單核細胞增生李斯特氏菌實時濁度lamp檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明的目的是提供一種單核細胞增生李斯特氏菌的實時濁度LAMP快速檢測方法，從而彌補現(xiàn)有技術(shù)的不足。本發(fā)明首先提供一種用于檢測單核細胞增生李斯特氏菌的LAMP引物組，其核苷酸序列為SEQ ID NO:1-4。本發(fā)明針對單核細胞增生李斯特氏菌的溶血素基因設(shè)計一套LAMP引物，利用實時濁度儀對單核細胞增生李斯特氏菌進行檢測，并驗證檢測方法的特異性和靈敏度，從而建立快速、特異、靈敏的單核細胞增生李斯特氏菌LAMP檢測方法。
【專利說明】單核細胞增生李斯特氏菌實時濁度LAMP檢測方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種單核細胞增生李斯特氏菌的實時 濁度LAMP快速檢測方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 單核細胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes)是一類兼性細胞內(nèi)生長的 革蘭陽性細菌，致病力較強，能引起人和動物的李斯特菌病，是重要的食源性人畜共患病原 菌。單增李斯特氏菌營養(yǎng)要求不高，環(huán)境適應(yīng)性強，既可在2?4°C下生長，也可在-18°C下 存活，甚至在反復凍融的條件下仍可存活。近年來，歐美國家因食用李斯特菌污染的食品的 病患呈上升趨勢，世界衛(wèi)生組織（WHO)已將其列為20世紀90年代以來食品中四大致病菌 之一，成為許多國家食品衛(wèi)生安全的必檢項目。
[0003] 目前，對單核細胞增生李斯特氏菌的檢測仍以傳統(tǒng)方法為主，不但檢驗周期長 (4?7d)、操作繁瑣，且準確性和靈敏性低，不利于食源性疾病的快速檢測。因此，有必要提 供一種更有效的檢測單核細胞增生李斯特氏菌的方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種單核細胞增生李斯特氏菌的實時濁度LAMP快速檢測方 法，從而彌補現(xiàn)有技術(shù)的不足。
[0005] 本發(fā)明首先提供一種用于檢測單核細胞增生李斯特氏菌的LAMP引物組，引物信 息如下：
[0006] LM0-F3 ：ATCGATCACTCTGGAGGA (SEQ ID N0:1)
[0007] LM0-B3 ：AAGCTAAACCAGTGCATTC (SEQ ID NO :2)
[0008] LMO-FIP (SEQ ID NO :3)：
[0009] TGAACAATTTCGTTACCTTCAGGATTACGTTGCTCAATTCAACATCT
[0010] LMO-BIP(SEQ ID NO:4)：
[0011] GGAGCGAAAACAATAAAAGTAAGCTGCGTAAACATTAATATTTCTTGCG。
[0012] 本發(fā)明還提供一種利用上述的LAMP引物組檢測單核細胞增生李斯特氏菌的方 法，包括有如下的步驟：
[0013] 1)待檢測基因組DNA的提取：用細菌基因組DNA提取試劑盒（上海生工）提取細 菌 DNA ;
[0014] 2)環(huán)介導等溫擴增步驟：根據(jù)本發(fā)明設(shè)計的單核細胞增生李斯特氏菌的LAMP引 物，加入反應(yīng)體系中各組分，擴增溫度為62. 5°C，實時濁度儀中反應(yīng)60min，80°C，5minJ* 止反應(yīng)；
[0015] 3)結(jié)果檢測：直接通過實時濁度儀觀察或擴增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。
[0016] 本發(fā)明針對單核細胞增生李斯特氏菌的溶血素基因設(shè)計一套LAMP引物，利用實 時濁度儀對單核細胞增生李斯特氏菌進行檢測，并驗證檢測方法的特異性和靈敏度，從而 建立快速、特異、靈敏的單核細胞增生李斯特氏菌LAMP檢測方法。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0017] 圖I :LAMP特異性試驗結(jié)果圖，其中曲線為單核細胞增生李斯特氏菌擴增曲線，其 余11株其他菌株均未出現(xiàn)擴增曲線。
[0018] 圖2 :LAMP靈敏度試驗結(jié)果圖，其中1?6為10-1?10-6濃度級稀釋菌液，7為 空白對照。

【具體實施方式】
[0019] 下面結(jié)合實施例對本發(fā)明的方法進行詳細的描述。
[0020] -、用于檢測單核細胞增生李斯特氏菌的LAMP引物組的設(shè)計
[0021] 本發(fā)明根據(jù)GeneBank中公布的單核細胞增生李斯特氏菌hlyA基因，進行序列 的保守性分析，從中篩選出溶藻膠弧菌的高度保守序列，用Primer Explorer V4.0軟件 (http://primer-explore;r· jp/e/v4_manual/index. heml)進行引物設(shè)計。設(shè)計合適的引物 是進行LAMP反應(yīng)的關(guān)鍵，通過考慮堿基組成，GC含量，二級結(jié)構(gòu)的形成，Tm值等因素來設(shè)計 溶藻膠弧菌LAMP反應(yīng)的引物。引物由寶生物工程（大連）有限公司合成。引物如表1所 示：
[0022] 表1用于擴增單核細胞增生李斯特氏菌hlyA基因的LAMP引物序列
[0023]

【權(quán)利要求】
1. 一種LAMP引物組，其特征在于，所述的引物組的序列信息如下： LM0-F3 :ATCGATCACTCTGGAGGA、 LM0-B3 :AAGCTAAACCAGTGCATTC、 LMO-FIP ： TGAACAATTTCGTTACCTTCAGGATTACGTTGCTCAATTCAACATCT LMO-BIP ： GGAGCGAAAACAATAAAAGTAAGCTGCGTAAACATTAATATTTCTTGCGo
2. 權(quán)利要求1所述的引物組在檢測單核細胞增生李斯特氏菌中的應(yīng)用。
3. -種用于檢測單核細胞增生李斯特氏菌的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒包含 有權(quán)利要求1所述的LAMP引物組。
4. 權(quán)利要求3所述的試劑盒在檢測單核細胞增生李斯特氏菌中的應(yīng)用。
5. -種檢測單核細胞增生李斯特氏菌的方法，其特征在于，所述的方法包括有如下的 步驟： 1) 待檢測基因組DNA的提取：用細菌基因組DNA提取試劑盒提取細菌DNA ; 2) 環(huán)介導等溫擴增步驟：將權(quán)利要求1所述的LAMP引物組加入反應(yīng)體系，擴增溫度為 62. 5°C，實時濁度儀中反應(yīng)6〇1^11，8〇1：，5111111，終止反應(yīng)； 3) 結(jié)果檢測：直接通過實時濁度儀觀察或擴增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。
【文檔編號】C12Q1/68GK104313173SQ201410632370
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年11月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月11日
【發(fā)明者】黃朱梁, 薛超波, 王萍亞 申請人:舟山市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督檢測研究院