一種鑒別白斑紅點(diǎn)鮭和美洲紅點(diǎn)鮭刺身及熏肉制品的分子標(biāo)記及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】一種鑒別白斑紅點(diǎn)鮭和美洲紅點(diǎn)鮭刺身及熏肉制品的分子標(biāo)記及其應(yīng)用，它涉及一種鑒別白斑紅點(diǎn)鮭和美洲紅點(diǎn)鮭的分子標(biāo)記及其應(yīng)用。本發(fā)明要解決現(xiàn)在沒有一種準(zhǔn)確有效鑒別白斑紅點(diǎn)鮭和美洲紅點(diǎn)鮭的方法的問題。本發(fā)明的用于PCR擴(kuò)增分子標(biāo)記的引物對為AF346686F和AF346686R，AF346686F:5’-AGT CGT CGG CTT GTC TTC-3’，AF346686R:5’-ACT ACG GCT TTC TGG GAT-3’。本發(fā)明的分子標(biāo)記用于鑒別白斑紅點(diǎn)鮭(Salvelinus leucomaenis)和美洲紅點(diǎn)鮭(Salvelinus fominalis)。
【專利說明】-種鑒別白斑紅點(diǎn)鮭和美洲紅點(diǎn)鮭刺身及熏肉制品的分子 標(biāo)記及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于水產(chǎn)動物分子遺傳學(xué)領(lǐng)域，具體地說，本發(fā)明涉及應(yīng)用微衛(wèi)星標(biāo)記對 白斑紅點(diǎn)鮭和美洲紅點(diǎn)鮭刺身及熏肉制品進(jìn)行鑒別。

【背景技術(shù)】
[0002] 美洲紅點(diǎn)鮭（Salvelinus fominalis)和白斑紅點(diǎn)鮭（Salvelinus Ieucomaenis) 都隸屬于鮭形目（Salmoniformes),鮭科（Salmonidae),紅點(diǎn)鮭屬（Salvelinus)。美洲紅 點(diǎn)鮭，俗稱七彩鮭魚。主要分布于北半球的60° Ν-4Γ N范圍內(nèi)，原產(chǎn)于加拿大東部五大 湖區(qū)、明尼蘇達(dá)州的密西西比河灣、佐治亞州的北部等地。美洲紅點(diǎn)鮭生長快、肉質(zhì)鮮美、營 養(yǎng)豐富，自2000年左右引入我國后迅速成為一種重要淡水養(yǎng)殖鮭科魚類。白斑紅點(diǎn)鮭，俗 稱白點(diǎn)鮭，原產(chǎn)于日本，1996年由中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所引入中國，白斑紅 點(diǎn)鮭定居性強(qiáng)，繁殖期死亡率低，目前已經(jīng)發(fā)展成一個(gè)冷水性魚類的主要養(yǎng)殖品種。在我國 的人工養(yǎng)殖條件下，二者的要求較為接近，繁殖水溫為KTC左右，繁殖高峰期均在10月下 旬到11月中旬，苗種孵出至開口攝食期間最佳的培育水溫為8-KTC，飼養(yǎng)期間水溫變化在 4. 7-16. 8°C。
[0003] 兩種魚體型特征和生長速度都較為相似，由于美洲紅點(diǎn)鮭體色艷麗，體表斑點(diǎn)有 多種顏色，而白斑紅點(diǎn)鮭體表斑點(diǎn)主要呈乳白色，僅憑這項(xiàng)特點(diǎn)即可從外觀上對上述兩種 魚進(jìn)行區(qū)分。中國消費(fèi)者對美洲紅點(diǎn)鮭七彩外觀有明顯的偏好，形成了對美洲紅點(diǎn)鮭的選 擇性消費(fèi)偏好；另外從生產(chǎn)者角度考慮，美洲紅點(diǎn)鮭繁殖期死亡率顯著高于白斑紅點(diǎn)鮭，導(dǎo) 致養(yǎng)殖成本高于白斑紅點(diǎn)鮭。上述兩個(gè)因素直接引起美洲紅點(diǎn)鮭的市場價(jià)格要高于白斑紅 點(diǎn)鮭。但是，鮭魚主要以刺身（生魚片）和熏肉的形式銷售，而這兩種方法一般都需要將魚 皮剝?nèi)ィ@兩種魚的肉色、口感非常類似，因此，魚肉制成刺身及熏肉制品后通過感官檢 查很難區(qū)分其真假。于是，一些不法商販以白斑紅點(diǎn)鮭冒充美洲紅點(diǎn)鮭，獲取超額利潤，損 害了消費(fèi)者利益。
[0004] 因此，現(xiàn)在急需一種準(zhǔn)確有效地鑒別兩種魚的方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明提供一種鑒別白斑紅點(diǎn)鮭和美洲紅點(diǎn)鮭刺身及熏肉制品的分子標(biāo)記及應(yīng) 用，解決目前沒有一種準(zhǔn)確有效鑒別上述兩種魚的方法的問題。
[0006] 本發(fā)明的一種鑒別白斑紅點(diǎn)鮭和美洲紅點(diǎn)鮭刺身及熏肉制品的分子標(biāo)記，用于 PCR擴(kuò)增分子標(biāo)記的引物對為AF346686F和AF346686R，具體序列為：
[0007] AF346686F: 5 ' -AGTCGTCGGCTTGTCTTC-3 '
[0008] AF346686R: 5 ' -ACTACGGCTTTCTGGGAT-3 '。
[0009] 本發(fā)明的一種鑒別白斑紅點(diǎn)鮭和美洲紅點(diǎn)鮭刺身及熏肉制品的分子標(biāo)記的 應(yīng)用，它用于鑒別白斑紅點(diǎn)鮭（Salvelinus Ieucomaenis)和美洲紅點(diǎn)鮭（Salvelinus fominalis)ο
[0010] 本發(fā)明包含以下有益效果：
[0011] 采用本發(fā)明的分子標(biāo)記，從基因?qū)用鎸Π装呒t點(diǎn)鮭和美洲紅點(diǎn)鮭進(jìn)行區(qū)分，從而 避免了通過肉眼感官檢查兩種魚的刺身及熏肉制品存在不準(zhǔn)確，容易混淆的問題。
[0012] 通過本發(fā)明的引物進(jìn)行PCR檢測微衛(wèi)星標(biāo)記基因型，若檢測得到長度為250bp單 一片段，則待檢測樣品來源于白斑紅點(diǎn)鮭（Salvelinus Ieucomaenis);若檢測得到長度為 252bp和999bp兩條目的片段，則待檢測樣品來源于美洲紅點(diǎn)鮭（Salvelinus fominalis)。
[0013] 本發(fā)明所設(shè)計(jì)的引物對虹鱒的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物擴(kuò)增片段長度 介于300?500bp之間，不與白斑紅點(diǎn)鮭和美洲紅點(diǎn)鮭基因組DNA所獲得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長 度相一致；另外，虹鱒刺身和熏肉制品外觀可以憑肉眼感官檢查直接區(qū)分。因此，雖然該引 物針對虹鱒基因組序列設(shè)計(jì)獲得，但是該引物PCR擴(kuò)增產(chǎn)物對白斑紅點(diǎn)鮭和美洲紅點(diǎn)鮭刺 身及熏肉制品進(jìn)行鑒別區(qū)分并不會與虹鱒刺身及熏肉制品相混淆。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0014] 圖1為利用引物AF346686F和AF346686R對白斑紅點(diǎn)鮭和美洲紅點(diǎn)鮭的擴(kuò)增后的 電泳圖；其中，1-10泳道為美洲紅點(diǎn)鮭電泳圖，11泳道為DL2000marker，12-21泳道為白斑 紅點(diǎn)鮭電泳圖；
[0015] 圖2為利用引物AF346686F和AF346686R對白斑紅點(diǎn)鮭、美洲紅點(diǎn)鮭和虹鱒的擴(kuò) 增后的電泳圖；其中，1-6泳道為美洲紅點(diǎn)鮭電泳圖，7-12泳道為白斑紅點(diǎn)鮭電泳圖，13泳 道為DL2000marker，14-19泳道為虹鱒電泳圖。

【具體實(shí)施方式】

【具體實(shí)施方式】 [0016] 一：本實(shí)施方式的一種鑒別白斑紅點(diǎn)鮭和美洲紅點(diǎn)鮭刺身及熏肉制 品的分子標(biāo)記，用于PCR擴(kuò)增分子標(biāo)記的引物對為AF346686F和AF346686R，具體序列為：
[0017] AF346686F:5' -AGT CGT CGG CTT GTC TTC-3'
[0018] AF346686R:5, -ACTACG GCT TTC TGG GAT-3，。
[0019] 本實(shí)施方式中的AF346686F和AF346686R序列如序列表Seq ID No : 1和Seq ID No :2所示。
[0020] 本實(shí)施方式的引物是依據(jù)虹鱒（Oncorhyncus mykiss)微衛(wèi)星（Genbank NO.AF346686)序列片段（詳見序列表Seq ID No:3所示）設(shè)計(jì)而成的。

【具體實(shí)施方式】 [0021] 二：本實(shí)施方式的一種鑒別白斑紅點(diǎn)鮭和美洲紅點(diǎn)鮭刺身及熏肉制 品的分子標(biāo)記的應(yīng)用，它用于鑒別白斑紅點(diǎn)鮭（Salvelinus Ieucomaenis)和美洲紅點(diǎn)鮭 (Salvelinus fominalis)〇
[0022]

【具體實(shí)施方式】三：本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】二不同的是：鑒別白斑紅點(diǎn)鮭 (Salvelinus Ieucomaenis)和美洲紅點(diǎn)鮭（Salvelinus fominalis)的方法如下：米用 PCR-LP方法，利用權(quán)利要求1的引物對，檢測待測樣品的微衛(wèi)星標(biāo)記基因型，若檢測得到 長度為250bp單一片段，則待檢測樣品來源于白斑紅點(diǎn)鮭（Salvelinus Ieucomaenis); 若檢測得到長度為252bp和999bp兩條目的片段，則待檢測樣品來源于美洲紅點(diǎn)鮭 (Salvelinus fominalis),從而完成對白斑紅點(diǎn)鮭（Salvelinus Ieucomaenis)和美洲紅點(diǎn) 鮭（Salvelinus fominalis)的鑒別。其它與【具體實(shí)施方式】二相同。

【具體實(shí)施方式】 [0023] 四：本實(shí)施方式與二或三不同的是：所述的采用 PCR-LP方法，利用權(quán)利要求1的引物對，檢測待測樣品的微衛(wèi)星標(biāo)記基因型的具體操作如 下：
[0024] 一、提取待測樣品的基因組DNA，備用；
[0025] 二、以步驟一提取的基因組DNA為模板，利用AF346686F和AF346686R引物，進(jìn)行 PCR反應(yīng)；
[0026] 三、待步驟二的PCR反應(yīng)結(jié)束后，收集PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，觀察電泳條帶，若 電泳得到長度為250bp的單一片段，則表明待檢測樣品來源于白斑紅點(diǎn)鮭（Salvelinus leucomaenis);若電泳得到長度為252bp和999bp兩條目的片段，則待檢測樣品來源于美洲 紅點(diǎn)鮭（Salvelinus fominalis)，從而完成對白斑紅點(diǎn)鮭（Salvelinus Ieucomaenis)和美 洲紅點(diǎn)鮭（Salvelinus fominalis)的鑒別；
[0027] 其中，所述的AF346686F和AF346686R引物序列為：
[0028] AF346686F:5' -AGT CGT CGG CTT GTC TTC-3'
[0029] AF346686R:5'-ACT ACG GCT TTC TGG GAT-3'。其它與【具體實(shí)施方式】二或三相同。
[0030] 【具體實(shí)施方式】五：本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】二至四之一不同的是：所述的PCR 反應(yīng)體系為：

【權(quán)利要求】
1. 一種鑒別白斑紅點(diǎn)鮭和美洲紅點(diǎn)鮭刺身及熏肉制品的分子標(biāo)記，其特征在于用于 PCR擴(kuò)增分子標(biāo)記的引物對為AF346686F和AF346686R，具體序列為： AF346686F:5' -AGT CGT CGG CTT GTC TTC-3' AF346686R:5' -ACTACG GCT TTC TGG GAT-3'。
2. 權(quán)利要求1所述的一種鑒別白斑紅點(diǎn)鮭和美洲紅點(diǎn)鮭刺身及熏肉制品的分子標(biāo) 記的應(yīng)用，其特征在于它用于鑒別白斑紅點(diǎn)鮭（Salvelinus leucomaenis)和美洲紅點(diǎn)鮭 (Salvelinus fominalis)〇
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種鑒別白斑紅點(diǎn)鮭和美洲紅點(diǎn)鮭刺身及熏肉制品的分 子標(biāo)記的應(yīng)用，其特征在于鑒別白斑紅點(diǎn)鮭（Salvelinus leucomaenis)和美洲紅點(diǎn)鮭 (Salvelinus fominalis)的方法如下：采用PCR-LP方法，利用權(quán)利要求1的引物對，檢 測待測樣品的微衛(wèi)星標(biāo)記基因型，若檢測得到長度為250bp單一片段，則待檢測樣品來源 于白斑紅點(diǎn)鮭（Salvelinus leucomaenis);若檢測得到長度為252bp和999bp兩條目的 片段，則待檢測樣品來源于美洲紅點(diǎn)鮭（Salvelinus fominalis)，從而完成對白斑紅點(diǎn)鮭 (Salvelinus leucomaenis)和美洲紅點(diǎn)鮭（Salvelinus fominalis)的鑒別。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的一種鑒別白斑紅點(diǎn)鮭和美洲紅點(diǎn)鮭刺身及熏肉制品的分 子標(biāo)記的應(yīng)用，其特征在于所述的采用PCR-LP方法，利用權(quán)利要求1的引物對，檢測待測樣 品的微衛(wèi)星標(biāo)記基因型的具體操作如下： 一、 提取待測樣品的基因組DNA，備用； 二、 以步驟一提取的基因組DNA為模板，利用AF346686F和AF346686R引物，進(jìn)行PCR 反應(yīng)； 三、 待步驟二的PCR反應(yīng)結(jié)束后，收集PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，觀察電泳條帶，若電 泳得到長度為250bp的單一片段，則表明待檢測樣品來源于白斑紅點(diǎn)鮭（Salvelinus leucomaenis);若電泳得到長度為252bp和999bp兩條目的片段，則待檢測樣品來源于美洲 紅點(diǎn)鮭（Salvelinus fominalis)，從而完成對白斑紅點(diǎn)鮭（Salvelinus leucomaenis)和美 洲紅點(diǎn)鮭（Salvelinus fominalis)的鑒別； 其中，所述的AF346686F和AF346686R引物序列為： AF346686F:5' -AGT CGT CGG CTT GTC TTC-3' AF346686R:5' -ACTACG GCT TTC TGG GAT-3'。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種鑒別白斑紅點(diǎn)鮭和美洲紅點(diǎn)鮭刺身及熏肉制品的分子 標(biāo)記的應(yīng)用，其特征在于所述的PCR反應(yīng)體系為： 體系 ）im 50 ng/μ丨待檢_樣品DN Α Ι,ΟμΙ 腫 μη? 丨'.游》j| 物 0·5μ1 ΙΟμηιοΙ/L 卜'游引物 0,5μΙ i〇x PCR Buflcr 1·5μ1 2 nimol/L dNTP 1·5μ1 25 mraol/L MgCl? 1 ·2μ1 5 U/ul Taq Si 0.18μ1 ddH20 8.62μ1 ?〇?擴(kuò)增條件為：941：預(yù)變性51^11;941：變性3〇8,551：退火3〇8,721：延伸3〇8，共30 個(gè)循環(huán)，再72°C延伸5min，4°C保溫。
【文檔編號】C12Q1/68GK104293972SQ201410631874
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年11月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月11日
【發(fā)明者】戶國, 郭媛, 王炳謙, 谷偉, 孫鵬 申請人:中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所