納米免疫磁珠技術(shù)聯(lián)合膠體金層析快速檢測(cè)單增李斯特菌的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體公開(kāi)了一種納米免疫磁珠技術(shù)聯(lián)合膠體金層析快速檢測(cè)單增李斯特菌的方法，適用于食品中致病菌單增李斯特菌的檢測(cè)。
【背景技術(shù)】
[0002]
單核細(xì)胞增生李斯特菌(Zisteria monocytogenes，簡(jiǎn)稱(chēng)為單增李斯特菌)，是一種人畜共患病致病菌，也是常見(jiàn)的食源性致病菌之一，廣泛存在于肉、蛋、海產(chǎn)品、乳制品、蔬菜等食物中，該菌在4°C仍可生長(zhǎng)，多次發(fā)生單增李斯特菌污染中毒的事件，它能引起腦膜炎、腸胃炎癥、敗血病、流產(chǎn)等臨床癥狀，尤其對(duì)新生兒、孕婦、老年人及免疫力低下人群的危害很大，有很高的致死率，成為食品安全的一大隱患。
[0003]目前，檢測(cè)單核增生李斯特氏菌的方法有三種:傳統(tǒng)的生物學(xué)分離培養(yǎng)法、分子生物學(xué)檢測(cè)法、免疫檢測(cè)法。其中傳統(tǒng)培養(yǎng)法即國(guó)標(biāo)方法耗時(shí)耗力，分子檢測(cè)方法價(jià)格昂貴，免疫檢測(cè)法一般靈敏度達(dá)不到要求，均不適合現(xiàn)場(chǎng)大量樣品的快速篩查。
[0004]本研究主要利用多種免疫檢測(cè)法相結(jié)合來(lái)檢測(cè)食品中單核增生李斯特氏菌，這種新型的快速檢測(cè)方法結(jié)合了納米免疫磁珠分離技術(shù)和膠體金層析技術(shù)，其方法具有快速、靈敏度高，準(zhǔn)確率高，低成本、高通量、便攜帶等優(yōu)點(diǎn)，為致病菌檢測(cè)指出了新的方向。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]
本發(fā)明主要針對(duì)現(xiàn)有的生物檢測(cè)方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力、操作過(guò)程復(fù)雜以及靈敏度不高的缺陷，而提供一種以納米免疫磁珠分離技術(shù)聯(lián)合膠體金免疫層析快速檢測(cè)單增李斯特菌試紙條制備的方法。從而實(shí)現(xiàn)簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)單增李斯特菌的目的。
[0006]本發(fā)明提出的納米免疫磁珠技術(shù)聯(lián)合膠體金層析快速檢測(cè)單增李斯特菌方法，其特征在于:應(yīng)用鏈霉親和素-生物素介導(dǎo)偶聯(lián)的納米磁珠標(biāo)記經(jīng)雜交瘤技術(shù)制備篩選所得的單增李斯特菌特異性反應(yīng)鼠系單抗制備成免疫磁珠；同時(shí)以膠體金標(biāo)記的另一抗單增李斯特菌的配對(duì)單克隆抗體為標(biāo)記抗體，選自新西蘭大白兔的抗單增李斯特菌多克隆抗體和羊抗鼠IgG 二抗分別作為檢測(cè)線T區(qū)和質(zhì)控線C區(qū)，經(jīng)過(guò)膠體金標(biāo)記抗體的結(jié)合墊、檢測(cè)線T區(qū)和質(zhì)控線C區(qū)的層析膜、吸水墊組建成一種基于雙抗體夾心檢測(cè)原理的單增李斯特菌膠體金免疫層析試紙條。檢測(cè)樣品時(shí)，將免疫磁珠與樣品中的菌體進(jìn)行特異性的捕獲進(jìn)富集，再在膠體金免疫層析試紙條的樣品墊上加入其富集液體，依據(jù)膠體金的顏色在檢測(cè)線T區(qū)域和質(zhì)控線C區(qū)域處形成肉眼可見(jiàn)的顯色條帶的判讀，從而實(shí)現(xiàn)單增李斯特菌的快速半定量檢測(cè)。
[0007]其中所述的抗單增李斯特菌特異性?xún)芍陠慰故遣捎秒s交瘤技術(shù)制備篩選所得，并且經(jīng)雙抗體夾心ELISA篩選出的配對(duì)抗體，所述的抗單增李斯特菌特異性多抗是通過(guò)免疫新西蘭大白兔制備所得，兩種抗體具有很高的特異性。
[0008]本發(fā)明所述的納米免疫磁珠的制備步驟如下:
1、抗體的制備與純化:
以高壓滅菌處理單增李斯特菌體作為抗原免疫8周齡健康BALB/c雌性小鼠，按常規(guī)的雜交瘤技術(shù)和極限稀釋法制備和篩選單克隆抗體細(xì)胞株，進(jìn)而將抗單增李斯特菌的特異性抗體細(xì)胞株增殖培養(yǎng)，注射到小鼠體內(nèi)制備腹水，所得腹水經(jīng)辛酸-硫酸銨沉淀法進(jìn)行抗體純化；
以高壓滅菌處理單增李斯特菌體作為抗原免疫新西蘭大白兔，所得抗單增李斯特菌血清經(jīng)硫酸銨沉淀法進(jìn)行純化，所得多克隆抗體保存于-80度待用；
2、納米磁珠與抗體的偶聯(lián):
將ISOnm磁珠洗滌，采用活潑酯的方法，依次加入N-羥基硫代琥珀酰亞胺(NHS)、二氯乙烷(EDC)，置于混勻儀上保持磁珠懸浮狀態(tài)，37 °C活化2h，將活化磁珠與鏈霉親和素偶聯(lián)，獲得的鏈霉親和素磁珠；再將其與生物素化的單增李斯特菌單克隆抗體1B12，置于混勻儀上偶聯(lián)，制成鏈霉親和素免疫磁珠并于4°C冰箱保存?zhèn)溆谩?br>[0009]本發(fā)明所述的膠體金試紙條制備步驟如下:
1、膠體金的制備:取0.01%HAuC14水溶液10ml置于燒杯內(nèi)，加熱煮沸時(shí)加入2mL 1%梓檬酸三鈉，繼續(xù)加熱煮沸5min,冷卻后加超純水至lOOmL，制得40nm的膠體金溶液；
2、結(jié)合墊的處理:將制備出的另一株與磁珠偶聯(lián)單抗1B12配對(duì)的抗單增李斯特菌的單克隆抗體3B10標(biāo)記于膠體金顆粒上，使其終濃度為25 μ g/mL，使之標(biāo)記液體噴點(diǎn)在結(jié)合墊上以備用；
3、層析膜的包被:用自動(dòng)噴膜儀，以0.9PL/cm的速度，將特定濃度的抗血清、山羊抗小鼠IgG分別噴點(diǎn)在層析膜的T線和C線處，噴點(diǎn)時(shí)線與線間的間隔距離為0.8cm，包被后的層析膜于37°C干燥箱中烘干8小時(shí)，置于干燥器中保存?zhèn)溆茫?br> 4、試紙條的組裝與制備:將樣品墊、結(jié)合墊、層析膜、吸水墊依次相互交錯(cuò)約Imm粘貼在襯板上，然后在上層覆蓋密封膜；根據(jù)要求寬度切割即可得到膠體金免疫層析試紙條。
[0010]本發(fā)明所述的納米免疫磁珠捕獲富集菌體方法步驟如下:
取樣品與自制的免疫磁珠在旋轉(zhuǎn)混合儀上室溫反應(yīng)，反應(yīng)后進(jìn)入磁場(chǎng)分離，經(jīng)重懸、水浴即可得到菌體富集液用于下一步膠體金試紙條的檢測(cè)。
[0011]有益效果:
本發(fā)明將納米免疫磁珠分離技術(shù)與膠體金免疫層析技術(shù)相結(jié)合，通過(guò)納米磁珠偶聯(lián)抗體，形成免疫磁珠進(jìn)而來(lái)富集捕獲菌體，再將捕獲的菌體進(jìn)行基于雙抗體夾心原理的膠體金免疫層析試紙條檢測(cè)，這種方法具有用時(shí)少、準(zhǔn)確率高、檢測(cè)費(fèi)用低、不需要專(zhuān)業(yè)操作人員，且靈敏度高，可達(dá)50CFU/mL。因此，本方法特別很適于快速篩查單增李斯特菌。
【附圖說(shuō)明】
[0012]圖1為本發(fā)明納米免疫磁珠富集捕獲菌體過(guò)程示意圖；
圖2為膠體金免疫層析試紙條原理示意圖；
圖3為采用納米免疫磁珠技術(shù)聯(lián)合膠體金免疫層析快速檢測(cè)試紙條對(duì)單增李斯特菌樣品檢測(cè)陽(yáng)性、陰性、無(wú)效的結(jié)果是意圖；
圖4為單增李斯特菌培養(yǎng)樣品檢測(cè)的結(jié)果是示意圖； 圖5為單增李斯特菌模擬污染樣品檢測(cè)的結(jié)果是示意圖；
圖6為試紙條特異性檢測(cè)結(jié)果示意圖:
【具體實(shí)施方式】
實(shí)施案例I免疫磁珠的制備及捕獲單增李斯特菌檢測(cè) 1、納米免疫磁珠的制備
(O抗體的制備與純化:以高壓滅菌處理單增李斯特菌體作為抗原免疫8周齡健康BALB/c雌性小鼠，按常規(guī)的雜交瘤技術(shù)和極限稀釋法制備和篩選單克隆抗體細(xì)胞株，進(jìn)而將抗單增李斯特菌的特異性抗體細(xì)胞株增殖培養(yǎng)，注射到小鼠體內(nèi)制備腹水，所得腹水經(jīng)辛酸-硫酸銨沉淀法進(jìn)行抗體純化；以高壓滅菌處理單增李斯特菌體作為抗原免疫新西蘭大白兔，所得抗單增李斯特菌血清經(jīng)硫酸銨沉淀法進(jìn)行純化，所得多克隆抗體保存于-80度待用。
[0013](2)納米磁珠與抗體的偶聯(lián):采用活潑酯的方法，將鏈霉親和素與180nm磁珠偶聯(lián)獲得鏈霉親和素磁珠，采用生物素化抗體與鏈霉親和素磁珠連接制成鏈霉親和素免疫磁珠。取1mg磁珠依次用無(wú)水乙醇，依次用lmol/L NaOH, lmol/L HCl各洗滌I次，用PB (0.02mol/L，ρΗ4.0)洗 5 次 MES (0.05mol/L，ρΗ6.0)重懸。依次加入 N-羥基硫代琥珀酰亞胺(NHSS) 0.4mg，二氯乙烷(EDC) 0.35mg，置于混勻儀上保持磁珠懸浮狀態(tài)，37°C活化2h0將每mg活化磁珠與200 μ g鏈霉親和素偶聯(lián)；獲得的鏈霉親和素磁珠，按每mg磁珠加入80 mg生物素化LM單克隆抗體1B12，置于混勻儀上37°C偶聯(lián)30min。磁力架回收磁珠，PB 洗滌 3 次，1mLPBS (含 0.05g/100mL NaN3，0.5g/100mL BSA, ρΗ7.4)重懸免疫磁珠并于4 °C冰箱保存?zhèn)溆谩?br>[0014]2、納米免疫磁珠捕獲富集菌體
(I)免疫磁珠捕獲L M菌液
取I mL 15CFU / mL的LM菌液于2 mL的離心管中，取60 mg/g單克隆抗體/磁珠偶聯(lián)比制備的免疫磁珠0.1 mg于上述離心管，另設(shè)對(duì)照組。室溫下在Dynal-MIXl旋轉(zhuǎn)混合儀上反應(yīng)30 min( 10 r/min)后取下，將離心管插入磁力架分離2 min，吸出上清液。加I mL PB (-0.02%吐溫20)洗滌2遍，分離后吸出洗滌液，最后用I mL PB重懸磁珠，將上清液、洗滌液、磁珠重懸液及對(duì)照組作合適倍數(shù)稀釋?zhuān)?00 μ L涂布于LM選擇性培養(yǎng)基，平行3個(gè)樣品。37 °C培養(yǎng)12 h，選擇菌落數(shù)在20?200范圍內(nèi)的進(jìn)行計(jì)數(shù)，按公式計(jì)算其捕獲效率(CE):
CE (%) = (C1-C2-C3) /Cl *100%
Cl為對(duì)照組菌落總數(shù)，C2為上清液菌落總數(shù)，C3為洗滌液菌落總數(shù)當(dāng)免疫磁珠添加量達(dá)到0.1mg時(shí)，I mL 15CFU /mL LM菌液捕獲效率大于99%。為了保證有效分離，確定在檢測(cè)中免疫磁珠加入量為0.lmg。圖1為本發(fā)明納米免疫磁珠富集捕獲菌體過(guò)程示意圖。
[0015](2)在肉樣中的捕獲效果
稱(chēng)取25 g市售豬肉切碎置于無(wú)菌的三角瓶?jī)?nèi)，添加培養(yǎng)好的LM模擬污染，至目標(biāo)菌濃度約為12CFU / g，然后加入250 mL EC肉湯，37 °C, 160 r/min搖床培養(yǎng)8 h，取ImL上層清液到離心管里，各添加0.1mg自制的免疫磁珠，在旋轉(zhuǎn)混合儀上室溫反應(yīng)30min，結(jié)束后放入磁場(chǎng)分離2 min。將對(duì)照組、分離上清液、洗滌液、磁珠重懸液作合適倍數(shù)稀釋?zhuān)?00 μ L涂布于單增李斯特菌選擇性培養(yǎng)基上，(對(duì)照組同時(shí)涂布瓊脂培養(yǎng)基計(jì)算菌落總數(shù))，平行制備3個(gè)樣品。37 V培養(yǎng)12 h后，對(duì)大單增李斯特菌和雜菌分別計(jì)數(shù)，計(jì)算捕獲效率。同時(shí)，購(gòu)買(mǎi)商品磁珠進(jìn)行同一實(shí)驗(yàn)，并計(jì)算其捕獲效率。在豬肉樣中的捕獲效果: