一種利用硝酸鈉促進(jìn)捕食線蟲真菌產(chǎn)生分生孢子的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種利用硝酸鈉促進(jìn)捕食線蟲真菌產(chǎn)生分生孢子的方法，屬于應(yīng)用微生物學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明方法包括培養(yǎng)基的配制、捕食線蟲真菌的培養(yǎng)、分生孢子的收集和計(jì)數(shù)。本發(fā)明利用在玉米粉瓊脂CMA培養(yǎng)基中添加濃度為0.2％的NaNO3來(lái)促進(jìn)捕食線蟲真菌產(chǎn)生分生孢子。本發(fā)明方法與現(xiàn)有的方法相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：利用本發(fā)明方法獲得的分生孢子數(shù)量顯著增加，最多達(dá)到4倍以上；本發(fā)明操作簡(jiǎn)單易行，重復(fù)性好，能夠獲得大量分生孢子，為進(jìn)一步研究和利用捕食線蟲真菌作為病原線蟲的生防菌奠定了良好的基礎(chǔ)。
【專利說(shuō)明】一種利用硝酸鈉促進(jìn)捕食線蟲真菌產(chǎn)生分生孢子的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
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[0001]本發(fā)明涉及一種利用硝酸鈉促進(jìn)捕食線蟲真菌產(chǎn)生分生孢子的方法，屬于應(yīng)用微生物學(xué)領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
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[0002]植物寄生線蟲是植物的重要病害之一，全球每年由于植物寄生線蟲所引起的農(nóng)作物經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)1570億美元(Abad et al.，2008)。在我國(guó)，線蟲危害煙草、花卉、蔬菜、棉花、大豆、花生、小麥、水稻、林木、中藥材等幾乎所有的經(jīng)濟(jì)作物，成為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中重要的限制因子之一。目前對(duì)線蟲病害的防治仍然以化學(xué)防治為主，但由于化學(xué)農(nóng)藥對(duì)生態(tài)環(huán)境的影響以及病原線蟲抗藥性的增加，使其應(yīng)用逐步受到限制，因此采用線蟲天敵進(jìn)行生物防治日益受到研究人員的關(guān)注(劉杏忠等，2004 ;楊曉野等,2004 ；Moosavi and Zare, 2012)。
[0003]捕食線蟲真菌(Nematode-trapping fungi)是線蟲的重要天敵之一，它們對(duì)于自然界中線蟲種群的動(dòng)態(tài)平衡具有重要的調(diào)節(jié)作用。捕食線蟲真菌根據(jù)形態(tài)學(xué)特征分為節(jié)叢抱屬(Arthrobotrys spp.)、單頂抱屬(Monacrosporium spp.)和隔指抱屬(Dactylellaspp.)(張克勤等，2006)。捕食線蟲真菌的營(yíng)養(yǎng)菌絲能夠特化形成粘性菌網(wǎng)、粘球和收縮環(huán)等捕食器官捕捉和侵染線蟲(張克勤等，2006 ；Yang et al., 2011) ?捕食線蟲真菌在土壤中通常以腐生生活模式生長(zhǎng)，當(dāng)接觸到線蟲后會(huì)產(chǎn)生捕食器官捕捉線蟲，同時(shí)生活模式也轉(zhuǎn)化為寄生生活模式。因此，捕食器官的形成是捕食線蟲真菌從腐生向寄生生活方式轉(zhuǎn)變的重要標(biāo)志(Yang et al.，2011)。此外，部分捕食線蟲真菌的分生孢子能夠萌發(fā)直接形成捕食器官，而不經(jīng)過(guò)中間的菌絲階段。這種結(jié)構(gòu)被稱為分生孢子捕食器官，常見(jiàn)于自然環(huán)境(例如牛糞和根際土壤)，它們與菌絲分化形成的捕食器官一樣具有捕獲線蟲的能力(Dackman and Nordbring-Hertz, 1992 ；Persmark and Nordbring-Hertz, 1997)?？傊妒尘€蟲真菌是一類非常重要的線蟲病害的生防資源。
[0004]目前，已經(jīng)有多種捕食線蟲真菌被開(kāi)發(fā)成商品用于植物線蟲病害的生物防治，包括Arthrobotrys irregularis 和 Arthrobotrys robusta(Dong and Zhang, 2006)。與化學(xué)農(nóng)藥相比，利用捕食線蟲真菌開(kāi)發(fā)的生防制劑是一種活菌劑，因此生防制劑的保存期和貨架期較短。而分生孢子和菌絲相比，它的抗逆性更強(qiáng)，在常溫或低溫條件下的存活期更長(zhǎng)。因此提高捕食線蟲真菌產(chǎn)生分生孢子的能力，開(kāi)發(fā)以分生孢子為主的線蟲生防制劑，不僅能夠延長(zhǎng)捕食線蟲真菌開(kāi)發(fā)的生防制劑的保質(zhì)期和貨架期，同時(shí)也為研究捕食線蟲真菌形成分生孢子的分子機(jī)制奠定了良好的基礎(chǔ)。
[0005]分生孢子的形成是真菌抵御外界不良環(huán)境的一種生存方式。一般來(lái)講，在營(yíng)養(yǎng)條件豐富時(shí)，捕食線蟲真菌生長(zhǎng)旺盛而產(chǎn)孢很少，相反在營(yíng)養(yǎng)條件貧瘠的培養(yǎng)基上容易產(chǎn)孢而菌絲生長(zhǎng)較差。在實(shí)驗(yàn)室，人們通常采用玉米粉瓊脂培養(yǎng)基(CMA)培養(yǎng)捕食線蟲真菌的分生孢子。本發(fā)明在CMA培養(yǎng)基中添加0.2%硝酸鈉(NaNO3)能夠有效促進(jìn)捕食線蟲真菌形成分生孢子，分生孢子的數(shù)量最多增加4倍以上。
[0006]經(jīng)文獻(xiàn)檢索，未發(fā)現(xiàn)與本
【發(fā)明內(nèi)容】
相同文獻(xiàn)的公開(kāi)報(bào)道。
【發(fā)明內(nèi)容】
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[0007]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有的技術(shù)不足，提供一種利用硝酸鈉促進(jìn)捕食線蟲真菌產(chǎn)生分生孢子的方法，為進(jìn)一步研究捕食線蟲真菌產(chǎn)生分生孢子的分子機(jī)制、以及延長(zhǎng)捕食線蟲真菌生防制劑的保質(zhì)期和貨架期奠定基礎(chǔ)。
[0008]本發(fā)明涉及的硝酸鈉(NaNO3)為實(shí)驗(yàn)室常規(guī)實(shí)驗(yàn)用品，能從國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)購(gòu)買得到。本發(fā)明涉及的捕食線蟲真菌，如寡孢節(jié)叢孢(Arthrobotrys oligospora)、堅(jiān)粘孢單頂孢(Monacrosporium haptotylum)和環(huán)捕節(jié)叢抱(Arthrobotrys brochopaga)為常規(guī)實(shí)驗(yàn)真菌，對(duì)人體和動(dòng)物沒(méi)有致病性，能夠從國(guó)內(nèi)外的微生物保藏機(jī)構(gòu)購(gòu)買獲得。
[0009]本發(fā)明實(shí)現(xiàn)的步驟如下:
[0010]1.培養(yǎng)基
[0011]培養(yǎng)基的組成和配制方法如下:
[0012]I)馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA):用于捕食線蟲真菌菌種的活化。去皮馬鈴薯200g，切塊、煮沸30分鐘，6層紗布過(guò)濾收集上清液，加入葡萄糖20g，加水補(bǔ)充體積到100mL，121°C 滅菌 20 分鐘。
[0013]2)玉米粉瓊脂培養(yǎng)基(CMA):用于捕食線蟲真菌分生孢子的培養(yǎng)。稱取20g玉米粉，加入100mL去離子水，煮沸20分鐘，用6層紗布過(guò)濾收集液體，加入20g瓊脂，121 °C滅菌20分鐘。
[0014]3) CMA+NaN03培養(yǎng)基:用于捕食線蟲真菌分生孢子的培養(yǎng)。CMA培養(yǎng)基的配制方法同上，分別加入濃度為0.1-0.8%的NaNO3,121°C滅菌20分鐘。
[0015]2.捕食線蟲真菌的培養(yǎng)(以捕食線蟲真菌的模式菌株寡孢節(jié)叢孢A.0ligospora為例)
[0016]I)寡孢節(jié)叢孢的活化:接種寡孢節(jié)叢孢菌種在PDA, 28°C培養(yǎng)6_7天。
[0017]2)寡孢節(jié)叢孢分生孢子的培養(yǎng):按上述方法配制CMA和CMA+NaN03培養(yǎng)基，分裝到250mL三角瓶中(40mL/瓶)，用紗布和牛皮紙封口，121°C滅菌20分鐘。滅菌的培養(yǎng)基室溫放置2天，讓殘留在瓶壁和培養(yǎng)基表面的水分盡量散失。無(wú)菌條件下，用打孔器取相同大小的寡孢節(jié)叢孢菌塊接種于CMA和CMA+NaN03培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)14天，培養(yǎng)分生孢子。
[0018]3.捕食線蟲真菌分生孢子的收集(以寡孢節(jié)叢孢A.0ligospora為例)
[0019]I)實(shí)驗(yàn)用品:滅菌去離子水、滅菌玻璃珠、滅菌漏斗(4層擦鏡紙)等。
[0020]2)操作步驟:
[0021]①往培養(yǎng)寡孢節(jié)叢孢的三角瓶中加入滅菌去離子水(8mL/瓶)，然后加入適量滅菌玻璃珠，振蕩2-3min ；
[0022]②用移液器將三角瓶中的孢子溶液轉(zhuǎn)移至裝有無(wú)菌擦鏡紙的漏斗內(nèi)過(guò)濾；
[0023]③向上述三角瓶中再次加入8ml滅菌去離子水，用相同方法重洗一次孢子，液體轉(zhuǎn)移至同一漏斗內(nèi)過(guò)濾；
[0024]④將濾液轉(zhuǎn)移至另一裝有無(wú)菌擦鏡紙的漏斗內(nèi)再次過(guò)濾；
[0025]⑤將第④步獲得的濾液用移液器轉(zhuǎn)移到Eppendorf管中，12000rpm/min,離心2min ；
[0026]⑥孢子懸液的濃縮:得到的孢子懸液濃縮至一定體積，然后用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算孢子的濃度。
[0027]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明有以下優(yōu)點(diǎn):
[0028]1、硝酸鈉能夠有效促進(jìn)捕食線蟲真菌產(chǎn)生分生孢子，最多達(dá)到4倍以上；
[0029]2、本發(fā)明具有簡(jiǎn)單易行、重復(fù)性好和可控性強(qiáng)的特點(diǎn)；
[0030]3、捕食線蟲真菌的分生孢子較營(yíng)養(yǎng)菌絲的抗逆性強(qiáng)，在常溫或低溫條件下的存活時(shí)間更長(zhǎng)，能夠有效延長(zhǎng)生防制劑的有效期和貨架期。同時(shí)，本發(fā)明為進(jìn)一步研究捕食線蟲真菌產(chǎn)生分生孢子的分子機(jī)制奠定了良好的基礎(chǔ)。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
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[0031]圖1為不同濃度的NaNO3對(duì)寡孢節(jié)叢孢產(chǎn)生分生孢子的促進(jìn)作用。
[0032]圖2為0.2% NaNO3對(duì)捕食線蟲真菌寡孢節(jié)叢孢、堅(jiān)粘孢單頂孢和環(huán)捕節(jié)叢孢產(chǎn)生分生孢子的促進(jìn)作用。圖中:a為CMA培養(yǎng)基；b為CMA+0.2% NaNO3培養(yǎng)基。

【具體實(shí)施方式】
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[0033]以下是本發(fā)明的實(shí)施例，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于此。
[0034]實(shí)施例一:利用CMA+NaN03培養(yǎng)基培養(yǎng)寡孢節(jié)叢孢產(chǎn)生分生孢子
[0035]按照
【發(fā)明內(nèi)容】
部分所描述的方法配制CMA，分別添加不同濃度的NaNO3, NaNO3的濃度分別為0.1%或0.2%或0.4%或0.6%或0.8%，然后分裝到250mL三角瓶中(40mL/瓶)，用紗布和牛皮紙封口，121°C滅菌20分鐘。滅菌的培養(yǎng)基室溫放置2天，讓殘留在瓶壁和培養(yǎng)基表面的水分盡量散失。無(wú)菌條件下，用打孔器取相同大小的寡孢節(jié)叢孢菌塊接種于上述CMA和CMA+NaN03培養(yǎng)基上，28°C恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)14天，培養(yǎng)分生孢子。
[0036]按照
【發(fā)明內(nèi)容】
部分所描述分生孢子的收集方法，分別收集CMA和CMA+NaN03培養(yǎng)基上寡孢節(jié)叢孢的孢子，得到的孢子懸液濃縮至等體積，然后用血球計(jì)數(shù)板觀察計(jì)數(shù)，計(jì)算孢子的濃度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在CMA培養(yǎng)基中添加0.1 %或0.2%的NaNO3能夠有效促進(jìn)寡孢節(jié)叢孢產(chǎn)生分生孢子，0.2%的NaNO3的促進(jìn)作用最好，而NaNO3的濃度高于0.2%將會(huì)明顯抑制分生孢子的形成(附圖1)。同時(shí)，與不添加NaNO3的CMA培養(yǎng)基中寡孢節(jié)叢孢的產(chǎn)孢量相比，寡孢節(jié)叢孢在CMA+0.2% NaNO3培養(yǎng)基上的產(chǎn)孢量增加了 4.2倍(附圖2)。
[0037]實(shí)施例二:利用CMA+NaN03培養(yǎng)基培養(yǎng)環(huán)捕節(jié)叢孢產(chǎn)生分生孢子
[0038]按照
【發(fā)明內(nèi)容】
部分所描述的方法分別配制CMA，添加0.2% NaNO3,然后分裝到250mL三角瓶中(40mL/瓶)，用紗布和牛皮紙封口，121°C滅菌20分鐘。滅菌的培養(yǎng)基室溫放置2天，讓殘留在瓶壁和培養(yǎng)基表面的水分盡量散失。無(wú)菌條件下，用打孔器取相同大小的環(huán)捕節(jié)叢孢菌塊接種于上述CMA和CMA+0.2% NaNO3培養(yǎng)基上，28°C恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)14天，培養(yǎng)分生孢子。
[0039]按照
【發(fā)明內(nèi)容】
部分所描述分生孢子的收集方法，分別收集CMA和CMA+0.2% NaNO3培養(yǎng)基上環(huán)捕節(jié)叢孢的孢子，得到的孢子懸液濃縮至等體積，然后用血球計(jì)數(shù)板觀察計(jì)數(shù)，計(jì)算孢子的濃度。與CMA培養(yǎng)基上收集得到的孢子數(shù)目相比，CMA+0.2% NaNO3培養(yǎng)基上收集得到的環(huán)捕節(jié)叢孢的分生孢子數(shù)量增加了 2.36倍(附圖2)。
[0040]實(shí)施例三:利用CMA+NaN03培養(yǎng)基培養(yǎng)堅(jiān)粘孢單頂孢產(chǎn)生分生孢子
[0041]按照
【發(fā)明內(nèi)容】
部分所描述的方法分別配制CMA，添加0.2% NaNO3，然后分裝到250mL三角瓶中(40mL/瓶)，用紗布和牛皮紙封口，121°C滅菌20分鐘。滅菌的培養(yǎng)基室溫放置2天，讓殘留在瓶壁和培養(yǎng)基表面的水分盡量散失。無(wú)菌條件下，用打孔器取相同大小的堅(jiān)粘孢單頂孢菌塊接種于上述CMA和CMA+0.2% NaNO3培養(yǎng)基上，28°C恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)14天，培養(yǎng)分生孢子。
[0042]按照
【發(fā)明內(nèi)容】
部分所描述分生孢子的收集方法，分別收集CMA和CMA+0.2% NaNO3培養(yǎng)基上環(huán)捕節(jié)叢孢的孢子，得到的孢子懸液濃縮至等體積，然后用血球計(jì)數(shù)板觀察計(jì)數(shù)，計(jì)算孢子的濃度。與CMA培養(yǎng)基上收集得到的孢子數(shù)目相比，CMA+0.2% NaNO3培養(yǎng)基上收集得到的堅(jiān)粘孢單頂孢的分生孢子數(shù)量增加了 3.21倍(附圖2)。
【權(quán)利要求】
1.一種利用硝酸鈉促進(jìn)捕食線蟲真菌產(chǎn)生分生孢子的方法，包括培養(yǎng)基配制、捕食線蟲真菌培養(yǎng)、分生孢子收集和計(jì)數(shù)等步驟；其特征在于:在玉米粉瓊脂0嫩培養(yǎng)基中添加濃度為0.2%的似勵(lì)3。
【文檔編號(hào)】C12N3/00GK104357373SQ201410663299
【公開(kāi)日】2015年2月18日 申請(qǐng)日期:2014年11月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月19日
【發(fā)明者】楊金奎, 蘇浩, 朱威, 周靜, 馮會(huì)華, 張克勤 申請(qǐng)人:云南大學(xué)