一株單增李斯特菌單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】一株單增李斯特菌單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株及其應(yīng)用，屬于食品安全免疫學(xué)檢測【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明將單增李斯特菌特異性多肽完全抗原與等體積的弗氏佐劑（Freundadjuvant，Sigma）混合均勻后，通過皮下注射免疫BALB/c小鼠。經(jīng)過4次免疫后將免疫的小鼠的脾細(xì)胞通過PEG方法與小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合，經(jīng)過間接ELISA篩選和三次亞克隆，得到一株單克隆細(xì)胞株A號。此單克隆細(xì)胞株A號分泌的單克隆抗體，對不同的單增李斯特菌培養(yǎng)上清均有交叉反應(yīng)，而對李斯特菌屬內(nèi)的非單增李斯特菌以及E.coliO157、沙門氏菌、空腸彎曲菌沒有交叉反應(yīng)，可以用于食品中單增李斯特菌的特異性檢測。
【專利說明】一株單增李斯特菌單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一株單增李斯特菌單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株及其應(yīng)用，具體涉及單克隆細(xì)胞株A號及其產(chǎn)生的單增李斯特菌單克隆抗體的應(yīng)用，屬于食品安全免疫學(xué)檢測【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002]單增李斯特菌(L.monocytohenes)是一種廣泛存在于環(huán)境中的革蘭氏陽性菌,是國際上重要的人畜共患病原菌。單增李斯特菌是李斯特菌的一種，其它李斯特菌包括綿羊李斯特菌(L.1uanuii)、英諾克李斯特菌(L.1nnocua)、威爾斯李斯特菌(L.welshimeri)、西爾李斯特菌(L.seeligeri)、格氏李斯特菌(L.grayi)、默氏李斯特菌(L.murrayi),但單增李斯特菌是唯一引起人類致病的李斯特菌。
[0003]單增李斯特菌的易感人群主要是兒童、老年人、孕婦和慢性病患者等免疫力較差人群，感染后主要表現(xiàn)為敗血癥、腦膜炎和單核細(xì)胞增多。肉類、蛋類、禽類、海產(chǎn)品、乳制品、蔬菜等都曾被證實(shí)是李斯特菌的感染源，而且該菌在4°C的環(huán)境中仍可生長繁殖，是冷藏食品如乳制品中威脅人類健康的主要病原菌之一。因此很多國家都已經(jīng)采取措施來控制食品中的單增李斯特菌，并制定了相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)。
[0004]目前檢測單增李斯特菌的方法主要有:平板培養(yǎng)法、免疫學(xué)方法和分子生物學(xué)方法。平板培養(yǎng)法是我國的國標(biāo)方法，結(jié)果可靠，操作相對簡單，但過程復(fù)雜，耗時(shí)很長。免疫學(xué)檢測方法主要是基于抗原抗體特異性反應(yīng)而實(shí)現(xiàn)對待檢測物進(jìn)行檢測的，具有靈敏度高、操作簡單、檢測時(shí)間快、處理樣品多的特點(diǎn)。分子生物學(xué)方法分子檢測方法是基于脫氧核糖核酸(DNA)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)建立起來的，目前的檢測方法已具有快速、靈敏、特異性好、自動(dòng)化程度高的特點(diǎn)。然而分子生物學(xué)方法依賴于檢測儀器、對操作人員要求較高,因此檢測成本相對較高。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種可以特異性檢測單增李斯特菌而不對李斯特菌屬內(nèi)其它菌有交叉反應(yīng)的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案，一株單增李斯特菌單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，其分類命名為單克隆細(xì)胞株A號，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為 CGMCC N0.9301。
[0007]所述菌株的制備基本步驟為:
(O免疫原的制備與鑒定:偶聯(lián)劑SMCC先通過琥珀酰亞胺酯與載體蛋白的氨基相連，隨后人工合成的N端修飾色氨酸(Cys)單增李斯特菌P60蛋白多肽P印tide D (PepD:QQQTAPKAPTE)通過色氨酸的巰基與載體蛋白上馬來酰亞胺基團(tuán)反應(yīng)，透析分離完全抗原和未偶聯(lián)的小分子半抗原，并通過電泳圖鑒定；
(2)小鼠的免疫:單增李斯特菌特異性多肽完全抗原與等體積的弗氏佐劑(Freundadjuvant, Sigma),混合均勻后,通過皮下注射免疫BALB/c小鼠。首次免疫使用弗氏完全佐劑，隨后的3次加強(qiáng)免疫使用弗氏不完全佐劑；
(3)細(xì)胞融合與細(xì)胞株建立:通過聚乙二醇(PEG4000)法將小鼠脾細(xì)胞和小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合，通過HAT培養(yǎng)基培養(yǎng)，利用間接ELISA檢測陽性細(xì)胞孔，通過有限稀釋法對陽性細(xì)胞孔進(jìn)行三次亞克隆，最終篩選獲得雜交瘤細(xì)胞株:單克隆細(xì)胞株A號；
(4)雜交瘤細(xì)胞株性質(zhì)的鑒定:抗體亞型的鑒定采用小鼠單克隆抗體亞型試劑盒方法。
[0008]所述菌株單克隆細(xì)胞株A號分泌產(chǎn)生的單增李斯特菌單克隆抗體，其由單增李斯特菌單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株單克隆細(xì)胞株A號所分泌產(chǎn)生。利用其能夠特異性檢測單增李斯特菌的特點(diǎn)，應(yīng)用于單增李斯特菌分析檢測。
[0009]本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明獲得的單增李斯特菌單克隆抗體細(xì)胞株A號可以特異性識別單增李斯特菌在培養(yǎng)上清中分泌的P60蛋白，而不對李斯特菌屬內(nèi)其它菌分泌的P60蛋白有交叉反應(yīng)。也不對其它重要的食源性致病菌，如E.coli 0157、沙門氏菌、空腸彎曲菌等有交叉反應(yīng)。
[0010]生物材料樣品保藏:上述小鼠單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株單克隆細(xì)胞株A號，已于2014年5月28日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱CGMCCJi址為:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，保藏編號為CGMCCN0.9301。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0011]圖1、多肽-SMCC- BSA 免疫原的電泳表征圖。1、BSA，2、BSA-SMCC (I: 40),3,BSA-SMCC-LM 多肽(I: 40: 20)，4、BSA-SMCC-LM 多肽(I: 40: 40)。

【具體實(shí)施方式】
[0012]本發(fā)明下面的實(shí)施例僅作為本
【發(fā)明內(nèi)容】
的進(jìn)一步說明，不能作為本發(fā)明的限定內(nèi)容或范圍。下面通過實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
[0013]本發(fā)明通過將P60多肽P印tide D完全抗原免疫小鼠，通過細(xì)胞融合，HAT選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)，通過間接ELISA篩選細(xì)胞上清，最終得到了特異性識別單增李斯特菌培養(yǎng)上清P60蛋白的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株A號。
[0014]實(shí)施例1單克隆細(xì)胞株A號的制備
1、完全抗原的合成:取Irng SMCC用DMF溶解，并加入到用偶聯(lián)緩沖液(0.1M PB緩沖液，含0.15M NaCl)溶解的5mg BSA溶液中，室溫反應(yīng)2h后用超濾管(Millipore，cutoff3000)洗滌離心3次，用適量偶聯(lián)緩沖液重懸活化后的BSA。稱取3.75mg多肽p印tide D，用適量偶聯(lián)緩沖液溶解后緩緩加入到活化后的BSA溶液中。室溫?cái)嚢璺磻?yīng)2h后，4°C透析三天，-20°C分裝保存。
[0015]2、動(dòng)物免疫:選擇健康的6~8周齡的BALB/c小鼠進(jìn)行免疫。取p印tide D完全抗原(lmg/mL)與等體積的弗氏佐劑(Freundadjuvant, Sigma)混合均勻后,通過皮下注射免疫BALB/c小鼠。首次免疫使用弗氏完全佐劑，隨后的3次加強(qiáng)免疫使用弗氏不完全佐劑，時(shí)間間隔均為21天。四免后10天采血，使用間接ELISA方法測定小鼠血清效價(jià)，選擇效價(jià)最高的小鼠，在四免后15天沖擊免疫，不使用佐劑，腹腔注射。
[0016]3、細(xì)胞融合:
在沖擊免疫三天后，按照常規(guī)PEG (聚乙二醇，分子量為4000)方法進(jìn)行細(xì)胞融合，具體步驟如下:
(1)無菌取小鼠脾臟，研磨并通過200目細(xì)胞篩網(wǎng)得到脾細(xì)胞懸液，并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)；
(2)收集SP2/0細(xì)胞，懸浮于RPM1-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液中，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)；
(3)將脾細(xì)胞和SP2/0細(xì)胞按照數(shù)量比1: 10的比例混合，離心后用50% (w/v) PEG融合，時(shí)間I min，之后按照從慢到快，加入RPM1-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液，離心后懸浮于含20%胎牛血清、2%的50XHAT的RPM1-1640篩選培養(yǎng)液中，加到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，置于37°C，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0017]4、細(xì)胞篩選與細(xì)胞株建立:在細(xì)胞融合的第三天對融合細(xì)胞進(jìn)行RPM1-1640篩選培養(yǎng)液半換液，第6天進(jìn)行用含20%胎牛血清、1%的100XHT的RPM1-1640過渡培養(yǎng)液進(jìn)行全換液，在第8天取細(xì)胞上清進(jìn)行篩選。篩選用間接ELISA篩選出陽性細(xì)胞孔，采用有限稀釋法進(jìn)行亞克隆，用同樣的方法進(jìn)行檢測。重復(fù)三次，獲得單克隆細(xì)胞株A號。
[0018]實(shí)施例2單克隆抗體的制備與鑒定
取8-10周齡BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射石蠟油ImL ；7天后每只小鼠腹腔注射實(shí)施例I制備的I X 16單克隆細(xì)胞株A號，從第七天開始收集腹水，將腹水通過辛酸-硫酸銨法純化，獲得的單抗置于_20°C保存。
[0019]使用小鼠單抗亞型鑒定試劑盒對腹水純化獲得的單克隆抗體進(jìn)行免疫球蛋白亞型鑒定，其亞型為IgGl型。
[0020]單克隆細(xì)胞株A號單克隆抗體的亞型鑒定如表1所示。
[0021]表1單克隆細(xì)胞株A號的單克隆抗體的亞型鑒定

【權(quán)利要求】
1.一株單增李斯特菌單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，其分類命名為單克隆細(xì)胞株A號，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC N0.9301。
2.權(quán)利要求1所述菌株單克隆細(xì)胞株A號分泌產(chǎn)生的單增李斯特菌單克隆抗體，其特征在于:其由單增李斯特菌單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株單克隆細(xì)胞株A號所分泌產(chǎn)生。
3.權(quán)利要求2所述單增李斯特菌單克隆抗體的應(yīng)用，其特征在于:利用其能夠特異性檢測單增李斯特菌的特點(diǎn)，應(yīng)用于單增李斯特菌分析檢測。
【文檔編號】G01N33/569GK104178458SQ201410260781
【公開日】2014年12月3日 申請日期:2014年6月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月13日
【發(fā)明者】馬偉, 胥傳來, 王文彬, 匡華, 徐麗廣, 劉麗強(qiáng), 宋珊珊, 吳曉玲 申請人:無錫杰圣杰康生物科技有限公司, 江南大學(xué)