自制免疫磁珠在豬肉樣品中的捕獲效率為98.6%，而商品性免疫磁珠在豬肉樣品中的捕獲效率為96.5%。說明自制的免疫磁珠比商品免疫磁珠在樣品中的捕獲效率要高，自制的免疫磁珠可達(dá)到要求，可以進(jìn)行檢測使用。
[0016]實(shí)施案例2膠體金免疫層析試紙條的制備及樣品檢測 1、膠體金試紙條的制備
(1)膠體金的制備:取0.01%HAuC14水溶液10mL置于燒杯內(nèi)，加熱煮沸時(shí)加入2mL1%檸檬酸三鈉，繼續(xù)加熱煮沸5min，冷卻后加超純水至lOOmL，制得40nm的膠體金溶液；
(2)結(jié)合墊的處理:將制備出的另一株與磁珠偶聯(lián)單抗1B12配對的抗單增李斯特菌的單克隆抗體3B10標(biāo)記于膠體金顆粒上，使之標(biāo)記液體噴點(diǎn)在結(jié)合墊上以備用；
(3)層析膜的包被:用自動噴膜儀，以0.9PL/cm的速度，將特定濃度的多抗血清、山羊抗小鼠IgG分別噴點(diǎn)在層析膜的T線和C線處，噴點(diǎn)時(shí)線與線間的間隔距離為0.8cm，包被后的層析膜于37°C的干燥箱中烘干8小時(shí)，置于干燥器中保存?zhèn)溆茫?br> (4)試紙條的組裝與制備:將樣品墊、結(jié)合墊、層析膜、吸水墊依次相互交錯約Imm粘貼在襯板上，然后在上層覆蓋密封膜，根據(jù)要求寬度切割即可得到膠體金免疫層析試紙條。圖2為膠體金免疫層析試紙條原理示意圖。
[0017]2、膠體金試紙條的樣品檢測
取I mL樣品于離心管中，添加0.1mg自制的免疫磁珠，在旋轉(zhuǎn)混合儀上室溫反應(yīng)30 min，再放入磁場分離2 min后，用ImL PB (0.01M，ρΗ7.4)重懸，85° C水浴15min,即可得到菌體富集液用于膠體金試紙條的檢測。圖3為采用納米免疫磁珠技術(shù)聯(lián)合膠體金免疫層析快速檢測試紙條對單增李斯特菌樣品檢測陽性、陰性、無效的結(jié)果是意圖。
[0018]實(shí)施案例3培養(yǎng)樣品的檢測
將培養(yǎng)12h的LM菌液稀釋為0，10，50，102，103，104，1050?1]/1111，各取I mL加到離心管中，各管均加入0.1mg自制免疫磁珠。室溫下，在旋轉(zhuǎn)混合儀上孵育30 min，磁分離后用ImL PB重懸，85 V水浴15 min，磁分離后吸出上清液，將10yL上清液和對照組菌液分別添加到試紙條加樣孔內(nèi)，5~15 min觀察試紙條檢測線和質(zhì)控線顯色情況。
[0019]如圖4所示，經(jīng)過免疫磁珠分離富集反應(yīng)，濃度為13 CFU/mL和12 CFU/mL菌液的檢測結(jié)果為強(qiáng)陽性，濃度為50CFU/mL檢測結(jié)果為弱陽性，表明濃度為50CFU/mL的菌液經(jīng)過免疫磁珠分離富集后能通過試紙條檢出。
[0020]實(shí)施案例4模擬污染LM肉樣的檢測
取1g豬肉樣切，按每克豬肉加0，10，50，12，13, 14, 15 CFU/ml細(xì)菌來進(jìn)行模擬污染，各取出I mL加到兩組2 mL離心管中。各管均加入0.1mg自制免疫磁珠。室溫下，在旋轉(zhuǎn)混合儀上孵育30 min，磁分離后用ImL PB重懸，85 °C水浴15 min，磁分離后吸出上清液，將10yL上清液和對照組菌液分別添加到試紙條加樣孔內(nèi)，5~15 min后觀察試紙條檢測線和質(zhì)控線顯色情況，取10yL磁分離富集組上清液和10yL對照組菌液分別添加到試紙條加樣孔內(nèi)，5~15 min后觀察試紙條檢測線和質(zhì)控線顯色情況。
[0021]如圖5所示，模擬污染單增李斯特菌肉樣檢測，過免疫磁珠分離富集反應(yīng)，濃度為13 CFU/mL和12 CFU/mL菌液的檢測結(jié)果為強(qiáng)陽性，濃度為50CFU/mL檢測結(jié)果為弱陽性，表明濃度為50CFU/mL的菌液經(jīng)過免疫磁珠分離富集后能通過試紙條檢出。并且實(shí)驗(yàn)中觀察到，將含有食品基質(zhì)的培養(yǎng)液直接滴加于試紙條加樣孔，由于食品顆粒和脂肪對試紙條的影響，其在試紙條上的移動速度較慢，而經(jīng)過免疫磁珠分離后無此現(xiàn)象，這是因?yàn)槊庖叽胖榉蛛x消除了食品基質(zhì)對試紙條的影響，提高了檢測準(zhǔn)確性。
[0022]實(shí)施案例5膠體金免疫層析試紙條特異性的檢測
以兩株單增李斯特菌和綿羊李斯特菌、英諾克李斯特菌、大腸桿菌、沙門氏菌、枯草桿菌、金黃色葡萄球菌及鏈球菌等菌株進(jìn)行特異性實(shí)驗(yàn)。各取Iml濃度為106CFU/ml的菌液進(jìn)行納米免疫磁珠-膠體金方法的檢測。如圖6所示，1-2號滴加的是本實(shí)驗(yàn)室保存的單增李斯特菌，3~9號滴加7株非單增李斯特菌株。試驗(yàn)結(jié)果表明，該試紙條特異性很好，能夠檢測與其它雜菌無交叉反應(yīng)。
[0023]本發(fā)明所述的抗單增李斯特菌單克隆抗體保藏編號為1B12 CGMCC N0.10312和保藏編號為3B10 CGMCC N0.10311，均保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址在北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中科院微生物研究所，保藏日期為2015年I月15日。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.抗單增李斯特菌單克隆抗體1B12CGMCC N0.10312和3B10 CGMCC N0.10311，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址在北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中科院微生物研究所，保藏日期為2015年I月15日。2.納米免疫磁珠技術(shù)聯(lián)合膠體金層析快速檢測單增李斯特菌方法，其特征在于:應(yīng)用鏈霉親和素-生物素介導(dǎo)偶聯(lián)的納米磁珠標(biāo)記經(jīng)雜交瘤技術(shù)制備篩選所得的單增李斯特菌特異性反應(yīng)鼠系單抗制備成免疫磁珠；同時(shí)以膠體金標(biāo)記的另一抗單增李斯特菌的配對單克隆抗體為標(biāo)記抗體，選自新西蘭大白兔免疫的抗單增李斯特菌多克隆抗體和羊抗鼠IgG 二抗分別作為檢測線T區(qū)和質(zhì)控線C區(qū)，經(jīng)過膠體金標(biāo)記抗體的結(jié)合墊、檢測線T區(qū)和質(zhì)控線C區(qū)的層析膜、吸水墊組建成一種基于雙抗體夾心檢測原理的單增李斯特菌膠體金免疫層析試紙條；檢測樣品時(shí)，將免疫磁珠與樣品中的菌體進(jìn)行特異性的捕獲進(jìn)富集，再在膠體金免疫層析試紙條的樣品墊上加入富集液體，依據(jù)膠體金的顏色在檢測線T區(qū)域和質(zhì)控線C區(qū)域處形成肉眼可見的顯色條帶的判讀，從而實(shí)現(xiàn)單增李斯特菌的快速定性檢測。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的納米免疫磁珠技術(shù)聯(lián)合膠體金層析快速檢測單增李斯特菌方法，其特征在于，所述的納米免疫磁珠的制備方法如下: (1)抗體的制備與純化:以高壓滅菌處理單增李斯特菌體作為抗原免疫BALB/c雌性小鼠，按常規(guī)的雜交瘤技術(shù)和極限稀釋法制備和篩選單克隆抗體細(xì)胞株，進(jìn)而將抗單增李斯特菌的特異性抗體細(xì)胞株增殖培養(yǎng)，注射到小鼠體內(nèi)制備腹水，所得腹水經(jīng)辛酸-硫酸銨沉淀法進(jìn)行抗體純化；以高壓滅菌處理單增李斯特菌體作為抗原免疫新西蘭大白兔，所得抗單增李斯特菌血清經(jīng)硫酸銨沉淀法進(jìn)行純化，所得多克隆抗體保存于-80度待用； (2)納米磁珠與抗體的偶聯(lián):采用活潑酯的方法，將ISOnm磁珠與鏈霉親和素偶聯(lián)獲得鏈霉親和素磁珠，采用生物素化抗體與鏈霉親和素磁珠連接制成鏈霉親和素免疫磁珠；洗滌磁珠，依次加入N-羥基硫代琥珀酰亞胺(NHS)、二氯乙烷(EDC)，置于混勻儀上保持磁珠懸浮狀態(tài)，37°C活化2h ;將活化磁珠與鏈霉親和素偶聯(lián)；獲得的鏈霉親和素磁珠，再將其與生物素化的單增李斯特菌單克隆抗體1B12，置于混勻儀上偶聯(lián)，形成免疫磁珠并于4°C冰箱保存?zhèn)溆谩?.根據(jù)權(quán)利要求2所述的納米免疫磁珠技術(shù)聯(lián)合膠體金層析快速檢測單增李斯特菌方法，其特征在于，所述的膠體金試紙條制備方法如下: (1)膠體金的制備:取0.01%HAuC14水溶液10mL置于燒杯內(nèi)，加熱煮沸時(shí)加入2mL1%檸檬酸三鈉，繼續(xù)加熱煮沸5min，冷卻后加超純水至lOOmL，制得40nm的膠體金溶液； (2)結(jié)合墊的處理:將制備出的另一株與磁珠偶聯(lián)單抗1B12配對的抗單增李斯特菌的單克隆抗體3B10標(biāo)記于膠體金顆粒上，使其終濃度為25 μ g/mL，使之標(biāo)記液體噴點(diǎn)在結(jié)合墊上以備用； (3)層析膜的包被:用自動噴膜儀，以0.9PL/cm的速度，將特定濃度的抗血清、山羊抗小鼠IgG分別噴點(diǎn)在層析膜的T線和C線處，噴點(diǎn)時(shí)線與線間的間隔距離為0.8cm;包被后的層析膜于37°C的干燥箱中烘干8小時(shí)，置于干燥器中保存?zhèn)溆茫? (4)試紙條的組裝與制備:將樣品墊、結(jié)合墊、層析膜、吸水墊依次相互交錯約Imm粘貼在襯板上，然后在上層覆蓋密封膜；根據(jù)要求寬度切割即可得到膠體金免疫層析試紙條。5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的納米免疫磁珠技術(shù)聯(lián)合膠體金層析快速檢測單增李斯特菌方法，其特征在于，所述的納米免疫磁珠捕獲富集菌體方法如下:取樣品與自制的免疫磁珠在旋轉(zhuǎn)混合儀上室溫反應(yīng)，反應(yīng)后進(jìn)入磁場分離，經(jīng)重懸、水浴即可得到菌體富集液用于下一步膠體金試紙條的檢測。6.納米免疫磁珠技術(shù)聯(lián)合膠體金層析快速檢測單增李斯特菌方法，其特征在于，將待測樣品富集液滴入檢測卡加樣孔，待5~15分鐘后讀取T、C線的顯色，得到結(jié)果。
【專利摘要】本發(fā)明提出的納米免疫磁珠技術(shù)聯(lián)合膠體金層析快速檢測單增李斯特菌方法如下：應(yīng)用鏈霉親和素-生物素介導(dǎo)偶聯(lián)的納米磁珠標(biāo)記經(jīng)雜交瘤技術(shù)制備篩選所得單抗1B12？CGMCC？No.10312制備成免疫磁珠；以膠體金標(biāo)記的另一配對單抗3B10？CGMCC？No.10311為標(biāo)記抗體，將多抗血清和羊抗鼠IgG分別作為檢測線T和質(zhì)控線C，經(jīng)過膠體金標(biāo)記抗體的結(jié)合墊、檢測線T和質(zhì)控線C的層析膜、吸水墊組建成膠體金免疫層析試紙條；檢測樣品時(shí)，將免疫磁珠與樣品中菌體進(jìn)行特異性的捕獲富集，再將其富集液體加入試紙條的樣品墊上，依據(jù)膠體金的顏色在檢測線T和質(zhì)控線C處形成肉眼可見顯色條帶的判讀，從而實(shí)現(xiàn)單增李斯特菌的快速半定量檢測。CGMCC No.1031120150115
【IPC分類】G01N33/569
【公開號】CN105116146
【申請?zhí)枴緾N201510315842
【發(fā)明人】張紅星, 齊穎穎, 段慧霞, 謝遠(yuǎn)紅, 劉慧 , 張帥
【申請人】北京農(nóng)學(xué)院
【公開日】2015年12月2日
【申請日】2015年6月10日