一種小麥轉(zhuǎn)化雙t超毒載體及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于作物遺傳育種領(lǐng)域，具體涉及一種小麥轉(zhuǎn)化雙T超毒載體及其應(yīng)用。所述的雙T超毒載體，是p1011-V，其序列如SEQ ID NO.7所示。本發(fā)明在現(xiàn)有的兩個(gè)載體進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果用計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行比對(duì)分析，利用同源重組(Homologous Recombination)技術(shù)將測(cè)序的兩個(gè)載體加以改造，構(gòu)建出一個(gè)新的適用于小麥遺傳轉(zhuǎn)化的新載體。使用該載體進(jìn)行的小麥遺傳轉(zhuǎn)化，可以在得到的陽(yáng)性植株的后代中篩選得到?jīng)]有標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)基因小麥，大大提高了轉(zhuǎn)基因小麥的安全性，為轉(zhuǎn)基因小麥的發(fā)展和推廣做出了一定的貢獻(xiàn)。
【專利說(shuō)明】一種小麥轉(zhuǎn)化雙T超毒載體及應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于作物遺傳育種領(lǐng)域，具體涉及一種小麥轉(zhuǎn)化雙T超毒載體。

【背景技術(shù)】
[0002] 1、小麥的育種目標(biāo)
[0003] 小麥（Triticum aestivum)是世界上總產(chǎn)量?jī)H次于玉米的第二大糧食作物，是人 類(lèi)的主食之一。隨著人口的急劇增長(zhǎng)、耕地面積的減少，提高小麥產(chǎn)量已成為全世界面臨 的一個(gè)嚴(yán)峻問(wèn)題。普通小麥（AABBDD，2n = 42)是異源六倍體植物，屬于禾本科小麥屬普 通小麥種（Triticum aestivum L·)，目前小麥育種的主要目標(biāo)仍然是高產(chǎn)、抗逆和優(yōu)質(zhì)， 分子標(biāo)記輔助選擇、外源優(yōu)良基因的應(yīng)用、多基因聚合是現(xiàn)代小麥育種研究熱點(diǎn)（何中虎 等，2006)。常規(guī)育種技術(shù)周期長(zhǎng)，種植資源發(fā)掘利用不夠，育種方法、手段在很大程度上依 賴經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｊ?，而通過(guò)基因工程手段，向栽培植物導(dǎo)入抗逆性的外源基因，已發(fā)展成為改良植 物抗脅迫的新途徑。20世紀(jì)60至70年代，人們就效仿細(xì)菌轉(zhuǎn)化方法開(kāi)展了植物轉(zhuǎn)基因的 嘗試。1983年，Zambryski首次用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得第一例轉(zhuǎn)基因植株，開(kāi)創(chuàng)了植物轉(zhuǎn) 基因的先河，標(biāo)志著植物轉(zhuǎn)基因時(shí)代的到來(lái)（Zambryski et al.，1983)。1985年，Horsch等 創(chuàng)立了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的"葉盤(pán)法"轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)，它大大簡(jiǎn)化了以往利用原生質(zhì)體為受體的轉(zhuǎn)基 因體系，具有里程碑的意義（Horsch et al.，1985)。1987年Sanford等發(fā)明了基因槍，該 實(shí)驗(yàn)室Klein首次將其用于植物轉(zhuǎn)基因研究（Klein et al.，1987)。它克服了當(dāng)時(shí)農(nóng)桿菌 介導(dǎo)法的受基因型和受體種類(lèi)的限制，開(kāi)創(chuàng)了植物轉(zhuǎn)基因方法的新領(lǐng)域。
[0004] 2、小麥轉(zhuǎn)化方法
[0005] 目前，植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)已成為植物分子生物學(xué)研究的強(qiáng)有力的手段，更是功能基 因組研究不可或缺的實(shí)驗(yàn)工具。小麥為異源六倍體植物，基因組大，基因調(diào)控困難，由小麥 外植體所誘導(dǎo)的愈傷組織普遍存在成愈率低、愈傷胚性差、分化率低、轉(zhuǎn)化細(xì)胞再生困難、 基因型依賴性大等問(wèn)題，是舉世公認(rèn)的最難轉(zhuǎn)化的栽培作物。目前，小麥遺傳轉(zhuǎn)化體系中， 所用的方法包括農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、基因槍轉(zhuǎn)化法、花粉管通道法、顯微注射法、激光微束穿刺 法、PEG法和電擊法等。但隨著基因槍法和農(nóng)桿菌法的不斷改善，它們已逐漸成為小麥轉(zhuǎn)化 的主要方法。
[0006] 3、農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法
[0007] 農(nóng)桿菌是普遍存在于土壤中的一種革蘭氏陰性細(xì)菌，能在自然條件下趨化性地感 染大多數(shù)雙子葉植物的受傷部位，并誘導(dǎo)產(chǎn)生冠癭瘤或發(fā)狀根。在植物基因工程的發(fā)展中， 研究和應(yīng)用比較清楚和成功的是根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens)介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn) 化。
[0008] 農(nóng)桿菌中存在一種環(huán)狀、大小約為150?200kb的質(zhì)粒（tumor-inducing plasmid, Ti質(zhì)粒），其上有一段T-DNA(transfer_DNA region)，是一種天然存在的遺傳轉(zhuǎn) 化體系。由于Ti質(zhì)粒的T-DNA攜帶生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素以及合成冠癭堿等基因，使得被根 癌農(nóng)桿菌侵染過(guò)的植物組織產(chǎn)生冠癭瘤，并合成大量冠癭堿，冠癭堿反過(guò)來(lái)促進(jìn)根癌農(nóng)桿 菌的繁殖和Ti質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移，從而擴(kuò)大侵染范圍。根據(jù)其誘導(dǎo)的植物細(xì)胞產(chǎn)生的冠癭瘤的 種類(lèi)，可以分為3種類(lèi)型：章魚(yú)堿型（octopine type)、胭脂堿型（nopaline type)和農(nóng)桿 堿型（琥拍堿型）（agropine type)。Ti質(zhì)粒上有兩個(gè)主要區(qū)域，即T-DNA區(qū)域和vir區(qū) (vir-region)，此外，還具有質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn)和冠癭堿分解代謝酶基因位點(diǎn)。T-DNA區(qū)，又稱T 區(qū)（T-region)，是Ti質(zhì)粒上可以整合進(jìn)入植物基因組的DNA片段，決定冠癭瘤的形態(tài)和冠 癭堿的合成。胭脂堿型根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒中的T-DNA的左右兩側(cè)是一段25bp的重復(fù)序列， 構(gòu)成了 T-DNA的邊界序列（border sequence),分別為左邊界（left border, LB)和右邊界 (right border，RB)，T-DNA依靠它們可以將攜帶的外源基因轉(zhuǎn)移并整合至植物基因組中。 由于轉(zhuǎn)移方向是由左自右，右邊界在T-DNA整合中對(duì)DNA結(jié)合位點(diǎn)的識(shí)別具有重要作用，因 此右邊界更為重要。vir區(qū)即毒性區(qū)，又稱致瘤區(qū)域，長(zhǎng)度約為35kb。它控制根癌農(nóng)桿菌附 著于植物細(xì)胞和Ti質(zhì)粒進(jìn)入細(xì)胞有關(guān)部位，與冠癭瘤的形成有關(guān)。vir區(qū)位于T-DNA區(qū)左 偵!|，包含6個(gè)毒性遺傳位點(diǎn)：￥；[^、￥；[池、￥；[1'0、￥；^0、￥；[吐以及￥；^6。￥；[1'基因決定了1'-0嫩 的加工和轉(zhuǎn)移過(guò)程。Onc基因（致癌），其在植物細(xì)胞中編碼細(xì)胞分裂素和植物生長(zhǎng)素，導(dǎo)致 受侵染的植物細(xì)胞無(wú)限增殖，此外，因 T-DNA不含編碼促進(jìn)自身轉(zhuǎn)移遺傳物質(zhì)的基因，故可 將Onc基因等不必要序列敲除，替換以需要轉(zhuǎn)化的目的基因，達(dá)到改良植物的目的。借助農(nóng) 桿菌的侵染實(shí)現(xiàn)外源基因向植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)移與整合，然后通過(guò)細(xì)胞和組織培養(yǎng)技術(shù)，再生 出轉(zhuǎn)基因植株，此即農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化（Agrobacterium-mediated transfermation)。
[0009] 植物細(xì)胞受傷后，細(xì)胞壁破裂，分泌物中含有高濃度的創(chuàng)傷誘導(dǎo)分子，如羥基乙酰 丁香酮（OH-AS)、乙酰丁香酮（AS)等酚類(lèi)化合物。根癌農(nóng)桿菌對(duì)這類(lèi)酚類(lèi)化合物具有趨化 性，待附著于植物細(xì)胞表面后，其Ti質(zhì)粒的vir基因被激活。VirA基因編碼感受蛋白，位 于細(xì)菌細(xì)胞膜疏水區(qū)，可接受環(huán)境中的信號(hào)分子，被最先激活表達(dá)。VirA基因被激活以后， 又激活了 VirG基因的表達(dá)，VirG蛋白經(jīng)磷酸化轉(zhuǎn)為活化狀態(tài)，進(jìn)而激活vir區(qū)其他基因的 表達(dá)。另外，一些小分子量的糖類(lèi)，如半乳糖、葡萄糖等，也能夠誘導(dǎo)激活vir區(qū)基因的表 達(dá)。VirD基因產(chǎn)物VirDl蛋白使得DNA從超螺旋轉(zhuǎn)變?yōu)樗沙谛蜖顟B(tài)，virD2蛋白切割已松 弛的T-DNA，使左右兩邊界產(chǎn)生缺口，T-DNA片段得以釋放。此外，游離的virE2蛋白與游離 的virDl/virD2-單鏈T-DNA核酸蛋白復(fù)合物結(jié)合，形成T-復(fù)合體，保護(hù)T-DNA不被植物細(xì) 胞內(nèi)的核酸酶降解。T-復(fù)合體經(jīng)預(yù)先形成的VirB蛋白通道，依次穿過(guò)根癌農(nóng)桿菌及植物細(xì) 胞的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，并在VirD蛋白的導(dǎo)向作用下，進(jìn)入受體細(xì)胞核，最終整合進(jìn)入植物 基因組中。
[0010] 1983年，第一株以農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因煙草問(wèn)世（Zambryski et al.，1983 ;喻修 道等，2010)。農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法簡(jiǎn)單、低廉且高效，很快成為了雙子葉植物基因轉(zhuǎn)化的主導(dǎo)方 法。但由于小麥?zhǔn)菃巫尤~植物，不是農(nóng)桿菌的天然宿主，故能否將該方法引入至小麥等單子 葉植物成為了上世紀(jì)90年代的研究熱點(diǎn)。Cheng等（1997)首次利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化以 小麥幼胚、預(yù)培養(yǎng)幼胚及胚性愈傷組織為受體材料，獲得了具有分子生物學(xué)證據(jù)的、穩(wěn)定的 轉(zhuǎn)基因小麥，并初步建立了一套以小麥幼胚及胚性愈傷組織為受體的技術(shù)體系。隨后，農(nóng)桿 菌介導(dǎo)的小麥轉(zhuǎn)化在其它實(shí)驗(yàn)室紛紛取得成功=Xia等（1999)以小麥幼胚及胚性愈傷組織 為受體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，成功獲得轉(zhuǎn)基因小麥植株；王永勤等（2002)則采用攜帶了 gus 和（或）bar基因的雙元表達(dá)載體的3種不同農(nóng)桿菌菌株對(duì)農(nóng)大170和農(nóng)大146的幼胚和 胚性愈傷組織進(jìn)行了轉(zhuǎn)化，得到大量具有PPT(草胺膦）抗性的愈傷和植株，其中，抗性愈傷 的⑶S染色陽(yáng)性率高達(dá)50% -60%，對(duì)抗性植株進(jìn)行PCR和Southern檢測(cè)證明，外源基因 已成功整合到植物基因組中；王翠亭等（2003)利用攜帶pC3301質(zhì)粒的超毒農(nóng)桿菌EHA105 對(duì)揚(yáng)麥158進(jìn)行了轉(zhuǎn)化，從294個(gè)小麥幼胚外植體中得到了 5株成苗，經(jīng)PCR和Southern blot分析，其中2株成苗整合了外源DNA，轉(zhuǎn)化率為0. 68%。
[0011] 農(nóng)桿菌介導(dǎo)法的優(yōu)點(diǎn)：（1)成功率高，效果好。該轉(zhuǎn)化系統(tǒng)是模仿或稱之為利用天 然的轉(zhuǎn)化載體系統(tǒng)，不管是用菌株接種整體植物的傷口，還是直接侵染離體培養(yǎng)細(xì)胞，通常 都可以獲得滿意的轉(zhuǎn)化；（2)在所有的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)中，Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化系統(tǒng)是機(jī)理研究得最清楚 的，方法最成熟，應(yīng)用也最廣泛；（3) Ti質(zhì)粒的T-DNA區(qū)可以容納相當(dāng)大的DNA片段插入，目 前已把長(zhǎng)達(dá)50kb的異源DNA序列通過(guò)T-DNA完整地轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞中；（4) T-DNA上含有 引導(dǎo)DNA轉(zhuǎn)移和整合的序列，以及能夠被高等植物細(xì)胞轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)識(shí)別的功能啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄 信號(hào)，使插入到T-DNA區(qū)的外源基因能夠隨同T-DNA -道在植物細(xì)胞中表達(dá)；（5)可根據(jù)人 們的需要連接不同的啟動(dòng)子，使外源基因能夠在再生植株的各種器官中特異性表達(dá)，例如 在果實(shí)中表達(dá)，在葉中表達(dá)，甚至僅在根中表達(dá)，即可進(jìn)彳丁人為地控制；(6)農(nóng)桿囷Ti質(zhì)粒 轉(zhuǎn)化系統(tǒng)轉(zhuǎn)化的外源基因以單拷貝為多數(shù)，遺傳穩(wěn)定性好，并且多數(shù)符合孟德?tīng)栠z傳規(guī)律， 因此轉(zhuǎn)基因植株能較好地為育種提供了中間選育材料。
[0012] 根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒載體系統(tǒng)作為一個(gè)植物基因轉(zhuǎn)化載體系統(tǒng)的不足之處是它主 要用于雙子葉植物，大多數(shù)單子葉植物不是農(nóng)桿菌的天然宿主，如何改進(jìn)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn) 化系統(tǒng)，擴(kuò)大其應(yīng)用范圍，一直是人們所關(guān)心問(wèn)題。
[0013] 4、篩選標(biāo)記基因
[0014] 轉(zhuǎn)基因過(guò)程中只有少數(shù)植物細(xì)胞能夠吸收外源DNA并整合進(jìn)植物細(xì)胞中，而大多 數(shù)細(xì)胞仍然是未轉(zhuǎn)化的（侯?lèi)?ài)菊等，2003)，因此研究者在受體植物中加上選擇性標(biāo)記用于 提高轉(zhuǎn)化效率。但是這些篩選標(biāo)記在轉(zhuǎn)化后一直保留在植物體內(nèi)，存在安全隱患。常用的 主要的篩選標(biāo)記基因是抗生素和除草劑抗性標(biāo)記基因（張楠，2007)。利用這些標(biāo)記基因的 選擇體系存在的潛在危害主要表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：①轉(zhuǎn)基因作物中的除草劑抗性基因 可能經(jīng)自然雜交傳遞到近緣野生雜草中，使現(xiàn)有的除草劑無(wú)法將雜草殺掉；②標(biāo)記基因擴(kuò) 散到環(huán)境中，可能造成生態(tài)失衡；③轉(zhuǎn)基因食品中的標(biāo)記基因及其產(chǎn)物可能對(duì)人或動(dòng)物的 健康有害；④標(biāo)記基因可能被轉(zhuǎn)移到人或動(dòng)物腸道寄生菌中而產(chǎn)生耐藥性，從而降低或喪 失某種抗生素的治療作用（王洪偉，2014)。
[0015] 解決篩選標(biāo)記帶來(lái)的安全隱患有兩方面：一是在轉(zhuǎn)基因后代中去除標(biāo)記基因，二 是開(kāi)發(fā)安全的篩選標(biāo)記基因。
[0016] 目前去除標(biāo)記基因的方法主要有：共轉(zhuǎn)化體系，位點(diǎn)特異性重組體系，轉(zhuǎn)座子系 統(tǒng)，同源重組體系。所謂的共轉(zhuǎn)化是指將不同的外源基因分別構(gòu)建到不同的載體或同一載 體的不同區(qū)段，將多種載體同時(shí)轉(zhuǎn)人同一受體細(xì)胞，篩選出共轉(zhuǎn)化植株。一種是轉(zhuǎn)化所 用的農(nóng)桿菌細(xì)胞含有兩個(gè)載體，分別攜帶目的基因和篩選標(biāo)記；第二種是一個(gè)質(zhì)粒含有兩 段T-DNA ;第三種是將基因構(gòu)建到不同的質(zhì)粒，獨(dú)立轉(zhuǎn)化到不同的農(nóng)桿菌中，將這幾種菌液 以一定的比例混合獲得轉(zhuǎn)化植株（陳揚(yáng)勛，2012)。定點(diǎn)重組系統(tǒng)是利用重組酶催化兩個(gè)短 的、特定的DNA序列間發(fā)生重組，以去除選擇標(biāo)記基因的遺傳操作系統(tǒng)。每個(gè)重組系統(tǒng)都 由2個(gè)主要組分組成：重組酶和特異性識(shí)別位點(diǎn)。其基本原理就是將選擇標(biāo)記基因置于特 異性識(shí)別位點(diǎn)之內(nèi)而將目的基因置于其外。當(dāng)轉(zhuǎn)基因植株同時(shí)或分別引入重組酶基因時(shí)， 重組酶就會(huì)切除、顛倒或交換特異性識(shí)別位點(diǎn)內(nèi)的DNA片段。轉(zhuǎn)座子是指一段特定的DNA序 列，它可以在染色體組內(nèi)移動(dòng)，從一個(gè)位點(diǎn)切除，插入到一個(gè)新的位點(diǎn)。把標(biāo)記基因和目 的基因分開(kāi)，子代植株通過(guò)遺傳分離，獲得僅帶目的基因的轉(zhuǎn)基因植株。基于以上原理， 轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)可被開(kāi)發(fā)用于轉(zhuǎn)化系統(tǒng)來(lái)培育安全的、無(wú)標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)基因植株。同源重組在 理論上就是在沒(méi)有重組酶活性的情況下，將標(biāo)記基因置于重復(fù)序列之間，通過(guò)重復(fù)序列的 同源重組作用去除標(biāo)記基因轉(zhuǎn)座子相連，在轉(zhuǎn)座子和標(biāo)記基因或目的基因一起移動(dòng)的過(guò) 程中，標(biāo)記基因和目的基因分開(kāi)，子代植株通過(guò)遺傳分離，獲得僅帶目的基因的轉(zhuǎn)基因植 株?；谝陨显恚D(zhuǎn)座子系統(tǒng)可被開(kāi)發(fā)用于轉(zhuǎn)化系統(tǒng)來(lái)培育安全的、無(wú)標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)基 因植株（倪斌，2007)。另外不同于傳統(tǒng)的細(xì)胞核轉(zhuǎn)基因技術(shù)的葉綠體基因工程也可以解決 轉(zhuǎn)基因植物標(biāo)記基因安全的。葉綠體基因工程是以葉綠體基因組為平臺(tái)對(duì)植物進(jìn)行遺傳操 作，通過(guò)一定方法是外源基因穿過(guò)細(xì)胞膜和葉綠體雙層膜進(jìn)入葉綠體，在同源重組片段的 介導(dǎo)下與葉綠體基因組之間發(fā)生同源重組，以定點(diǎn)整合方式進(jìn)入葉綠體基因組，在其中轉(zhuǎn) 錄翻譯并獲得終產(chǎn)物的技術(shù)。尤其可以防止外源基因通過(guò)花粉擴(kuò)散到非目標(biāo)植物中，造成 基因污染。原因是大多數(shù)植物的葉綠體基因組遵循母性遺傳機(jī)制，導(dǎo)入葉綠體基因組的外 源基因基本不會(huì)通過(guò)花粉擴(kuò)散，從而可以保證環(huán)境的安全性。
[0017] 安全的篩選標(biāo)記有：1.化合物解毒酶基因：這種標(biāo)記基因編碼的產(chǎn)物是酶，可催 化對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有毒的化合物轉(zhuǎn)變成無(wú)毒的化合物，從而使轉(zhuǎn)化細(xì)胞能在含有毒化合物的培 養(yǎng)基上生長(zhǎng)，而非轉(zhuǎn)化細(xì)胞則被殺死。例如：甜菜堿醛脫氫酶（BADH)基因。2.糖類(lèi)代謝酶 基因：PMI基因。3.綠色熒光蛋白基。4.天門(mén)冬氨酸激酶
[0018] 5、同源重組技術(shù)
[0019] 同源重組（Homologus Recombination)是指發(fā)生在姐妹染色單體（sister chromatin)之間或同一染色體上含有同源序列的DNA分子之間或分子之內(nèi)的重新組合。 同源重組需要一系列的蛋白質(zhì)催化，如原核生物細(xì)胞內(nèi)的RecA、RecB⑶、RecF、RecO、RecR 等；以及真核生物細(xì)胞內(nèi)的Rad51、Mrell_Rad50等等。同源重組反應(yīng)通常根據(jù)交叉分子或 Holliday結(jié)構(gòu)（Holliday Juncture Structure)的形成和拆分分為三個(gè)階段，即前聯(lián)會(huì)體 階段、聯(lián)會(huì)體形成和Holiday結(jié)構(gòu)的拆分。同源重組可以雙向交換DNA分子，也可以單向轉(zhuǎn) 移DNA分子，后者又被稱為基因轉(zhuǎn)換（Gene Conversion)。由于同源重組嚴(yán)格依賴分子之間 的同源性，因此，原核生物的同源重組通常發(fā)生在DNA復(fù)制過(guò)程中，而真核生物的同源重組 則常見(jiàn)于細(xì)胞周期的S期之后。
[0020] 基因重組分為同源重組和位點(diǎn)專一性重組。同源重組是更為普遍的一種重組機(jī) 制，它可以發(fā)生在任何兩種具有相同或相似序列之間，涉及到兩個(gè)DNA分子在相同區(qū)域的 斷裂和重新連接。將生物細(xì)胞內(nèi)的這種重組機(jī)制拿到生物細(xì)胞外進(jìn)行運(yùn)用，只要有同源序 列我們就可以對(duì)任意的載體或序列進(jìn)行改造。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0021] 為了解決現(xiàn)有技術(shù)存在的問(wèn)題，本發(fā)明將現(xiàn)有的用于小麥遺傳轉(zhuǎn)化的載體以及用 于水稻遺傳轉(zhuǎn)化的雙T載體測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果用計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行比對(duì)分析，利用同源重組 (Homologous Recombination)技術(shù)將測(cè)序的兩個(gè)載體加以改造，構(gòu)建出一個(gè)新的適用于小 麥遺傳轉(zhuǎn)化的新載體。使用該載體進(jìn)行的小麥遺傳轉(zhuǎn)化，可以在得到的陽(yáng)性植株的后代中 篩選得到?jīng)]有標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)基因小麥，大大提高了轉(zhuǎn)基因小麥的安全性。
[0022] 本發(fā)明所述的小麥轉(zhuǎn)化雙T超毒載體，其結(jié)構(gòu)如圖3所示，其序列如SEQ ID NO. 7。 是以PYH592為骨架，在pVSl-STA與T-DNA left border之間插入VirG而獲得。
[0023] 本發(fā)明利用同源重組技術(shù)獲得了用于小麥轉(zhuǎn)基因的含有兩段T-DNA的超毒載體1 個(gè)。
[0024] 本發(fā)明所獲得的小麥轉(zhuǎn)化用載體，能夠?qū)⒑Y選標(biāo)記和目的基因分別插入不同的 T-DNA中，使其在后代染色體重組的過(guò)程中，篩選得到只含有目的基因的轉(zhuǎn)基因小麥，成功 的去除掉篩選標(biāo)記帶來(lái)的轉(zhuǎn)基因安全問(wèn)題，為轉(zhuǎn)基因小麥的發(fā)展和推廣做出了一定的貢 獻(xiàn)。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0025] 圖I. VirG區(qū)和載體克隆產(chǎn)物。
[0026] (Ml :DL5000, M2 :DL15000,1 :PCR 載體產(chǎn)物，2 :PCR 基因產(chǎn)物）。
[0027] 圖2.菌落PCR產(chǎn)物。
[0028] (M :DL5000 ;1、2 :PCR 擴(kuò)增得到的 DNA 片段）。
[0029] 圖3.本發(fā)明PlOll-V質(zhì)粒圖譜。
[0030] 圖 4. BanH I，Kpn I 雙酶切結(jié)果。
[0031] (M1:15000，M2:DL2000, 1:質(zhì)粒 pYH592,2、3、4 :質(zhì)粒 pYH592 雙酶切，5 :質(zhì)粒 ZmXERICO, 6、7、8:質(zhì)粒 ZmXERICO 雙酶切）
[0032] 圖5.連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌落PCR結(jié)果。
[0033] (M :DL2000, 1、2、3 :菌落 PCR 產(chǎn)物）
[0034] 圖6. p 10Il-V-ZmXERICO轉(zhuǎn)化揚(yáng)麥14的再生苗。

【具體實(shí)施方式】
[0035] 實(shí)施例1 :
[0036] 一、實(shí)驗(yàn)材料
[0037] 質(zhì)粒pYH592(于恒秀，無(wú)抗性選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)基因軟米和糯稻新品系的選育及中間 試驗(yàn)，作物學(xué)報(bào)，2009, 35 (6) :967-973)，pYN203(高營(yíng)營(yíng)，2013)(高營(yíng)營(yíng)，抗性相關(guān)基因 轉(zhuǎn)化小麥的研究[D]，揚(yáng)州大學(xué)，2013)，DH5a大腸桿菌感受態(tài)，同源重組酶：Exna Se TM II (Vazyme)
[0038] 二、質(zhì)粒DNA的提取
[0039] (1)分別挑取含PYH592以及含pYN203的陽(yáng)性菌落接種于含有卡那霉素的2ml 2XYT液體培養(yǎng)基中，37°C搖菌12?16h。
[0040] (2)柱平衡步驟：向吸附柱CP3中加入500ul的平衡液BL，12000rpm離心lmin，倒 掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中
[0041] (3)取l-5ml菌液，加入離心管中，4°C，12000rpm離心lmin，盡量吸除上清。
[0042] (4)向留有菌體沉淀的離心管中加入250ul溶液Pl，使用移液器徹底懸浮菌液。
[0043] (5)向離心管中加入250ul溶液P2,溫和地上下翻轉(zhuǎn)6-8次使菌體充分裂解。
[0044] (6)向離心管中加入350ul溶液P3,立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)6-8次，充分混勻，此時(shí) 出現(xiàn)白色絮狀沉淀。12000rpm離心lOmin。
[0045] (7)取上清液轉(zhuǎn)移到吸附柱CP3中，盡量不要吸出沉淀，12000rpm離心lmin，倒掉 收集管中的廢液，將吸附柱CP3放入收集管中。
[0046] (8)向吸附柱CP3中加入600ul漂洗液PW，12000rpm離心Imin,倒掉收集管中的 廢液，將吸附柱CP3放入收集管中。
[0047] (9)重復(fù)操作步驟8。
[0048] (10)將吸附柱CP3放入收集管中，12000rpm離心2min,將吸附柱中殘余的漂洗液 去除。
[0049] (12)將吸附柱CP3置于一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位滴加50-lOOul 洗脫緩沖液EB，室溫放置2min，12000rpm離心2min將質(zhì)粒溶液pYH592和pYN203收集到 I. 5ml的離心管中。
[0050] 三、分析序列，設(shè)計(jì)同源引物
[0051] 根據(jù)同源重組技術(shù)的要求，針對(duì)載體和目的片段兩端的序列分別設(shè)計(jì)兩對(duì)引物。 一對(duì)是 VirG 區(qū)克隆引物：VirG-F:CATTACGCCATGAACAATTGTAGAAACGCAAA(SEQ ID NO. 1)
[0052] VirG-R:CCAGCGGCGGCGCTCATGCAAGTAGCGTATG(SEQ ID NO. 2)
[0053] 其從質(zhì)粒YN203上擴(kuò)增得到長(zhǎng)度為1331bp的片段（VirG)，其序列如SEQ ID NO. 5 所示。
[0054] 另一對(duì)是載體克隆引物：
[0055] pYH592-F:GAGCGCCGCCGCTGGCCTGCTGGGCTATG(SEQ ID NO. 3)
[0056] pYH592-R:TTGTTCATGGCGTAATGTCTCCGGTTC(SEQ ID NO. 4)
[0057] 其從pYH592上擴(kuò)增長(zhǎng)度為12448bp的載體，其序列如SEQ ID NO. 6所示。
[0058] 四、PCR 擴(kuò)增
[0059] 用PhantaTM Super Fidelity DNA Polymerase(Vazyme，P5Ol-Ol)，VirG_F、VirG-R 為引物，從質(zhì)粒YN203上擴(kuò)增1331bp的VirG片段，其擴(kuò)增后的電泳結(jié)果見(jiàn)圖1，膠回收備 用。其擴(kuò)增體系和擴(kuò)增程序見(jiàn)表1和表2。
[0060] 表I VirG片段PCR反應(yīng)體系
[0061]

【權(quán)利要求】
1. 小麥轉(zhuǎn)化用的雙T超毒載體plOll-V，其特征在于其序列如SEQ ID NO. 7所示。
2. 如權(quán)利要求1所述的雙T超毒載體plOll-V，其特征在于，是以pYH592為骨架，在 pVSl-STA與T-DNA left border之間插入VirG而獲得，所述VirG的序列如SEQ ID N0.5 所示。
3. 權(quán)利要求1所述的雙T超毒載體plOll-V在小麥轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用，是篩選得到只含有 目的基因的轉(zhuǎn)基因小麥，去除掉篩選標(biāo)記。
【文檔編號(hào)】C12N15/82GK104388462SQ201410579104
【公開(kāi)日】2015年3月4日 申請(qǐng)日期:2014年10月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月24日
【發(fā)明者】陳建民, 陳云, 高勇, 劉霜, 劉慧君 申請(qǐng)人:揚(yáng)州大學(xué)