(xiàn)出不同程度的黃色，說明其含有或多或少的 黃酮（醇），而蘿卜花表現(xiàn)出的黃綠色，該顏色是由花色苷呈現(xiàn)的藍(lán)色和類黃酮呈現(xiàn)的黃色 混合而成，但所有材料均不表現(xiàn)橙紅色或紅色，說明不含橙酮。
[0049] 2、類黃酮的顯色反應(yīng)
[0050] 取保存的花瓣粉末0. l〇〇g，用甲醇提取24h，過濾，定容至50mL，各取2mL提取液， 然后進(jìn)行下列顏色反應(yīng)，觀察顏色變化。
[0051] (1)濃鹽酸-鎂粉反應(yīng)：加入少量鎂粉，再后加入濃鹽酸5滴，輕輕搖勻，靜置lh。 結(jié)果顯示，甘藍(lán)型油菜、芥藍(lán)顯示無色，可能含有查爾酮、橙酮；甘藍(lán)型油菜、白菜型油菜、芥 菜型油菜顯示極淡紫紅和微紫紅，說明不含查爾酮、橙酮和兒茶素，可能含有黃酮、黃酮醇、 二氫黃酮醇、二氫黃酮；蘿卜花顯現(xiàn)出粉紅色，說明含有花青素。
[0052] ⑵濃鹽酸-鋅粉反應(yīng)：加入少量鋅粉，再加入濃鹽酸10滴，輕輕搖勻，靜置lh。 結(jié)果顯示，蘿卜花呈現(xiàn)粉紅色，說明含有花青素苷。其余均無色或者黃色，說明不含花青素 苷。
[0053] (3)醋酸鉛反應(yīng)：加1.0%醋酸鉛2mL，輕輕搖勻，靜置2h。結(jié)果顯示，所有蕓薹屬 材料均出現(xiàn)不同程度的黃色沉淀，說明類黃酮具備酚羥基而且不含查耳酮和橙酮，可能具 有鄰二酚羥基或者兼有4-酮基、3-0H或者4-酮基、5-0H結(jié)構(gòu)；蘿卜花出現(xiàn)綠色沉淀，說明 含有花青素苷。
[0054] (4)三氯化鐵反應(yīng)：加5. 0%三氯化鐵2ml，輕輕搖勻。結(jié)果顯示，所有材料都出現(xiàn) 黃色，說明色素分子中不含酚羥基。
[0055] (5)三氯化鋁反應(yīng)：加1. 0%三氯化鋁甲醇溶液I ml。結(jié)果顯示，所有材料都呈現(xiàn) 程度不同的黃色，說明含類黃酮物質(zhì)。
[0056] (6)濃硫酸反應(yīng)：加 I. 5mL濃H2SO4,輕輕搖勻，再置沸水浴5min。所有蕓薹屬材料 均呈現(xiàn)不同程度的黃色，說明含黃酮（醇），沸水中5min顏色不改變，說明不含查爾酮、橙 酮，可能不含二氫黃酮，可能含異黃酮和二氫異黃酮。蘿卜花出現(xiàn)橙黃色，說明含有花青素。
[0057] (7)四氫硼鈉反應(yīng)：加四氫硼鈉8mg，再加1. 0%鹽酸2mL，輕輕搖勻，靜置此。所 有蕓薹屬材料均呈現(xiàn)程度不同的黃色，說明不含二氫黃酮和二氫黃酮醇。蘿卜花呈現(xiàn)極淡 粉紅色，說明含有二氫黃酮和/或二氫黃酮醇。
[0058] (8)堿性試劑反應(yīng)：加5% Na2C033ml，輕輕搖勻，密閉靜置30min，通空氣lOmin。所 有材料均呈現(xiàn)程度不同的黃色，通空氣后顏色不變，說明不含二氫黃酮醇。
[0059] (9)氨性氯化銫反應(yīng)：取甲醇IOml,加氨水定容至25ml,成為被氨水飽和的甲醇溶 液。向樣品液中加入〇. 〇lmol/L氯化鍶甲醇液10滴，再加被氨水飽和的甲醇液10滴，用手 輕輕搖勻，靜置lh。蘿卜花呈現(xiàn)出沉淀，說明有3'，4' -二羥基取代。
[0060] (10)硼酸反應(yīng)：加1.0%硼酸10滴，再加2.0% H3B033ml，芥藍(lán)白花瓣呈現(xiàn)出無色， 說明芥藍(lán)白花瓣類黃酮可能不含c 5-oh。
[0061] 3、花瓣色素成分的紫外-可見光譜分析
[0062] (1)葉綠素：稱取保存的花瓣0. 100g，迅速用液氮研磨至粉末，采用體積分?jǐn)?shù)為 90%的丙酮：乙醇（4:1，V/V)提取24h，過濾，定容至25ml，采用紫外-可見分光光度計在 200?700nm范圍內(nèi)掃描。結(jié)果表明，所有樣品在662nm和644nm處均無吸收峰，說明均不 含葉綠素。
[0063] (2)類胡蘿卜素：稱取保存的花瓣0. 100g，迅速用液氮研磨至粉末，加入石油醚： 丙酮（I: I，V/V)提取24h，過濾，定容至25ml，采用紫外-可見分光光度計在200?700nm 范圍內(nèi)掃描。結(jié)果表明，甘藍(lán)型油菜、白菜型油菜、芥菜型油菜、羽衣甘藍(lán)在440和470nm 左右都有吸收峰，說明含有類胡蘿卜素，定量分析測定的含量分別為6. 824、6. 712、5. 548、 I. 248mg/g。而芥藍(lán)和蘿卜花瓣則沒有特征吸收峰，說明不含有類胡蘿卜素。
[0064] (3)類黃酮：稱取保存的花瓣0. 100g，迅速用液氮研磨至粉末，加入鹽酸化甲醇 (pH = 3) 2ml置于4°C冰箱中提取24h，過濾，定容至25ml，用紫外-可見分光光度計在 220?600nm范圍內(nèi)掃描。結(jié)果表明，甘藍(lán)型油菜、白菜型油菜、芥菜型油菜、羽衣甘藍(lán)、芥 藍(lán)、蘿卜花瓣的提取液在330和270nm均有吸收峰，說明他們都含有類黃酮化合物，定量分 析測定的含量分別為 483、7· 651、7· 001、L 391、L 003、8· 373mg/g。
[0065] (4)花青素苷：稱取保存的花瓣0. 100g，迅速用液氮研磨至粉末，加入甲醇提取 24h，過濾，定容至50ml，用紫外-可見分光光度計在200?700nm范圍內(nèi)掃描。結(jié)果表 明，蘿卜花瓣色素在532nm左右有較明顯的花色苷特征吸收峰，是花色苷帶I吸收峰，在 260-270nm區(qū)域內(nèi)以一個不太強(qiáng)帶II的峰，定量分析測定的含量為237. 27mg/100g。所有 蕓薹屬樣本均無花色苷吸收峰，即不含花色苷。
[0066] 實施例3、蕓薹屬和蘿卜花瓣色素生物合成途徑的分子鑒定
[0067] (1)蕓薹屬和蘿卜花瓣類黃酮途徑基因的表達(dá)特征
[0068] 為研究蕓薹屬和蘿卜花瓣色素出現(xiàn)差異的分子機(jī)理，設(shè)計蕓薹屬和蘿卜類黃酮途 徑基因的RT-PCR檢測引物，并以5SrRNA作為內(nèi)參，具體如表1所示：
[0069] 表1、類黃酮途徑RT-PCR檢測引物

【權(quán)利要求】
1. 干擾蕓薹屬植物花瓣中0 -環(huán)化酶基因LCYB、e -環(huán)化酶基因LCYE表達(dá)同時超量 表達(dá)類胡蘿卜素異構(gòu)酶CRTISO基因在制備花瓣呈紅色的蕓薹屬植物品種中的應(yīng)用。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于：所述干擾蕓薹屬植物花瓣中￠-環(huán)化酶 基因LCYB、e -環(huán)化酶基因LCYE表達(dá)的序列如SEQ ID NO. 2所示，所述超量表達(dá)類胡蘿卜 素異構(gòu)酶CRTISO基因的序列如SEQ ID NO. 3所示。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于：所述干擾蕓薹屬植物花瓣中￠-環(huán)化酶 基因LCYB、e -環(huán)化酶基因LCYE表達(dá)的序列由擬南芥花瓣特異啟動子PAtAP3介導(dǎo)表達(dá)，所 述花瓣特異啟動子PAtAP3的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1第267位至第1044位所示。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項所述的應(yīng)用，其特征在于：所述蕓薹屬植物為甘藍(lán)型油菜 (Brassica napus)〇
5. 干擾蕓薹屬植物花瓣中P -環(huán)化酶基因LCYB、e -環(huán)化酶基因LCYE表達(dá)同時超量 表達(dá)類胡蘿卜素異構(gòu)酶CRTISO基因的植物表達(dá)載體，其特征在于：所述植物載體包括由花 瓣特異啟動子介導(dǎo)的表達(dá)0 -環(huán)化酶基因LCYB、e -環(huán)化酶基因LCYE RNA干擾序列的表達(dá) 框和由組成型啟動子介導(dǎo)表達(dá)類胡蘿卜素異構(gòu)酶CRTISO基因的表達(dá)框。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的植物表達(dá)載體，其特征在于：所述花瓣特異啟動子介導(dǎo)表達(dá) 3 -環(huán)化酶基因LCYB、e -環(huán)化酶基因LCYE RNA干擾序列的表達(dá)框依次由花瓣特異啟動子 PAtAP3、SEQ ID NO. 2所不的序列、間隔序列、SEQ ID NO. 2所不的反向互補序列和NOS終止 子組成。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的植物表達(dá)載體，其特征在于：所述由組成型啟動子介導(dǎo)超量 表達(dá)類胡蘿卜素異構(gòu)酶CRTISO基因的表達(dá)框依次由CaMV35S啟動子，SEQ ID NO. 3所示序 列和NOS終止子組成。
8. 權(quán)利要求5-7任一項所述植物表達(dá)載體的制備方法，其特征在于，包括如下步 驟：將SEQ ID NO. 1所示序列經(jīng)AscI和Swal雙酶切后連入經(jīng)同樣酶切的pFGC5941M質(zhì) 粒，得PFGC5941CEPE質(zhì)粒，然后將SEQ ID NO. 2所示的序列連入PFGC5941CETO載體的 PAtAP3啟動子與間隔序列之間，形成中間載體pFGC5941CEPE-B2RNAia，再將SEQ ID NO. 2 所示序列反向連入中間載體PFGC5941 CEPE-B2RNAia的間隔序列與0CS終止子之間，得 pFGC5941CEPE-B2RNAi載體，最后將SEQ ID NO. 3所示序列通過Ncol和AscI酶切位點連入 經(jīng)同樣酶切的pFGC5941CEPE-B2RNAi載體，得干擾蕓薹屬植物花瓣中0 -環(huán)化酶基因LCYB、 e -環(huán)化酶基因LCYE基因表達(dá)同時超量表達(dá)類胡蘿卜素異構(gòu)酶CRTISO基因的植物表達(dá)載 體。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的制備方法，其特征在于：所述間隔序列為甘藍(lán)型油菜PAP2基 因第2內(nèi)含子。
10. 利用權(quán)利要求5-7任一項所述植物表達(dá)載體制備花瓣呈紅色的蕓薹屬植物品種的 方法，其特征在于，包括如下步驟： a. 將權(quán)利要求5-7任一項所述植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，制得工程菌； b. 將步驟a所得工程菌轉(zhuǎn)化蕓薹屬植物無菌苗的下胚軸，共培養(yǎng)后，在Basta除草劑抗 性下誘導(dǎo)分化獲得再生苗，篩選陽性苗轉(zhuǎn)基因苗得花瓣呈紅色的蕓薹屬植物。
【文檔編號】A01H4/00GK104388464SQ201410794025
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2014年12月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月19日
【發(fā)明者】柴友榮, 劉雪, 廖霏霏, 金筱耘, 付春, 蔣佳怡, 董博, 李加納, 徐新福, 馬書語 申請人:西南大學(xué)