一種液體微膠囊包埋、分化全能干細(xì)胞成心肌細(xì)胞的方法
【專利摘要】一種液體微膠囊包埋、分化全能干細(xì)胞成心肌細(xì)胞的方法，包括如下步驟：（1）將全能干細(xì)胞和海藻酸鈉DMEM培養(yǎng)基溶液混合均勻；（2）包埋有全能干細(xì)胞的海藻酸鈉形成凝膠微膠囊；（3）加入到聚賴氨酸溶液中，形成海藻酸鈉/聚賴氨酸保護(hù)殼；（4）加入到檸檬酸鈉溶液中，海藻酸鈉凝膠的內(nèi)核液化，海藻酸鈉/聚賴氨酸保護(hù)殼完好無(wú)損；（5）分離步驟（4）中含有干細(xì)胞團(tuán)和海藻酸鈉/聚賴氨酸保護(hù)殼的凝膠微膠囊，定向誘導(dǎo)分化成心肌細(xì)胞。本發(fā)明通過(guò)海藻酸鈉包埋，海藻酸鈉/聚賴氨酸外殼保護(hù)，微膠囊內(nèi)核液化提供了一種高效包埋、分化全能干細(xì)胞（胚胎干細(xì)胞、誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞）成心肌細(xì)胞的方法。
【專利說(shuō)明】一種液體微膠囊包埋、分化全能干細(xì)胞成心肌細(xì)胞的方法
[0001]【技術(shù)領(lǐng)域】:
本發(fā)明涉及一種液體微膠囊包埋、分化全能干細(xì)胞成心肌細(xì)胞的方法。
[0002]技術(shù)背景:
全能干細(xì)胞是指具有無(wú)限分化潛能，能分化成所有組織和器官的干細(xì)胞，主要包括兩大類；胚胎干細(xì)胞(Embryonic Stem Cells, ESCs)和誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞(InducedPluripotent Stem Cells, iPSCs),此類細(xì)胞被廣泛分化成各種細(xì)胞，比如心肌細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞、肝臟細(xì)胞等，用于發(fā)病機(jī)理的研究、新藥篩選和細(xì)胞治療等方面。
[0003]對(duì)于心肌細(xì)胞，目前所有的技術(shù)手段主要通過(guò)二維平板的方式培養(yǎng)和誘導(dǎo)，該方法不但生產(chǎn)成本高，工藝難以放大，而且后續(xù)生物反應(yīng)器的放大過(guò)程中，不管是以細(xì)胞微團(tuán)(aggregates)還是微載體(microcarrier)的形式,細(xì)胞都會(huì)在生物反應(yīng)器中經(jīng)歷大的剪切力，這種持續(xù)不斷的剪切力會(huì)使全能干細(xì)胞進(jìn)行自主、無(wú)序分化，從而最終導(dǎo)致整個(gè)定向誘導(dǎo)的分化效率低下。
[0004]
【發(fā)明內(nèi)容】
:
本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，提供一種液體微膠囊包埋、分化全能干細(xì)胞成心肌細(xì)胞的方法。這種方法既能實(shí)現(xiàn)全能干細(xì)胞向心肌細(xì)胞的分化，又能保護(hù)細(xì)胞不受生物反應(yīng)器中剪切力的影響。為此，本發(fā)明采取如下技術(shù)方案:
一種液體微膠囊包埋、分化全能干細(xì)胞成心肌細(xì)胞的方法，包括如下步驟:(I)將全能干細(xì)胞和質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5-3%的海藻酸鈉DMEM培養(yǎng)基溶液混合均勻；(2)通過(guò)靜電滴液法或氣流噴射法方式，使細(xì)胞、海藻酸鈉混合液流經(jīng)26-28G的針頭滴入0.1-0.6M氯化鈣溶液中，靜置3-10分鐘，包埋有全能干細(xì)胞的海藻酸鈉形成凝膠微膠囊；(3)分離步驟(2 )中凝膠微膠囊，加入到質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.01%-0.2%聚賴氨酸溶液中，放置2-10分鐘，形成一層海藻酸鈉/聚賴氨酸保護(hù)殼；(4)分離步驟(3 )中的具有海藻酸鈉/聚賴氨酸保護(hù)殼的凝膠微膠囊，加入到5-60mM檸檬酸鈉溶液中，靜置3 -10分鐘，海藻酸鈉凝膠的內(nèi)核液化，全能干細(xì)胞在液體內(nèi)核中自動(dòng)聚合成一個(gè)干細(xì)胞團(tuán)，海藻酸鈉/聚賴氨酸保護(hù)殼完好無(wú)損；(5)分離步驟(4)中含有干細(xì)胞團(tuán)和海藻酸鈉/聚賴氨酸保護(hù)殼的凝膠微膠囊，加入到心肌細(xì)胞定向誘導(dǎo)培養(yǎng)液中，之后轉(zhuǎn)移至攪拌式生物反應(yīng)器中培養(yǎng)，使接種細(xì)胞濃度在2-5萬(wàn)細(xì)胞每毫升，保持反應(yīng)體系溫度在35-37°C，體系中二氧化碳體積分?jǐn)?shù)在4-7%，定向誘導(dǎo)分化成心肌細(xì)胞。
[0005]采用海藻酸鈉包埋、分化全能干細(xì)胞的方法，細(xì)胞團(tuán)被一層海藻酸鈉/聚賴氨酸外殼保護(hù)，可以使整個(gè)生產(chǎn)過(guò)程放大到生物反應(yīng)器中，而不受剪切力的影響，同時(shí)生長(zhǎng)因子、細(xì)胞代謝產(chǎn)物可以自由進(jìn)出保護(hù)殼。
[0006]作為優(yōu)選，所述步驟(I )中的全能干細(xì)胞包括胚胎干細(xì)胞和誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞，混合均勻后全能干細(xì)胞的細(xì)胞濃度為0.1-10百萬(wàn)細(xì)胞/毫升，海藻酸鈉DMEM培養(yǎng)基溶液中海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)1_2%。通過(guò)控制細(xì)胞在海藻酸鈉溶液中的濃度，可以控制液體微膠囊中細(xì)胞團(tuán)的大小，同時(shí)使細(xì)胞團(tuán)的大小保持一致，保持整個(gè)生產(chǎn)工藝的穩(wěn)定性。
[0007]作為優(yōu)選，所述步驟(2 )中的氯化鈣溶液摩爾濃度為0.1-0.5M。
[0008]作為優(yōu)選，所述步驟(3 )中的聚賴氨酸溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01%-0.1%。利用不同濃度的聚賴氨酸可以有效地調(diào)控液體微膠囊外殼的厚度和分子通透性，不僅可以保證足夠的外殼厚度、硬度，不至于被生物反應(yīng)器中的剪切力破壞外，同時(shí)還可以調(diào)控進(jìn)入液體微膠囊的分子大小，使小分子生長(zhǎng)因子和細(xì)胞代謝產(chǎn)物自由出入保護(hù)殼，而對(duì)細(xì)胞有破壞性的大分子無(wú)法進(jìn)入保護(hù)殼。
[0009]作為優(yōu)選，所述步驟(4 )中的檸檬酸鈉溶液摩爾濃度為10-55mM。一定濃度的檸檬酸鈉使微膠囊內(nèi)核液化，與未液化的微膠囊相對(duì)比，細(xì)胞由于不受周圍固態(tài)微環(huán)境的限制，更有利于自由增殖。
[0010]作為優(yōu)選,所述步驟(4 )中干細(xì)胞團(tuán)大小為200 μπι。研究發(fā)現(xiàn),只有200 μπι大小的細(xì)胞團(tuán)具有最好的分化效率。
[0011]所述步驟(5)定向誘導(dǎo)獲得的心肌細(xì)胞，采用基因表達(dá)、蛋白表達(dá)和功能測(cè)試進(jìn)行驗(yàn)證。
[0012]本發(fā)明的有益效果:
I本發(fā)明通過(guò)海藻酸鈉包埋，海藻酸鈉/聚賴氨酸外殼保護(hù)，微膠囊內(nèi)核液化提供了一種高效包埋、分化全能干細(xì)胞(胚胎干細(xì)胞、誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞)成心肌細(xì)胞的方法。
[0013]2本發(fā)明通過(guò)控制細(xì)胞在海藻酸鈉溶液中的濃度，控制液體微膠囊中細(xì)胞團(tuán)的大小，使細(xì)胞團(tuán)的大小保持一致，保持整個(gè)生產(chǎn)工藝的穩(wěn)定性及較好的分化效率。
[0014]3本發(fā)明通過(guò)利用不同分濃度的聚賴氨酸有效調(diào)控液體微膠囊外殼的厚度和分子通透性，不但可以保護(hù)細(xì)胞團(tuán)不被生物反應(yīng)器中的剪切力破壞，同時(shí)還可以調(diào)控進(jìn)入液體微膠囊的分子大小，使小分子生長(zhǎng)因子和細(xì)胞代謝產(chǎn)物自由出入保護(hù)殼，而對(duì)細(xì)胞有破壞性的大分子無(wú)法進(jìn)入保護(hù)殼。
[0015]4本發(fā)明通過(guò)微膠囊內(nèi)核液化，使細(xì)胞不受周圍固態(tài)微環(huán)境的限制，更有利于其自由增殖。
[0016]【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】:
圖1為液體微膠囊包埋、分化全能干細(xì)胞成心肌細(xì)胞步驟流程圖；
圖2為全能干細(xì)胞在液化和未液化微膠囊微環(huán)境中的生長(zhǎng)曲線圖；
圖3為定向分化的心肌細(xì)胞特有基因的表達(dá)圖；
圖4為分化的心肌細(xì)胞特有蛋白的表達(dá)圖；
圖5為分化的心肌細(xì)胞功能測(cè)試圖。
[0017]【具體實(shí)施方式】:
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明。
[0018]實(shí)施例1
圖1為海藻酸鈉包埋、聚賴氨酸成殼、內(nèi)核液化和全能干細(xì)胞團(tuán)分化成心肌細(xì)胞示意圖，具體包括如下步驟:
(I)將胚胎干細(xì)胞(ESCs)均勻混合于1.5%的海藻酸鈉DMEM培養(yǎng)劑溶液中，使其細(xì)胞密度達(dá)到5百萬(wàn)細(xì)胞/毫升，將細(xì)胞、海藻酸鈉混合液至于含有27G針頭的注射器中；
(2 )用氣流噴射法，通過(guò)27G的針頭將細(xì)胞、海藻酸鈉混合液快速滴入0.1M氯化鈣溶液中，靜置5分鐘并分離出海藻酸鈉凝膠微膠囊，之后用DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基清洗2-3次；
(3 )將步驟(2 )中包埋有全能干細(xì)胞的凝膠微膠囊置于0.05%的聚賴氨酸溶液中2分鐘形成一層海藻酸鈉/聚賴氨酸保護(hù)外殼，并取出一半微膠囊作為未液化對(duì)照組，圖2為細(xì)胞在液化和未液化微膠囊微環(huán)境中的生長(zhǎng)曲線圖，與未液化對(duì)照組相比，液化后微膠囊更有利于細(xì)胞的生長(zhǎng)；
(4)將步驟(3)中的具有海藻酸鈉/聚賴氨酸保護(hù)殼的凝膠微膠囊靜置于55mM的檸檬酸鈉溶液中5分鐘，海藻酸鈉凝膠的內(nèi)核將被液化，干細(xì)胞在液體內(nèi)核中自動(dòng)聚合成一個(gè)細(xì)胞團(tuán)，海藻酸鈉/聚賴氨酸保護(hù)殼完好無(wú)損，內(nèi)核完全液化后，用細(xì)胞培養(yǎng)液清洗2-3次；
(5)將含有干細(xì)胞團(tuán)的具有海藻酸鈉/聚賴氨酸保護(hù)殼的凝膠微膠囊加入到心肌細(xì)胞定向誘導(dǎo)培養(yǎng)液中，并轉(zhuǎn)移至500毫升攪拌式生物反應(yīng)器中培養(yǎng)，保持反應(yīng)體系溫度在35-37° C，體系中二氧化碳體積分?jǐn)?shù)在4-7%，每天定期更換50%的誘導(dǎo)培養(yǎng)液，定向誘導(dǎo)分化成心肌細(xì)胞。
[0019]14-21天后，液化膠囊內(nèi)的細(xì)胞分化成心肌細(xì)胞，開(kāi)始自主跳動(dòng)，對(duì)心肌細(xì)胞進(jìn)行基因表達(dá)、蛋白表達(dá)、細(xì)胞功能測(cè)試驗(yàn)證。
[0020]圖3為心肌細(xì)胞，Nkx2.5，Gata4, Tbx5, ANF, a_MHC和Tbx20等特有基因的表達(dá)圖，圖4為心肌細(xì)胞，肌鈣蛋白I (cTnl)和輔肌動(dòng)蛋白(a-Actinin)等特有蛋白的表達(dá)圖，圖5為心肌的細(xì)胞功能測(cè)試圖，顯示細(xì)胞跳動(dòng)隨3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)的濃度增加而加速跳動(dòng)。圖3-5顯示分化后的細(xì)胞為心肌細(xì)胞。
[0021]實(shí)施例2
圖1為海藻酸鈉包埋、聚賴氨酸成殼、內(nèi)核液化和全能干細(xì)胞團(tuán)分化成心肌細(xì)胞示意圖，具體包括如下步驟:
(I)將胚胎干細(xì)胞(ESCs)均勻混合于0.5%的海藻酸鈉DMEM培養(yǎng)劑溶液中，使其細(xì)胞密度達(dá)到0.1百萬(wàn)細(xì)胞/毫升，將細(xì)胞、海藻酸鈉混合液至于含有26G針頭的注射器中；
(2 )用靜電滴液法，通過(guò)26G的針頭將細(xì)胞、海藻酸鈉混合液快速滴入0.3M氯化鈣溶液中，靜置10分鐘并分離出海藻酸鈉凝膠微膠囊，之后用DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基清洗2-3次；
(3 )將步驟(2 )中包埋有全能干細(xì)胞的凝膠微膠囊置于0.01%的聚賴氨酸溶液中10分鐘形成一層海藻酸鈉/聚賴氨酸保護(hù)外殼，并取出一半微膠囊作為未液化對(duì)照組；
(4)將步驟(3)中的具有海藻酸鈉/聚賴氨酸保護(hù)殼的凝膠微膠囊靜置于5mM的檸檬酸鈉溶液中10分鐘，海藻酸鈉凝膠的內(nèi)核將被液化，干細(xì)胞在液體內(nèi)核中自動(dòng)聚合成一個(gè)細(xì)胞團(tuán)，海藻酸鈉/聚賴氨酸保護(hù)殼完好無(wú)損，內(nèi)核完全液化后，用細(xì)胞培養(yǎng)液清洗2-3次；
(5)將含有干細(xì)胞團(tuán)的具有海藻酸鈉/聚賴氨酸保護(hù)殼的凝膠微膠囊加入到心肌細(xì)胞定向誘導(dǎo)培養(yǎng)液中，并轉(zhuǎn)移至500毫升攪拌式生物反應(yīng)器中培養(yǎng)，保持反應(yīng)體系溫度在35-37° C，體系中二氧化碳體積分?jǐn)?shù)在4-7%，每天定期更換50%的誘導(dǎo)培養(yǎng)液，定向誘導(dǎo)分化成心肌細(xì)胞。
[0022]14-21天后，液化膠囊內(nèi)的細(xì)胞分化成心肌細(xì)胞，開(kāi)始自主跳動(dòng)，對(duì)心肌細(xì)胞進(jìn)行基因表達(dá)、蛋白表達(dá)、細(xì)胞功能測(cè)試驗(yàn)證。
[0023]實(shí)施例3
圖1為海藻酸鈉包埋、聚賴氨酸成殼、內(nèi)核液化和全能干細(xì)胞團(tuán)分化成心肌細(xì)胞示意圖，具體包括如下步驟: (I)將胚胎干細(xì)胞(ESCs)均勻混合于3%的海藻酸鈉DMEM培養(yǎng)劑溶液中，使其細(xì)胞密度達(dá)到10百萬(wàn)細(xì)胞/毫升，將細(xì)胞、海藻酸鈉混合液至于含有28G針頭的注射器中；
(2 )用靜電滴液法，通過(guò)28G的針頭將細(xì)胞、海藻酸鈉混合液快速滴入0.6M氯化鈣溶液中，靜置3分鐘并分離出海藻酸鈉凝膠微膠囊，之后用DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基清洗2-3次；
(3 )將步驟(2 )中包埋有全能干細(xì)胞的凝膠微膠囊置于0.2%的聚賴氨酸溶液中2分鐘形成一層海藻酸鈉/聚賴氨酸保護(hù)外殼，并取出一半微膠囊作為未液化對(duì)照組；
(4)將步驟(3)中的具有海藻酸鈉/聚賴氨酸保護(hù)殼的凝膠微膠囊靜置于60mM的檸檬酸鈉溶液中3分鐘，海藻酸鈉凝膠的內(nèi)核將被液化，干細(xì)胞在液體內(nèi)核中自動(dòng)聚合成一個(gè)細(xì)胞團(tuán)，海藻酸鈉/聚賴氨酸保護(hù)殼完好無(wú)損，內(nèi)核完全液化后，用細(xì)胞培養(yǎng)液清洗2-3次；
(5)將含有干細(xì)胞團(tuán)的具有海藻酸鈉/聚賴氨酸保護(hù)殼的凝膠微膠囊加入到心肌細(xì)胞定向誘導(dǎo)培養(yǎng)液中，并轉(zhuǎn)移至500毫升攪拌式生物反應(yīng)器中培養(yǎng)，保持反應(yīng)體系溫度在35-37° C，體系中二氧化碳體積分?jǐn)?shù)在4-7%，每天定期更換50%的誘導(dǎo)培養(yǎng)液，定向誘導(dǎo)分化成心肌細(xì)胞。
[0024]14-21天后，液化膠囊內(nèi)的細(xì)胞分化成心肌細(xì)胞，開(kāi)始自主跳動(dòng)，對(duì)心肌細(xì)胞進(jìn)行基因表達(dá)、蛋白表達(dá)、細(xì)胞功能測(cè)試驗(yàn)證。
[0025]以上列舉的僅是本發(fā)明的具體實(shí)施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實(shí)施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開(kāi)的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種液體微膠囊包埋、分化全能干細(xì)胞成心肌細(xì)胞的方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟: (1)將全能干細(xì)胞和質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5-3 %的海藻酸鈉0121培養(yǎng)基溶液混合均勻； (2)通過(guò)靜電滴液法或氣流噴射法方式，使細(xì)胞、海藻酸鈉混合液流經(jīng)26-28(}的針頭滴入0.1-0.61氯化鈣溶液中，靜置3 -10分鐘，包埋有全能干細(xì)胞的海藻酸鈉形成凝膠微月父囊； (3)分離步驟(2)中凝膠微膠囊，加入到質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.0196-0.2%聚賴氨酸溶液中，放置2-10分鐘，形成一層海藻酸鈉/聚賴氨酸保護(hù)殼； (4)分離步驟(3)中的具有海藻酸鈉/聚賴氨酸保護(hù)殼的凝膠微膠囊，加入到5-60^1)1檸檬酸鈉溶液中，靜置3 -10分鐘，海藻酸鈉凝膠的內(nèi)核液化，全能干細(xì)胞在液體內(nèi)核中自動(dòng)聚合成一個(gè)干細(xì)胞團(tuán)，海藻酸鈉/聚賴氨酸保護(hù)殼完好無(wú)損； (5)分離步驟(4)中含有干細(xì)胞團(tuán)和海藻酸鈉/聚賴氨酸保護(hù)殼的凝膠微膠囊，加入到心肌細(xì)胞定向誘導(dǎo)培養(yǎng)液中，之后轉(zhuǎn)移至攪拌式生物反應(yīng)器中培養(yǎng)，使接種細(xì)胞濃度在2-5萬(wàn)細(xì)胞每毫升，保持反應(yīng)體系溫度在35-377，體系中二氧化碳體積分?jǐn)?shù)在4-7%，定向誘導(dǎo)分化成心肌細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種液體微膠囊包埋、分化全能干細(xì)胞成心肌細(xì)胞的方法，其特征在于在，所述步驟(1 )中的全能干細(xì)胞包括胚胎干細(xì)胞和誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞，混合均勻后全能干細(xì)胞的細(xì)胞濃度為0.1-10百萬(wàn)細(xì)胞丨毫升，海藻酸鈉0121培養(yǎng)基溶液中海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)優(yōu)選1-2%。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種液體微膠囊包埋、分化全能干細(xì)胞成心肌細(xì)胞的方法，其特征在于所述步驟(2 )中的氯化鈣溶液摩爾濃度優(yōu)選0.1-0.51。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種液體微膠囊包埋、分化全能干細(xì)胞成心肌細(xì)胞的方法，其特征在于所述步驟(3 )中的聚賴氨酸溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)優(yōu)選0.0196-0.1%。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種液體微膠囊包埋、分化全能干細(xì)胞成心肌細(xì)胞的方法，其特征在于所述步驟(4 )中的檸檬酸鈉溶液摩爾濃度優(yōu)選10-55！:！！。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種液體微膠囊包埋、分化全能干細(xì)胞成心肌細(xì)胞的方法，其特征在于所述步驟(4 )中干細(xì)胞團(tuán)大小為200 0 1
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的一種液體微膠囊包埋、分化全能干細(xì)胞成心肌細(xì)胞的方法，其特征在于，所述步驟(5)定向誘導(dǎo)獲得的心肌細(xì)胞，采用基因表達(dá)、蛋白表達(dá)和功能測(cè)試進(jìn)行驗(yàn)證。
【文檔編號(hào)】C12N5/071GK104450605SQ201410689923
【公開(kāi)日】2015年3月25日 申請(qǐng)日期:2014年11月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月26日
【發(fā)明者】荊東輝 申請(qǐng)人:荊東輝