一種快速檢測、鑒定李斯特屬細(xì)菌的方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于分子生物檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，提供了一種從環(huán)境中分別檢測、鑒定李斯特屬六個種細(xì)菌的六對PCR引物、檢測的方法。本發(fā)明提供的PCR引物對是根據(jù)李斯特屬細(xì)菌特異性靶基因iap設(shè)計而成，該靶基因穩(wěn)定高、特異性強(qiáng)，經(jīng)合理的PCR反應(yīng)體系，凝膠電泳檢測手段，可快速、準(zhǔn)確地鑒定出存在于環(huán)境中的六個種的李斯特菌。檢測方法步驟包括：(1)提取樣品DNA，分別選用不同引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增；(2)根據(jù)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段長度判斷待測樣品中是否含有李斯特屬細(xì)菌。該方法可快速、準(zhǔn)確、靈敏地檢測和鑒定環(huán)境和食品樣中6種李斯特菌，不僅提高了效率，節(jié)約時間，而且節(jié)省檢測成本。
【專利說明】一種快速檢測、鑒定李斯特屬細(xì)菌的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種快速檢測、鑒定環(huán)境中李斯特屬細(xì)菌的方法，屬分子生物檢測技 術(shù)領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0002] 李斯特菌屬（Listeriaspp.)厚壁菌門，與芽孢桿菌、梭狀芽孢桿菌、腸球菌、 鏈球菌和葡萄球菌并列；該屬低G+C含量（36-42% )、好氧或兼性厭氧、無孢子桿菌， 在10-25 °C下產(chǎn)生鞭毛，能夠運動。目前，李斯特菌屬有6個種，分別是單增李斯特菌 (L.monocytogenes)、綿羊李斯特菌（L.ivanovii)(伊氏李斯特菌）、英諾克李斯特菌 (L.innocua)、威爾斯李斯特菌（L.welshimeri)、西爾李斯特菌（L.seeligeri)和格氏李斯 特菌（Lgrayi)。這六個種在環(huán)境中廣泛分布，其中單增和綿羊李斯特菌具有致病性。單 增李斯特菌是一種人畜共患的病原菌，能產(chǎn)生嚴(yán)重的敗血癥、腦膜炎，引起人類死亡率約為 20-30%李氏桿菌病；食品是導(dǎo)致人類感染的主要途徑。單增李斯特菌的一個重要特點是， 可在冷藏溫度4°C下繁殖生長，若時間足夠長，將達(dá)到很大的數(shù)量。近二十年以來，發(fā)達(dá)國家 由于飲食習(xí)慣其食源性李氏桿菌病發(fā)病率日漸增多，國內(nèi)亦有單增李斯特菌污染食品及李 斯特菌病發(fā)生的報道。由于單增李斯特菌的耐受性，可污染種類繁多的食品，而引起食物中 毒甚至引起高病死率的李氏桿菌病。2002年被WHO列為僅次于大腸桿菌0157、沙門氏菌、 志賀氏菌后的第4大重要的食源性致病菌。綿羊李斯特菌為動物性致病菌，主要引起反芻 動物的流產(chǎn)；英諾克李斯特菌常常伴隨單增李斯特菌存在，對人類具有一定的潛在致病性； 剩余3個種的李斯特菌對人和動物的危害相對較小。非致病性李斯特菌由于常與致病的李 斯特菌共同存在于環(huán)境中尤其是食品中，因此也被作為致病李斯特菌的指示菌。
[0003] 從有記載的最早1924年Murray在發(fā)病的兔子和豚鼠中分離到單增李斯特菌開 始，尤其進(jìn)入21世紀(jì)后，每年李斯特菌造成了巨大的損失；其中僅2011年美國單增李斯特 菌污染甜瓜事件就導(dǎo)致30人死亡，1名孕婦流產(chǎn)。
[0004] 目前鑒別菌株的方法有：傳統(tǒng)方法、自動生化鑒定、抗體技術(shù)（酶聯(lián)免疫吸附分 析）和分子生物學(xué)技術(shù)（聚合酶鏈反應(yīng)（PCR)或DNA雜交）。傳統(tǒng)微生物學(xué)方法作為金標(biāo) 準(zhǔn)，已用于細(xì)菌的鑒定許多年，目前仍然是微生物實驗室不可分割的一部分，但由于其時間 長，不適合測試與保質(zhì)期短的產(chǎn)品。例如現(xiàn)行的GB4789. 30-2010檢測李斯特氏菌的方法， 從樣品處理后經(jīng)42-48h的兩次增菌后，再經(jīng)24-48h的顯色培養(yǎng)基篩選，經(jīng)24-48h的純化 培養(yǎng)后，進(jìn)行生化鑒定、溶血和協(xié)同溶血實驗，整個過程步驟繁瑣、時間長（最短120小時， 最長168小時）、花費大且工作強(qiáng)度大；亟需建立操作簡單，時間快、特異性好，無需特殊、大 型、昂貴設(shè)備的分子生物學(xué)方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供了一種快速檢測和鑒定環(huán)境中李斯特菌屬六個種細(xì)菌的 方法。
[0006] 本發(fā)明還提供了用于檢測李斯特菌屬六個種細(xì)菌的特異性引物。
[0007] 上述是一種快速、準(zhǔn)確、靈敏的PCR檢測、鑒定六個種李斯特菌的方法，為鑒定李 斯特菌提供選擇。本發(fā)明不僅提高效率，節(jié)約時間，而且節(jié)省檢測成本。
[0008] 本發(fā)明技術(shù)方案為，基于iap特異性引物建立一種多重PCR快速檢測和鑒定六種 李斯特菌的方法，包括如下步驟：
[0009] (1)取待檢樣品菌液分別制備基因組總DNA作為模板，使用引物對分別進(jìn)行PCR 擴(kuò)增；所述的引物對中，上游引物為Iap-F，特異性下游引物選擇以下六個序列中的至少一 種：
[0010] (a)鑒定單增李斯特菌的

【權(quán)利要求】
1. 一種快速檢測、鑒定李斯特屬細(xì)菌的方法，其特征在于，包括以下步驟： ⑴提取待測樣品中總細(xì)菌DNA作為模板，分別使用引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增；所述的引物 對中，上游引物為Iap-F，特異性下游引物選擇以下六個序列中的至少一種： (a) 鑒定單增李斯特菌的 LM-R :TAGCACTTGCACTTGAAITGCTG (b) 鑒定英諾克李斯特菌的 LIN-R :GTGiriTITGATGGTGTGCTTGC (c) 鑒定西爾李斯特菌的 LS-R :TTTTTAACAGTAGTAGTAGGAGTG (d) 鑒定威爾李斯特菌的LW-R :GTGCAGGCGCTGGAGCC (e) 鑒定綿羊李斯特菌的LIV-R :TGCCGCTTGCGCTTGAG (f) 鑒定格氏李斯特菌的 LG-R :CAGGTGTACTTACmTTGTTCTAC ; Iap-F 上游引物的序列為：ATGAATATGAAAAAAGCAACKATC ; (2)根據(jù)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段長度判斷待測樣品中是否含單增李斯特菌、英諾克李斯特 菌、西爾李斯特菌、威爾斯李斯特菌、綿羊李斯特菌和格氏李斯特菌，判斷標(biāo)準(zhǔn)為： Iap-F與LM-R引物對擴(kuò)增，得到1110?1130bp片段的，為單增李斯特菌； Iap-F與LIN-R引物對擴(kuò)增，得到980?lOOObp片段的，為英諾克李斯特菌； Iap-F與LS-R引物對擴(kuò)增，得到840?860bp片段的，為西爾李斯特菌； Iap-F與LW-R引物對擴(kuò)增，得到910?930bp片段的，為威爾李斯特菌； Iap-F與LIV-R引物對擴(kuò)增，得到470?490bp片段的，為綿羊李斯特菌； Iap-F與LG-R引物對擴(kuò)增，得到840?860bp片段的，為格氏李斯特菌。
2. 權(quán)利要求1所述快速檢測、鑒定李斯特屬細(xì)菌的方法，其特征在于，步驟（2)中的 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析。
3. 權(quán)利要求1或2所述快速檢測、鑒定李斯特屬細(xì)菌的方法，其特征在于，步驟（2)中 的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用0. 6%?1. 5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。
4. 權(quán)利要求1所述快速檢測、鑒定李斯特屬細(xì)菌的方法，其特征在于，步驟（1)中PCR 擴(kuò)增條件為： 鑒定單增李斯特菌、英諾克李斯特菌，93?95°C預(yù)變性4. 5?6分鐘；93?95°C變性 40?50秒、55?57°C退火40?50秒、71?74°C延伸55?60秒，30?40個循環(huán)，再于 71?74°C延伸9?12分鐘； 鑒定西爾李斯特菌，93?95 °C預(yù)變性4. 5?6分鐘，93?95 °C變性40?50秒，93? 95°C變性40?50秒、50?53°C退火40?50秒、71?74°C延伸45?60秒，30?40個循 環(huán)，再于71?74°C延伸9?12分鐘； 鑒定威爾李斯特菌，93?95 °C預(yù)變性4. 5?6分鐘，93?95 °C變性40?50秒，93? 95°C變性40?50秒、58?60°C退火40?50秒、71?74°C延伸55?60秒，30?40個循 環(huán)，再于71?74°C延伸9?12分鐘； 鑒定綿羊李斯特菌，93?95°C預(yù)變性4. 5?6分鐘，93?95°C變性40?50秒，93? 95°C變性40?50秒、57?60°C退火40?50秒、71?74°C延伸45?60秒，30?40個循 環(huán)，再于71?74°C延伸9?12分鐘； 鑒定格氏李斯特菌，93?95°C預(yù)變性4. 5?6分鐘，93?95°C變性40?50秒，93? 95°C變性40?50秒、53?55°C退火40?50秒、71?74°C延伸40?50秒，30?40個循 環(huán)，再于71?74°C延伸9?12分鐘。
5. 權(quán)利要求1所述快速檢測、鑒定李斯特屬細(xì)菌的方法，其特征在于，步驟（1)中PCR 擴(kuò)增條件為： 鑒定單增李斯特菌、英諾克李斯特菌，94°C預(yù)變性5分鐘；94°C變性45秒、56°C退火45 秒、72°C延伸60秒，35個循環(huán)，再于72°C延伸10分鐘； 鑒定西爾李斯特菌，94°C預(yù)變性5分鐘，94°C變性45秒、52°C退火45秒、72°C延伸50 秒，35個循環(huán)，再于72°C延伸10分鐘； 鑒定威爾李斯特菌，94°C預(yù)變性5分鐘，94°C變性45秒，59°C退火45秒、72°C延伸60 秒，35個循環(huán)，再于72°C延伸10分鐘； 鑒定綿羊李斯特菌，94°C預(yù)變性5分鐘，94°C變性45秒，58°C退火45秒、72°C延伸30 秒，35個循環(huán)，再于72°C延伸10分鐘； 鑒定格氏李斯特菌，94°C預(yù)變性5分鐘，94°C變性45秒，54°C退火45秒、72°C延伸45 秒，35個循環(huán)，再于72 °C延伸10分鐘。
6. 權(quán)利要求1所述快速檢測、鑒定李斯特屬細(xì)菌的方法，其特征在于，步驟（2)中，判斷 標(biāo)準(zhǔn)為： Iap-F和LM-R為引物擴(kuò)增，得到1120bp條帶的，判定為單增李斯特菌； Iap-F和LIN-R為引物擴(kuò)增，得到919bp條帶的，判定為英諾克李斯特菌； Iap-F和LS-R為引物擴(kuò)增，得到851bp條帶的，判定為西爾李斯特菌； Iap-F和LW-R為引物擴(kuò)增，得到919bp條帶的，判定為威爾斯李斯特菌； Iap-F和LIV-R為引物擴(kuò)增，得到483bp條帶的，判定為綿羊李斯特菌； Iap-F和LG-R為引物擴(kuò)增，得到847bp條帶的，判定為格氏李斯特菌。
【文檔編號】C12Q1/68GK104342496SQ201410667734
【公開日】2015年2月11日 申請日期:2014年11月20日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月20日
【發(fā)明者】劉海泉, 趙勇, 潘迎捷, 孫曉紅 申請人:上海海洋大學(xué)