一種西尼羅病毒的微流體基因芯片檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種快速、靈敏的西尼羅病毒微流體基因芯片檢測方法。本發(fā)明的檢測方法整合了逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)RT-PCR和微陣列Microarray這兩種強(qiáng)大的分子生物學(xué)技術(shù)，將RT-PCR與微陣列芯片雜交反應(yīng)艙整合到一張芯片上，PCR雜交的探針直接固定在微陣列中的雜交艙中。本發(fā)明的檢測方法包括如下步驟：樣本處理，RNA核酸提取，RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)，雜交，清洗，結(jié)果判定。通過本發(fā)明可大幅度提高出入境口岸一線檢驗(yàn)檢疫人員的檢測效率，既可減少工作量、又可最大限度地解決傳統(tǒng)檢測方法可能存在的陽性漏檢問題，從而最大限度地防止重大蟲媒傳染病的輸入。
【專利說明】一種西尼羅病毒的微流體基因芯片檢測方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及體外診斷試劑【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種西尼羅病毒的快速微流體基因 芯片檢測方法。
[0002] 背景介紹
[0003] 隨著全球經(jīng)濟(jì)一體化和貿(mào)易自由化，國外的醫(yī)學(xué)媒介生物通過先進(jìn)的交通工具和 國際貿(mào)易，可以迅速把傳染病從一個國家或地區(qū)傳向全球，造成國際間傳播。近年來，新發(fā) 病毒性傳染病在世界各國頻頻暴發(fā)流行，對人類健康帶來嚴(yán)重威脅，給社會造成巨大經(jīng)濟(jì) 損失。這些新發(fā)病毒性傳染病的頻發(fā)給我們敲響了警鐘，加強(qiáng)對其的研宄和監(jiān)測以及早預(yù) 防控制是至關(guān)重要的。
[0004] 蟲媒病毒是一類通過吸血節(jié)肢動物叮咬敏感脊椎動物宿主而在人畜之間進(jìn)行傳 播的病毒，其中100多種可以導(dǎo)致人畜疾病，嚴(yán)重者會導(dǎo)致死亡。西尼羅病毒引起西尼羅 熱，是一種人獸共患病。西尼羅病毒屬于黃病毒科黃熱病毒屬。有囊膜，單鏈線形核糖核 酸，RNA為正鏈，約有10000?11000個堿基對，具有感染性。電鏡下該病毒呈中等大小，直 徑21nm?60nm，圓形顆粒。以鳥類為主要的貯存宿主，馬、蚊子和人都可以是它的傳染宿 主，人的發(fā)病時間較鳥類感染時間晚33天左右。蚊蟲孳生的季節(jié)是本病的高發(fā)季節(jié)，西尼 羅河病毒感染發(fā)生于6?11月，8月下旬為發(fā)病高峰。所有未接觸過西尼羅河病毒的人都 是易感者，老年人和免疫力弱者易發(fā)病、病死率高。近年來西尼羅病毒病出現(xiàn)在歐洲和北美 的溫帶區(qū)域，對人和動物的健康構(gòu)成了威脅。這種病嚴(yán)重的危害是使人和馬患上致命的腦 炎，使鳥，雞等死亡。2012年8月15日美國爆發(fā)西尼羅病毒，41人確認(rèn)死亡。
[0005] 中國到目前為止還沒有發(fā)現(xiàn)西尼羅病毒感染病例，也沒有在動物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)西尼羅 病毒。但中國有很多地方夏天潮濕、炎熱，一些地方洪水泛濫，具備蚊蟲大量滋生的條件；另 外隨著我國商貿(mào)、旅游業(yè)的快速發(fā)展，境內(nèi)外人員交往日益密切，以及動物的進(jìn)口等影響， 西尼羅病毒輸入的危險性日益增高。因此，盡快建立快速簡便、特異敏感的檢測方法對防 范西尼羅病毒的輸入具有重要意義。
[0006] 基因芯片采用微加工和微電子技術(shù)將大量的人工設(shè)計(jì)好的基因片段有序地、高密 度地排列在纖維膜等載體上?；蛐酒梢酝瑫r固定大量的探針分子，可以在一次實(shí)驗(yàn)中 檢出多種病原體；同時檢測的靈敏度、特異性和快速便捷性也很高，因而在病原體分析檢測 中有很好的應(yīng)用前景。
[0007] 本發(fā)明整合了逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)RT-PCR和微陣列Microarray這兩種強(qiáng)大的 分子生物學(xué)技術(shù)，將RT-PCR與微陣列芯片雜交反應(yīng)艙整合到一張芯片上，PCR雜交的探針 直接固定在微陣列中的雜交艙中。操作簡單，節(jié)省時間，靈敏度高，特異性好。為西尼羅病 毒的檢測提供了快速，簡便，靈敏的微流體基因芯片檢測方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種快速、靈敏的西尼羅病毒微流體基因芯片 檢測方法。通過本發(fā)明可大幅度提高出入境口岸一線檢驗(yàn)檢疫人員的檢測效率，既可減少 工作量、又可最大限度地解決傳統(tǒng)檢測方法可能存在的陽性漏檢問題，從而最大限度地防 止外來輸入性傳染病的發(fā)生。
[0009] 本發(fā)明提供的西尼羅病毒的微流體基因芯片檢測方法，包括如下步驟：
[0010] (1)樣本混勻處理；
[0011] ⑵RNA核酸提??；
[0012] (3) RT-PCR 擴(kuò)增反應(yīng)：
[0013] a. RT-PCR反應(yīng)體系包括：RT-PCR反應(yīng)液，特異性正、反向引物混合液，逆轉(zhuǎn)錄酶/ DNA聚合酶，DEPC水，RT-PCR質(zhì)控品，樣本RNA核酸；
[0014] b.將RT-PCR反應(yīng)液加入已固化特異性探針的芯片內(nèi)，將芯片放入反應(yīng)室內(nèi)進(jìn)行 擴(kuò)增反應(yīng)；
[0015] 所述的特異性引物和探針是根據(jù)Envelope基因特異性引物擴(kuò)增區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)，能夠 區(qū)別其他病毒株，特異性引物和探針為：
[0016] WNV-F:5-CAGACCACGCTACGGCG-3(SEQ ID NO 1)
[0017] WNV-R:5-CTAGGGCCGCGTGGG-3(SEQ ID NO 2)
[0018] WNV-Probe:5-TCTGCGGAGAGTGCAGTCTGCGAT-3(SEQ ID NO 3)
[0019] (4)雜交：RT-PCR擴(kuò)增完后，加入雜交反應(yīng)液，使雜交液和擴(kuò)增液都進(jìn)入到雜交艙 內(nèi)進(jìn)行雜交反應(yīng)；
[0020] (5)清洗：雜交后的芯片用洗液沖洗，直接用熒光掃描儀檢測；
[0021] (6)結(jié)果判定：根據(jù)雜交結(jié)果，判定感染情況。
[0022] 步驟（2)中所述的RNA提取可使用病毒RNA提取試劑盒提取。取HOul血液樣本， 裂解后，按照試劑盒說明書中的提取步驟提取RNA。
[0023] 步驟（3)中所述的RT-PCR反應(yīng)體系為：2X RT-PCR反應(yīng)液12. 5ul，引物混合液 2.5111，1411111%5042.5111，？0?6四(16!120 1111，逆轉(zhuǎn)錄酶/1)嫩聚合酶1111，？0?質(zhì)控2111，樣 本 3. 5ul。
[0024] 步驟（3)中所述的RT-PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件是：50°C逆轉(zhuǎn)錄20min ;95°C預(yù)變性 2!1^11;95°0變性1〇8,60°0退火4〇8,72°0延伸5〇8;11個循環(huán)，每個循環(huán)退火溫度降低1°〇， 直至退火溫度變成50°0;95°0變性158,56°0退火4〇8,72°0延伸5〇8,40個循環(huán)。
[0025] 步驟（4)中所述的雜交反應(yīng)條件是：95°C預(yù)變性3min ;58°C雜交30min。
[0026] 步驟（5)中所述的清洗條件是3000rpm，離心2min。
[0027] 步驟（3)所述的PCR擴(kuò)增與步驟（4)所述的雜交在芯片儀上完成。
[0028] 本發(fā)明與現(xiàn)有檢測方法相比，將RT-PCR的擴(kuò)增過程和分子雜交檢測過程濃縮到 一張基因芯片上檢測，整個檢測在3個小時內(nèi)完成，大大縮減了檢測的時間和復(fù)雜性，檢測 設(shè)備簡單也易于攜帶。本發(fā)明的檢測方法簡單快速，靈敏度高，特異性好，為流行性乙型腦 炎病毒的檢測提供了快速，簡便，靈敏的方法。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0029] 圖1實(shí)施例1西尼羅病毒陽性樣本微流體基因芯片檢測結(jié)果。
[0030] 本實(shí)施例中測檢測結(jié)果顯示本樣本在西尼羅病毒屬和西尼羅病毒毒株均顯示為 陽性。
[0031] 圖2實(shí)施例1西尼羅病毒陰性對照樣本微流體基因芯片檢測結(jié)果。

【具體實(shí)施方式】
[0032] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人 員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定 的范圍。
[0033] 實(shí)施例1西尼羅病毒樣本微流體基因芯片檢測
[0034] -、實(shí)驗(yàn)步驟
[0035] 1.樣本準(zhǔn)備
[0036] 本實(shí)施例中，陽性樣本為西尼羅熱病人血清，陰性對照樣本為健康人的血清。
[0037] 2. RNA 的提取
[0038] 使用病毒RNA提取試劑盒（離心柱型）提取樣本RNA。取HOul樣本，按照試劑盒 說明書中的操作步驟提取RNA，最后用60ul洗脫液洗脫RNA。
[0039] 3.靶基因的擴(kuò)增 [0040] 3.1引物和探針的設(shè)計(jì)
[0041] 根據(jù)Envelope基因設(shè)計(jì)特異性引物和探針為：
[0042] WNV-F:5-CAGACCACGCTACGGCG-3(SEQ ID NO 1)
[0043] WNV-R:5-CTAGGGCCGCGTGGG-3(SEQ ID NO 2)
[0044] WNV-Probe:5-TCTGCGGAGAGTGCAGTCTGCGAT-3(SEQ ID NO 3)
[0045] 特異性探針按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案，分別點(diǎn)入芯片上各自孔中。
[0046] 3. 2RT-PCR 反應(yīng)平臺
[0047] 在溫度控制儀上進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增與雜交反應(yīng)。為防止引物間的互相干擾，RT-PCR 反應(yīng)同時在兩個反應(yīng)室中進(jìn)行，兩個反應(yīng)室都可以聯(lián)通到雜交室，RT-PCR后的擴(kuò)增液可以 通過注射推送方式使其流入雜交室進(jìn)行雜交反應(yīng)。
[0048] RT-PCR反應(yīng)體系為：2X RT-PCR反應(yīng)液12. 5ul，引物混合液2. 5ul，14mM MgS042.5ul，PCR Grade H20 lul,逆轉(zhuǎn)錄酶/DNA 聚合酶 lul，PCR 質(zhì)控 2ul,樣本 3.5ul。
[0049] 反應(yīng)條件為：50°C逆轉(zhuǎn)錄20min ;95°C預(yù)變性2min ;95°C變性10s，60°C退火40s， 72°C延伸50s ; 11個循環(huán)，每個循環(huán)退火溫度降低1°C，直至退火溫度變成50°C。95°C變性 15s，56°C 退火 40s，72°C延伸 50s，40 個循環(huán)。
[0050] 4.雜交反應(yīng)
[0051] 分別向兩個RT-PCR反應(yīng)室中加入14. 5ul雜交液，使雜交液和擴(kuò)增液都進(jìn)入到雜 交反應(yīng)艙內(nèi)。雜交反應(yīng)條件是95°C預(yù)變性3min，58°C雜交30min。雜交后的芯片用洗液離 心（3000rpm，2min)洗絳，在芯片掃描儀上進(jìn)行信號檢測。
[0052] 二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0053] 從圖1和圖2的檢測信號圖來看，RT-PCR質(zhì)控點(diǎn)信號正常，陰性對照點(diǎn)信號正常， 雜交對照點(diǎn)信號正常，說明從RT-PCR到雜交的整個反應(yīng)過程均正常，從而說明整個反應(yīng)有 效。根據(jù)每個點(diǎn)的熒光信號值（詳見表1和表2)，對照整個反應(yīng)艙的探針設(shè)計(jì)，陽性樣本在 西尼羅病毒探針位置有明顯的雜交信號，而在陰性對照樣本的相應(yīng)西尼羅病毒探針位置處 未發(fā)現(xiàn)有雜交信號。通過軟件分析，判定樣本為西尼羅病毒感染陽性，而陰性對照樣本判定 為陰性。跟預(yù)期的樣本感染情況一致。這表明本發(fā)明的微流體基因芯片的檢測性能良好， 能準(zhǔn)確地區(qū)分陰性及陽性樣本，特異性良好，沒有出現(xiàn)錯判現(xiàn)象。
[0054] 表1陽性樣本的檢測信號數(shù)值
[0055]

【權(quán)利要求】
1. 一種西尼羅病毒的微流體基因芯片檢測方法，其特征在于：包括如下步驟： (1) 樣本混勻處理； (2) RNA核酸提??； (3) RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)： a. RT-PCR反應(yīng)體系包括：RT-PCR反應(yīng)液，特異性正、反向引物混合液，逆轉(zhuǎn)錄酶/DNA 聚合酶，DEPC水，RT-PCR質(zhì)控品，樣本RNA核酸； b. 將RT-PCR反應(yīng)液加入已固化特異性探針的芯片內(nèi)，將芯片放入反應(yīng)室內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)增 反應(yīng)； 所述的特異性引物和探針是根據(jù)Envelope基因特異性引物擴(kuò)增區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)，能夠區(qū)別 其他病毒株，特異性引物和探針為： WNV-F:5-CAGACCACGCTACGGCG-3(SEQ ID NO 1) WNV-R:5-CTAGGGCCGCGTGGG-3(SEQ ID NO 2) WNV-Probe:5-TCTGCGGAGAGTGCAGTCTGCGAT-3(SEQ ID NO 3) (4) 雜交：RT-PCR擴(kuò)增完后，加入雜交反應(yīng)液，使雜交液和擴(kuò)增液都進(jìn)入到雜交艙內(nèi)進(jìn) 行雜交反應(yīng)； (5) 清洗：雜交后的芯片用洗液沖洗，直接用熒光掃描儀檢測； (6) 結(jié)果判定：根據(jù)雜交結(jié)果，判定感染情況。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的西尼羅病毒的微流體基因芯片檢測方法，其特征在于：步驟 (2) 中所述的RNA提取可使用病毒RNA提取試劑盒提取；所述的RNA提取步驟為：取140ul 血液樣本，裂解后，按照試劑盒說明書中的提取步驟提取RNA。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的西尼羅病毒的微流體基因芯片檢測方法，其特征在于：步 驟⑶中所述的PCR反應(yīng)體系為：2X RT-PCR反應(yīng)液12. 5ul，引物混合液2. 5ul，14mM MgS042.5ul，PCR Grade H20 lul,逆轉(zhuǎn)錄酶/DNA 聚合酶 lul，PCR Control 2ul, Sample 3. 5ul〇
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的西尼羅病毒的微流體基因芯片檢測方法，其特征在于：步驟 (3) 中所述的RT-PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件是：50°C逆轉(zhuǎn)錄20min ;95°C預(yù)變性2min ;95°C變性 1〇8,6〇1：退火4〇8,721：延伸5〇8;11個循環(huán)，每個循環(huán)退火溫度降低11：，直至退火溫度變 成50°〇;951：變性158,561：退火408,721：延伸508,40個循環(huán)。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的西尼羅病毒的微流體基因芯片檢測方法，其特征在于：步驟 (4) 中所述的雜交反應(yīng)條件是：95°C預(yù)變性3min ;58°C雜交30min。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的西尼羅病毒的微流體基因芯片檢測方法，其特征在于：步驟 (5) 中所述的清洗條件是3000rpm，離心2min。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的行性乙型腦炎病的微流體基因芯片檢測方法，其特征在于： 步驟（3)所述的PCR擴(kuò)增與步驟（4)所述的雜交在芯片儀上完成。
【文檔編號】C12R1/93GK104498618SQ201410653174
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2014年11月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月17日
【發(fā)明者】田楨干, 王傳現(xiàn), 周啟明, 趙百慧, 李深偉, 章琪, 張子龍 申請人:中華人民共和國上海出入境檢驗(yàn)檢疫局