玉米褪綠矮縮病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)引物組、檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種玉米褪綠矮縮病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)引物組、檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法，特點(diǎn)LAMP的兩對(duì)引物如下MCDV-F3、MCDV--B3、MCDV-FIP、MCDV-BIP，其RT-LAMP反應(yīng)體系如下：2μLFIP溶液，2μLBIP溶液，0.25μLF3溶液，0.25μLB3溶液，12.5μL2×反應(yīng)緩沖液，1μL Bst DNA聚合酶和AMV逆轉(zhuǎn)錄聚合酶混合液，1μL鈣黃綠素，2.5μLRNA模板，無RNA酶的水補(bǔ)至25μL，檢測(cè)方法包括總RNA的提?。籖T-LAMP引物的設(shè)計(jì)和合成；配制RT-LAMP反應(yīng)體系；RT-LAMP目視檢測(cè)，優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高，特異性強(qiáng)且簡(jiǎn)便快速。
【專利說明】玉米褪綠矮縮病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)引物組、檢測(cè)試 劑盒及檢測(cè)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及玉米褪綠矮縮病毒的檢測(cè)技術(shù)，尤其是涉及玉米褪綠矮縮病毒的環(huán)介 導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)引物組、檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 玉米裡綠矮縮病毒（Maize chlorotic dwarf virus，MCDV)屬伴生病毒科水稻矮 化病毒屬（Waikavirus)，主要寄主是玉米、高粱等禾本科植物，其引發(fā)的病害可導(dǎo)致玉米產(chǎn) 量下降、品質(zhì)降低。1968年美國首次報(bào)道該病毒，該病毒主要分布于美國的墨西哥州、俄 亥俄州、印第安納州及密蘇里州等地區(qū)，在我國還未有發(fā)生的報(bào)道。該病毒不能種傳，僅能 通過介體昆蟲小禾葉蟬、索諾拉葉蟬傳播，若蟲和成蟲帶毒時(shí)間達(dá)48小時(shí)，由于在我國其 自然寄主有大量種植，近些年又從美國大量進(jìn)口玉米，因此該病毒傳入我國的可能性較大， 2007年該病毒被列為我國進(jìn)境植物檢疫性有害生物。目前，檢測(cè)MCDV主要方法有：侵染力 測(cè)定法、血清學(xué)方法、電子顯微鏡計(jì)數(shù)等，這些方法的弊端在于耗時(shí)長，依賴昂貴的檢測(cè)設(shè) 備。
[0003] 近年來開發(fā)的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（loop-mediated isothermal amplification， LAMP)是一種新的核酸擴(kuò)增技術(shù)，該技術(shù)依賴于能夠識(shí)別靶序列上6個(gè)特異區(qū)域的引物和 一個(gè)具有鏈置換特性的DNA聚合酶（Bst DNA polymerase)，在等溫條件下高效擴(kuò)增靶基因， 靈敏度和特異性高。該方法已廣泛應(yīng)用于病毒、類病毒、細(xì)菌、真菌及轉(zhuǎn)基因的檢測(cè)。而迄 今尚無應(yīng)用該技術(shù)檢測(cè)玉米褪綠矮縮病毒的報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種具有靈敏度高，特異性強(qiáng)且簡(jiǎn)便快速的玉米褪 綠矮縮病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)引物組、檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法。
[0004] 本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為： 1、一種玉米褪綠矮縮病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)引物組，LAMP的兩對(duì)引物序列如 下： 外側(cè)上游引物 MCDV-F3 :CCCGTTCTATTGCAGTCAA ; 外側(cè)下游引物 MCDV-B3 :GTTTCTCCTGTCAATGTTTCC ; 內(nèi)側(cè)上游引物 MCDV-FIP ：GGTTCGGAAATGGAGCAGGGCCGACGGAACCCGCAGCGCC ； 內(nèi)側(cè)下游引物 MCDV-BIP ：GCCCAGGTCCCTGGTAGCACACCTTCAGACCTGAACACAAAC〇
[0005] 2、一種玉米褪綠矮縮病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒，該檢測(cè)試劑盒包括2X 反應(yīng)緩沖液，由Bst DNA聚合酶和AMV逆轉(zhuǎn)錄聚合酶組成的聚合酶混合液，濃度均為20 μ mol/L的內(nèi)側(cè)上游引物溶液、內(nèi)側(cè)下游引物溶液、外側(cè)上游引物溶液和外側(cè)下游引物溶 液，鈣黃綠素?zé)晒馊玖?，所述?X反應(yīng)緩沖液、所述的聚合酶混合液、所述的內(nèi)側(cè)上游引 物溶液、所述的內(nèi)側(cè)下游引物溶液、所述的外側(cè)上游引物溶液、所述的外側(cè)下游引物溶液、 所述的鈣黃綠素?zé)晒馊玖象w積比為12. 5 :1 :2 :2 :0. 25 :0. 25 :1，引物序列為外側(cè)上游引 物 MCDV-F3 :CCCGTTCTATTGCAGTCAA ;外側(cè)下游引物 MCDV-B3 :GTTTCTCCTGTCAATGTTTCC ;內(nèi) 側(cè)上游引物 MCDV-FIP : GGTTCGGAAATGGAGCAGGGCCGACGGAACCCGCAGCGCC ;內(nèi)側(cè)下游引物 MCDV-BIP ：GCCCAGGTCCCTGGTAGCACACCTTCAGACCTGAACACAAAC〇
[0006] 所述的反應(yīng)緩沖液的配方如下：40mM的pH8. 8的Tris-HCl、20mM的KCl、16mM的 MgS04、20mM 的（NH4)2 S04、0. 2% 的 Tween20、I. 6 M 的甜菜堿和每種 2. 8mM 的 dNTPs，所述的 聚合酶混合液中fei DNA聚合酶和AMV逆轉(zhuǎn)錄聚合酶的濃度均為8 U/ μ L。
[0007] 3、一種玉米褪綠矮縮病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法，包括以下步驟： (1) 總RNA的提取 將玉米待測(cè)樣本使用RNeasy Plant Mini Kit進(jìn)行植物總RNA提取，具體操作見試劑 盒說明書； (2) RT-LAMP引物的設(shè)計(jì)和合成 從GenBank調(diào)出玉米褪綠矮縮病毒外殼蛋白基因序列，利用DNAMAN 6. 0. 40軟件進(jìn)行 比對(duì)分析，找出MCDV外殼蛋白基因序列的保守區(qū)，利用LAMP引物設(shè)計(jì)軟件PrimerExpIorer V4設(shè)計(jì)了特異性引物，其序列如下 ： 外側(cè)上游引物 MCDV-F3 :CCCGTTCTATTGCAGTCAA ; 外側(cè)下游引物 MCDV-B3 :GTTTCTCCTGTCAATGTTTCC ; 內(nèi)側(cè)上游引物 MCDV-FIP ：GGTTCGGAAATGGAGCAGGGCCGACGGAACCCGCAGCGCC ； 內(nèi)側(cè)下游引物 MCDV-BIP ：GCCCAGGTCCCTGGTAGCACACCTTCAGACCTGAACACAAAC ； (3) 配制RT-LAMP反應(yīng)體系 濃度為20 ymol/L內(nèi)側(cè)上游引物溶液和內(nèi)側(cè)下游引物溶液各2 yL，濃度為20 μπιο?/ L外側(cè)上游引物溶液和外側(cè)下游引物溶液各0. 25 μ L，12. 5 μ L 2Χ反應(yīng)緩沖液，由Bst DNA聚合酶和AMV逆轉(zhuǎn)錄聚合酶組成的聚合酶混合液I. 0 μ L，鈣黃綠素?zé)晒馊玖螴. 0 μ?， 樣品總RNA2. 5 yL，無 RNase的水補(bǔ)至25 yL; (4) MCDV的RT-LAMP目視檢測(cè) 將上述反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)條件為：60°C 60 min，95°C 2 min;RT-LAMP擴(kuò)增 結(jié)束后，在正常光照條件下，通過裸眼觀察反應(yīng)管中顏色的變化來準(zhǔn)確判定結(jié)果，若擴(kuò)增產(chǎn) 物呈黃綠色，則樣品感染玉米褪綠矮縮病毒。
[0008] 所述的反應(yīng)緩沖液的配方如下：40mM的pH8. 8的Tris-HCl、20mM的KCl、16mM的 MgS04、20mM 的（NH4) 2 S04、0. 2% 的 Tween20、L 6 M 的甜菜堿和每種 2. 8mM 的 dNTPs，所述的 聚合酶混合液中fei DNA聚合酶和AMV逆轉(zhuǎn)錄聚合酶的濃度均為8 U/ μ L。
[0009] 原理說明：鈣黃綠素是一種螯合劑，反應(yīng)前與試劑中的錳離子結(jié)合處于淬滅狀態(tài)， LAMP擴(kuò)增反應(yīng)的副產(chǎn)物焦磷酸離子與錳離子結(jié)合釋放鈣黃綠素，淬滅狀態(tài)解除，發(fā)出黃綠 色熒光，通過觀察熒光的有無可判斷是否有擴(kuò)增。
[0010] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：本發(fā)明首次公開了玉米褪綠矮縮病毒的環(huán) 介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)引物組、檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法，根據(jù)玉米褪綠矮縮病毒（MCDV)外殼蛋 白基因序列的保守區(qū)設(shè)計(jì)RT-LAMP特異性引物，該引物組具有特異性強(qiáng)，靈敏度高達(dá)200 fg，比普通RT-PCR高出10倍，而反應(yīng)時(shí)間明顯縮短，整個(gè)檢測(cè)1小時(shí)內(nèi)可完成，提高了擴(kuò)增 效率，這與引物本身的質(zhì)量(如長度、GC含量)、退火溫度、反應(yīng)體系中金屬離子的濃度、酶的 活性等因素直接有關(guān)。通過在反應(yīng)體系中預(yù)先加入螯合劑--I丐黃綠素，可實(shí)現(xiàn)肉眼觀察 判定結(jié)果，整個(gè)檢測(cè)過程不需要復(fù)雜儀器設(shè)備，只需維持恒溫的水浴鍋或金屬浴就可完成， 克服了以往檢測(cè)方法需要依賴昂貴儀器、檢測(cè)周期長等不足，尤其適合設(shè)備資源配置簡(jiǎn)單 的口岸實(shí)驗(yàn)室開展現(xiàn)場(chǎng)快速篩查，具有較強(qiáng)的推廣價(jià)值。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0011] 圖1為RT-LAMP方法檢測(cè)玉米褪綠矮縮病毒的反應(yīng)時(shí)間與濁度的關(guān)系圖； 圖2為玉米褪綠矮縮病毒的RT-LAMP特異性試驗(yàn)結(jié)果； 圖3為玉米褪綠矮縮病毒的RT-LAMP靈敏度試驗(yàn)結(jié)果； 圖4為玉米褪綠矮縮病毒的RT-PCR相對(duì)靈敏度試驗(yàn)結(jié)果，注：M: DL2000 ; 1-6 : 2 ng,200 pg，20 pg，，2 pg，200 fg，20 fg 總 RNA;7:水。

【具體實(shí)施方式】
[0012] 以下結(jié)合附圖實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。
[0013] 具體實(shí)施例1 玉米褪綠矮縮病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)引物組，包括LAMP的兩對(duì)引物序列： 外側(cè)上游引物 MCDV-F3 :CCCGTTCTATTGCAGTCAA ; 外側(cè)下游引物 MCDV-B3 :GTTTCTCCTGTCAATGTTTCC ; 內(nèi)側(cè)上游引物 MCDV-FIP ：GGTTCGGAAATGGAGCAGGGCCGACGGAACCCGCAGCGCC ； 內(nèi)側(cè)下游引物 MCDV-BIP ：GCCCAGGTCCCTGGTAGCACACCTTCAGACCTGAACACAAAC〇
[0014] 具體實(shí)施例2 一種玉米褪綠矮縮病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒，該檢測(cè)試劑盒包括2X反應(yīng)緩 沖液（配方如下：40mM 的 ρΗ8·8 的 Tris-HCl、20mM 的 KCl、16mM 的 MgS04、20mM 的（NH4)2 S04、 0. 2%的Tween20、I. 6 M的甜菜堿和每種2. 8mM的dNTPs)，由Bst DNA聚合酶和AMV逆轉(zhuǎn)錄 聚合酶組成的聚合酶混合液(聚合酶混合液中fei DNA聚合酶和AMV逆轉(zhuǎn)錄聚合酶的濃度 均為8 U/μ L)，濃度為20 μ mol/L的內(nèi)側(cè)上游引物溶液、濃度為20 μ mol/L的內(nèi)側(cè)下游 引物溶液、濃度為20 μ mol/L的外側(cè)上游引物溶液和濃度為20 μ mol/L的外側(cè)下游引物 溶液，鈣黃綠素?zé)晒馊玖希?X反應(yīng)緩沖液、聚合酶混合液、內(nèi)側(cè)上游引物溶液、內(nèi)側(cè)下游引 物溶液、外側(cè)上游引物溶液、外側(cè)下游引物溶液、鈣黃綠素?zé)晒馊玖象w積比為12. 5 :1 :2 :2 : 0. 25 :0. 25 :1，引物序列為外側(cè)上游引物MCDV-F3 :CCCGTTCTATTGCAGTCAA ;外側(cè)下游引物 MCDV-B3 :GTTTCTCCTGTCAATGITTCC ;內(nèi)側(cè)上游引物 MCDV-FIP : GGTTCGGAAATGGAGCAGGGCCGA CGGAACCCGCAGCGCC ;內(nèi)側(cè)下游引物 MCDV-BIP :GCCCAGGTCCCTGGTAGCACACCTTCAGACCTGAACAC AAAC。
[0015] 具體實(shí)施例3 玉米褪綠矮縮病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法的建立 1、實(shí)驗(yàn)材料 (1) 樣品來源玉米褪綠矮縮病毒（Maize chlorotic dwarf virus,MCDV)陽性質(zhì)控物 購自德國DSMZ公司，樣品狀態(tài)為新鮮葉片經(jīng)液氮處理，磨成粉末狀； (2) 分子生物學(xué)試劑 RNeasy Plant Mini Kit 購自 Qiagen 公司，TaKaRa One Step RNA PCR Kit (AMV)購自大連寶生物公司，鈣黃綠素?zé)晒馊玖稀NA Amplification Kit購 自EIKEN CHEMICAL CO.，LTD. ;RT-LAMP引物及RT-PCR引物由英濰捷基(上海）貿(mào)易有限 公司合成； (3) 主要儀器 LA-320C 實(shí)時(shí)池度儀（Loopamp? Realtime Turbidimeter LA-320C)。
[0016] 2、檢測(cè)方法 (1) 總RNA的提取 分別對(duì)陽性質(zhì)控樣品進(jìn)行植物總RNA提取，具體操作見試劑盒說明書。用核酸蛋白分 析儀測(cè)OD26tl及OD28tl，計(jì)算核酸的濃度和純度； (2) RT-LAMP引物的設(shè)計(jì)和合成 從GenBank調(diào)出玉米褪綠矮縮病毒外殼蛋白基因序列，利用DNAMAN 6. 0. 40軟件進(jìn)行 比對(duì)分析，找出MCDV外殼蛋白基因序列的保守區(qū)，利用LAMP引物設(shè)計(jì)軟件PrimerExpIorer V4設(shè)計(jì)了特異性引物。如表1所示， 表1玉米褪綠矮縮病毒RT-LAMP檢測(cè)引物

【權(quán)利要求】
1. 一種玉米褪綠矮縮病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)引物組，其特征在于LAMP的兩對(duì)引 物序列如下： 外側(cè)上游引物 MCDV-F3 :CCCGITCTAITGCAGTCAA; 外側(cè)下游引物 MCDV-B3 :GTITCTCCTGTCAATGITTCC ; 內(nèi)側(cè)上游引物 MCDV-FIP ：GGTTCGGAAATGGAGCAGGGCCGACGGAACCCGCAGCGCC ； 內(nèi)側(cè)下游引物 MCDV-BIP ：GCCCAGGTCCCTGGTAGCACACCTTCAGACCTGAACACAAAC〇
2. -種玉米褪綠矮縮病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒，其特征在于：該檢測(cè)試劑盒 包括2 X反應(yīng)緩沖液，由Bst DNA聚合酶和AMV逆轉(zhuǎn)錄聚合酶組成的聚合酶混合液，濃度 均為20 ymol/L的內(nèi)側(cè)上游引物溶液、內(nèi)側(cè)下游引物溶液、外側(cè)上游引物溶液和外側(cè)下游 引物溶液，鈣黃綠素?zé)晒馊玖?，所述?X反應(yīng)緩沖液、所述的聚合酶混合液、所述的內(nèi)側(cè) 上游引物溶液、所述的內(nèi)側(cè)下游引物溶液、所述的外側(cè)上游引物溶液、所述的外側(cè)下游引物 溶液、所述的鈣黃綠素?zé)晒馊玖象w積比為12. 5 :1 :2 :2 :0. 25 :0. 25 :1，引物序列為外側(cè)上 游引物 MCDV-F3 :CCCGITCTAITGCAGTCAA ;外側(cè)下游引物 MCDV-B3 :GTITCTCCTGTCAATGITTCC ; 內(nèi)側(cè)上游引物 MCDV-FIP : GGITCGGAAATGGAGCAGGGCCGACGGAACCCGCAGCGCC ;內(nèi)側(cè)下游引物 MCDV-BIP ：GCCCAGGTCCCTGGTAGCACACCTTCAGACCTGAACACAAAC〇
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種玉米褪綠矮縮病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒，其 特征在于所述的反應(yīng)緩沖液的配方如下：40mM的pH8. 8的Tris-HCl、20mM的KCl、16mM的 MgS04、20mM 的（NH4) 2 S04、0. 2% 的 Tween20、1. 6 M 的甜菜堿和每種 2. 8mM 的 dNTPs，所述的 聚合酶混合液中DNA聚合酶和AMV逆轉(zhuǎn)錄聚合酶的濃度均為8 U/ y L。
4. 一種玉米褪綠矮縮病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法，其特征在于包括以下步驟： (1) 總RNA的提取 將玉米待測(cè)樣本使用RNeasy Plant Mini Kit進(jìn)行植物總RNA提?。? (2) RT-LAMP引物的設(shè)計(jì)和合成 從GenBank調(diào)出玉米褪綠矮縮病毒外殼蛋白基因序列，利用DNAMAN 6. 0. 40軟件進(jìn)行 比對(duì)分析，找出MCDV外殼蛋白基因序列的保守區(qū)，利用LAMP引物設(shè)計(jì)軟件PrimerExplorer V4設(shè)計(jì)了特異性引物，其序列如下： 外側(cè)上游引物 MCDV-F3 :CCCGITCTAITGCAGTCAA ; 外側(cè)下游引物 MCDV-B3 :GTITCTCCTGTCAATGITTCC ; 內(nèi)側(cè)上游引物 MCDV-FIP ：GGTTCGGAAATGGAGCAGGGCCGACGGAACCCGCAGCGCC ； 內(nèi)側(cè)下游引物 MCDV-BIP ：GCCCAGGTCCCTGGTAGCACACCTTCAGACCTGAACACAAAC ； (3) 配制RT-LAMP反應(yīng)體系 濃度為20 iimol/L內(nèi)側(cè)上游引物溶液和內(nèi)側(cè)下游引物溶液各2 iiL，濃度為20 iimol/ L外側(cè)上游引物溶液和外側(cè)下游引物溶液各0. 25 y L，12. 5 y L 2X反應(yīng)緩沖液，由Bst DNA聚合酶和AMV逆轉(zhuǎn)錄聚合酶組成的聚合酶混合液1. 0 y L，鈣黃綠素?zé)晒馊玖?. 0 ML， 樣品總RNA2. 5 iiL，無RNase的水補(bǔ)至25 iiL; (4) MCDV的RT-LAMP目視檢測(cè) 將上述反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)條件為：60°C 60 min，95°C 2 min;RT-LAMP擴(kuò)增 結(jié)束后，在正常光照條件下，通過裸眼觀察反應(yīng)管中顏色的變化來準(zhǔn)確判定結(jié)果，若擴(kuò)增產(chǎn) 物呈黃綠色，則樣品感染玉米褪綠矮縮病毒。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種玉米褪綠矮縮病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法，其特征 在于所述的反應(yīng)緩沖液的配方如下：40mM的pH8. 8的Tris-HCl、20mM的KCl、16mM的MgS04、 20mM的（NH4) 2 S04、0. 2%的Tween20、1. 6 M的甜菜堿和每種2. 8mM的dNTPs，所述的聚合酶 混合液中DNA聚合酶和AMV逆轉(zhuǎn)錄聚合酶的濃度均為8 U/ y L。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104372109SQ201410632416
【公開日】2015年2月25日 申請(qǐng)日期:2014年11月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月12日
【發(fā)明者】徐穎, 劉永豐, 蔡曹盛, 黃世杰, 鄭煒, 徐亞飛 申請(qǐng)人:中華人民共和國北侖出入境檢驗(yàn)檢疫局