高效低毒匹馬霉素衍生物及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】一種高效低毒匹馬霉素衍生物，分子式為C33H49NO11，化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下：該高效低毒匹馬霉素衍生物是以基因工程改造菌株Streptomyces chattanoogensis QZ01發(fā)酵菌體為原料，經(jīng)菌體處理、有機(jī)試劑提取、反相色譜柱層析及高效液相色譜分離獲得。本發(fā)明化合物結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、活性好、毒性低，可作為抗真菌藥物及食品防腐劑，具有良好的臨床應(yīng)用前景及經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
【專利說(shuō)明】高效低毒匹馬霉素衍生物及其制備方法和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物分離技術(shù)，具體涉及一種高效低毒匹馬霉素衍生 物及其制備方法和應(yīng)用。 技術(shù)背景
[0002] 系統(tǒng)性真菌感染是一種嚴(yán)重的免疫系統(tǒng)缺陷并發(fā)癥，其病原體往往具有高傳播 率、高增殖率、高致死率以及高耐藥性等特點(diǎn)，嚴(yán)重威脅著人們的健康。由于真菌病原體耐 藥性的迅速發(fā)展以及藥物間的相互作用等原因，目前可以在臨床上用于治療系統(tǒng)性真菌感 染的抗真菌藥物十分有限，并且治療效果十分不理想。其中，多烯類抗生素對(duì)多種真菌病原 體均具有高效的抗菌抑菌活性，且真菌病原體對(duì)其抗藥性的發(fā)展十分緩慢，是目前公認(rèn)的 最有效的抗真菌藥物。但多烯類抗生素同時(shí)也可以與哺乳動(dòng)物細(xì)胞膜中的膽固醇作用，造 成嚴(yán)重的溶血毒性，使其臨床應(yīng)用價(jià)值被嚴(yán)重限制。
[0003] 匹馬霉素是一種常用的多烯類抗生素，其結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，并被廣泛用作 食品（如奶酪等非滅菌食物）防腐添加劑、抗真菌獸藥以及用于治療角膜炎。匹馬霉素是 目前最常用的四種多烯類抗生素（匹馬霉素、兩性霉素 B、制霉菌素及殺念菌素等）中，溶血 毒性最低的一種，但其抗真菌活性同樣也相對(duì)較低。相對(duì)偏低的藥理性質(zhì)，嚴(yán)重限制了匹馬 霉素在臨床中的應(yīng)用價(jià)值。因此，通過(guò)基因工程改造等方法，對(duì)匹馬霉素的相關(guān)功能團(tuán)進(jìn)行 改造優(yōu)化，研究開發(fā)新的高抗真菌活性、低溶血毒性的匹馬霉素衍生物，具有重要的臨床應(yīng) 用及經(jīng)濟(jì)價(jià)值。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的之一是提供一種高效低毒匹馬霉素衍生物；目的之二是提供上述匹 馬霉素衍生物的制備方法；目的之三是提供上述匹馬霉素衍生物的應(yīng)用。
[0005] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案：
[0006] -種高效低毒匹馬霉素衍生物，分子式為C33H49NO 11,結(jié)構(gòu)式如下：
[0007]

【權(quán)利要求】
1. 一種高效低毒匹馬霉素衍生物，分子式為C33H49NO 11,結(jié)構(gòu)式如下：
2. 權(quán)利要求1所述高效低毒匹馬霉素衍生物的制備方法，其特征在于：以基因工程改 造菌株Streptomyces chattanoogensis QZOl發(fā)酵菌體為原料，經(jīng)菌體處理、有機(jī)試劑提 取、反相色譜柱層析及高效液相色譜分離獲得，具體步驟如下： A、 突變株QZOl的構(gòu)建：構(gòu)建P450單加氧酶基因 pimG的失活質(zhì)粒，并通過(guò)結(jié)合轉(zhuǎn)移失 活匹馬霉素工業(yè)高產(chǎn)菌株Streptomyces chattanoogensis LlO中的P450單加氧酶基因 pimG，得到突變株QZOl : B、 突變株QZOl的發(fā)酵培養(yǎng)：將突變株QZOl的孢子接種于種子培養(yǎng)基中，以220rpm轉(zhuǎn) 速、在30°C下、搖床培養(yǎng)24h，得種子培養(yǎng)液；然后將種子培養(yǎng)液按10%接種量接種于發(fā)酵 培養(yǎng)基中，以220rpm轉(zhuǎn)速、在30°C下、搖床培養(yǎng)5d，得發(fā)酵培養(yǎng)液； C、 菌體處理：將突變株QZOl的發(fā)酵培養(yǎng)液離心處理，收集發(fā)酵菌體，用水洗滌菌體3 次，去除洗滌液，將發(fā)酵菌體凍干； D、 有機(jī)試劑提?。簩龈傻陌l(fā)酵菌體用甲醇超聲提取3次，每次30min，離心獲得提取 液，提取液合并，減壓濃縮得到粗樣a ; E、 反相色譜柱層析：將粗樣a用重量比1. 5-3倍量的甲醇溶解，靜置，濾除沉淀物，然后 上樣于反相色譜柱層析，用體積比為〇 : 1?1 : 〇的甲醇水溶液進(jìn)行梯度洗脫，收集各部 分洗脫液，經(jīng)HPLC檢測(cè)，目標(biāo)化合物由I : 0配比的甲醇水溶液洗脫得到，濃縮目標(biāo)化合物 所在洗脫液，得粗樣b; F、 高效液相色譜分離：將粗樣b溶于少量甲醇中，經(jīng)高效液相色譜分離純化，得到匹馬 霉素衍生物。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于：步驟A所述的P450單加氧酶基因 PimG的失活是通過(guò)將基因 pimG的活性位點(diǎn)氨基酸Cys344突變?yōu)锳la實(shí)現(xiàn)的。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于：步驟B所述的種子培養(yǎng)基配方為葡 萄糖1. 75 %，胰蛋白胨1. 5 %，氯化鈉 I. 0 % ;發(fā)酵培養(yǎng)基配方為葡萄糖6. 0 %，酵母提取物 0.7%，黃豆餅粉2. 8%。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于：步驟E所述的用體積比為0 : 1? 1 : 0的甲醇水溶液進(jìn)行梯度洗脫，甲醇水溶液的體積比梯度依次為0 : 1、3 : 7、4 : 6、 6 : 4、1 : 0。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于：步驟F所述的高效液相色譜分離純 化是以甲醇與0.1%甲酸水溶液為流動(dòng)相，甲醇與0.1%甲酸水溶液的體積比為54 : 46,以 流速為3ml/min，250mmX10mm的BDS HYPERSIL C18反相半制備柱為固定相，紫外檢測(cè)器檢 測(cè)波長(zhǎng)為303nm，每次進(jìn)樣50?100 μ 1，收集對(duì)應(yīng)色譜峰，多次累加后蒸干。
7.權(quán)利要求1所述高效低毒匹馬霉素衍生物在制備抗真菌藥物及食品防腐劑中的應(yīng) 用。
【文檔編號(hào)】A23L3/3562GK104370984SQ201410589546
【公開日】2015年2月25日 申請(qǐng)日期:2014年10月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月28日
【發(fā)明者】白林泉, 齊震, 康前進(jìn), 姜春艷 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)