用于獼猴桃雜交群體雌雄性別鑒定的ssr分子標(biāo)記a002的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于獼猴桃雜交群體雌雄性別鑒定的SSR分子標(biāo)記A002，涉及分子遺傳育種【技術(shù)領(lǐng)域】。本分子標(biāo)記A002的雄株特異片段核苷酸序列如SEQ.ID No1所示；雌株特異片段核苷酸序列如SEQ.ID No2所示；所述SSR分子標(biāo)記A002標(biāo)記的引物序列如SEQ.ID No3和SEQ.ID No4所示。本分子標(biāo)記A002可用于獼猴桃雌雄性別的早期鑒定檢測，避免大量雄株在育種和生產(chǎn)中造成極大的浪費(fèi)；利用高密度遺傳圖譜，能快速發(fā)掘性別相關(guān)的分子標(biāo)記用于輔助育種，為功能標(biāo)記的開發(fā)提供了重要的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)；本分子標(biāo)記A002用于雌雄性別標(biāo)記輔助選擇，將大大提高育種中雌株的選擇效率，縮短育種周期，具有很大的應(yīng)用潛力和較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
【專利說明】用于獼猴桃雜交群體雌雄性別鑒定的SSR分子標(biāo)記A002

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子遺傳育種【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種用于獼猴桃雜交群體雌雄性別 鑒定的SSR分子標(biāo)記A002 (A002是為區(qū)別其它SSR分子標(biāo)記而命名的，A為獼猴桃拉丁名 的首字母)，即用于獼猴桃幼苗雌雄性別性狀的早期分子輔助選擇，以提高育種 效率，減少土地和人力成本。

【背景技術(shù)】
[0002] 稱猴桃Planch.)富含果實(shí)維生素 C、膳食纖維和多種礦物 營養(yǎng)，被譽(yù)為"水果之王"，是一種有益健康的新興高檔水果。隨著人民生活水平的迅速提 高，對高品質(zhì)和新品種獼猴桃的需求顯著增加，獼猴桃育種效率亟待提升。獼猴桃為功能性 雌雄異株植物，具有花形態(tài)相似但雌雄器官相異的雌花和雄花。獼猴桃雜交后代的雌雄分 離比例約為1 :1，鑒于獼猴桃雌雄異株的性別功能，獼猴桃果園通常配置少量授粉雄株以 保證果園產(chǎn)量和果實(shí)品質(zhì)，剩余的雄株則除掉。作為多年生果樹，獼猴桃在傳統(tǒng)育種中面臨 著童期長、占地面積大等問題。獼猴桃幼苗往往下地種植數(shù)年后才能開花，利用獼猴桃花形 態(tài)結(jié)構(gòu)的差異方能鑒別植株的雌雄性別，因此在開花前的數(shù)年內(nèi)大量的不結(jié)果雄株給育種 工作造成了極大的浪費(fèi)。由于缺乏可用的獼猴桃雌雄性別鑒別的分子標(biāo)記，獼猴桃植株的 早期性別鑒定工作一直難以開展。SSR標(biāo)記具高多態(tài)性、位點(diǎn)特異性、穩(wěn)定性高和操作程序 簡單等優(yōu)勢，是一種檢測方便的共顯性遺傳標(biāo)記。結(jié)合遺傳學(xué)和基因組學(xué)研究成果，開展獼 猴桃分子標(biāo)記輔助育種研究，構(gòu)建經(jīng)濟(jì)、高效的分子育種技術(shù)體系，已經(jīng)成為獼猴桃育種的 重要研究方向。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺點(diǎn)和不足，提供一種用于獼猴桃雜交群 體雌雄性別鑒定的SSR分子標(biāo)記A002。
[0004] 具體要求是： 篩選出用于獼猴桃早期性別鑒定的分子標(biāo)記A002 ; 提供上述分子標(biāo)記A002的獲得方法； 提供上述分子標(biāo)記在獼猴桃性別鑒定以及標(biāo)記輔助育種中的應(yīng)用。
[0005] 本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的： 利用獼猴桃高密度遺傳圖譜，定位花性別表型性狀位點(diǎn)，在性別決定區(qū)間篩選SSR標(biāo) 記，最終得到能用于獼猴桃早期性別鑒定的分子標(biāo)記，形成本項(xiàng)發(fā)明的技術(shù)方案。獼猴桃植 株早期性別鑒定在很大程度減少育種前期在土地、生產(chǎn)資料和人力成本的浪費(fèi)，有著重要 的理論學(xué)術(shù)意義和較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
[0006] 一、分子標(biāo)記AO〇2 用于獼猴桃雜交群體雌雄性別鑒定的SSR分子標(biāo)記A002 (簡稱分子標(biāo)記A002)，其雄 株擴(kuò)增得到的特異片段核苷酸序列如SEQ. ID Nol所示；其雌株擴(kuò)增得到的特異片段核苷 酸序列如SEQ. ID No2所示。
[0007] 分子標(biāo)記是基于獼猴桃性別決定區(qū)域的簡單重復(fù)序列多態(tài)性開發(fā)的。根據(jù)性別相 關(guān)區(qū)域的序列信息設(shè)計(jì)特異性引物，分子標(biāo)記A002的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物表現(xiàn)為雄株和雌株各擴(kuò) 增得到兩條譜帶，其中一條譜帶片段大小相同。雄株擴(kuò)增得到的特異譜帶大小為219bp，特 異片段核苷酸序列如SEQ. ID Nol所示；雌株擴(kuò)增得到的特異譜帶大小為230bp，特異片段 核苷酸序列如SEQ. ID N〇2所示。通過特異片段的大小和特異核苷酸序列可以區(qū)分獼猴桃 雌雄性別。
[0008] 本發(fā)明還提供了擴(kuò)增上述分子標(biāo)記的引物。
[0009] 所述SOOl標(biāo)記的引物序列如SEQ. ID No3和SEQ. ID No4所示。
[0010] 二、分子標(biāo)記A002獲得方法 分子標(biāo)記A002獲得方法包括下列步驟： ① 構(gòu)建獼猴桃高密度遺傳圖譜； ② 收集性別表型轉(zhuǎn)換為表型標(biāo)記； ③ 在遺傳圖譜上定位表型標(biāo)記； ④ 在基因組序列上確定性別決定區(qū)間； ⑤ 篩選性別決定區(qū)間內(nèi)SSR標(biāo)記。
[0011] 其工作機(jī)理是： 基因組中存在許多簡單序列重復(fù)（SSR)單元，其數(shù)目存在高度變異。由于特定的SSR 的側(cè)翼序列通常都是保守性較強(qiáng)的單一序列，因而可以根據(jù)側(cè)翼序列合成引物進(jìn)行PCR擴(kuò) 增，從而將單個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)擴(kuò)增出來。由于單個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)重復(fù)單元在數(shù)量上的變異，個(gè)體 的擴(kuò)增產(chǎn)物就產(chǎn)生長度的多態(tài)性，以此來檢測等位基因的多態(tài)性。
[0012] 二、分子標(biāo)記A002應(yīng)用 分子標(biāo)記A002在山梨獼猴桃和中華獼猴桃'桂海4號'雜交群體中的應(yīng)用 利用上述分子標(biāo)記A002的引物擴(kuò)增獼猴桃雜交群體中雌株基因組DNA和雄株基因組 DNA，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物表現(xiàn)為雄株和雌株各擴(kuò)增得到兩條譜帶，其中一條譜帶片段大小相同。雄 株擴(kuò)增得到的特異片段核苷酸序列如SEQ. ID Nol所示；雌株擴(kuò)增得到的特異片段核苷酸 序列如SEQ. ID No2所示。通過特異片段的大小和特異核苷酸序列可以鑒定獼猴桃雌雄性 別。
[0013] 在分子標(biāo)記A002引物擴(kuò)增獼猴桃基因組DNA中，PCR反應(yīng)擴(kuò)增體系為： 1〇4 1^反應(yīng)體系包括正、反向引物各0.2 4]?，0.21111(1階1^，211111%(：12，14 11(^丁&9 buffer，0.5 units Taq 聚合酶，50ng DNA 模板。
[0014] 在分子標(biāo)記引物擴(kuò)增獼猴桃基因組DM中，PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?95°C預(yù)變性5min ;95°C變性30s，58 °C退火35s，72°C延伸50s，33個(gè)循環(huán)；72°C延伸 5-10min〇
[0015] PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用聚丙烯酰胺凝膠電泳（8 % )。
[0016] 本發(fā)明具有下列優(yōu)點(diǎn)和積極效果： ① 本分子標(biāo)記A002可用于獼猴桃雌雄性別的早期鑒定檢測，避免大量雄株在育種和 生產(chǎn)中造成極大的浪費(fèi)； ② 利用高密度遺傳圖譜，能快速發(fā)掘性別相關(guān)的分子標(biāo)記用于輔助育種，為功能標(biāo)記 的開發(fā)提供了重要的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)； ③本分子標(biāo)記A002用于雌雄性別標(biāo)記輔助選擇，將大大提高育種中雌株的選擇效率， 縮短育種周期，具有很大的應(yīng)用潛力和較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0017] 圖1為本分子標(biāo)記A002在第9個(gè)連鎖群上的示意圖； 圖2為本分子標(biāo)記A002在群體篩選中擴(kuò)增的聚丙烯凝膠電泳圖； 圖3為本分子標(biāo)記A002在雜交群體雌株和雄株中擴(kuò)增的聚丙烯凝膠電泳圖之一； 圖4為本分子標(biāo)記A002在雜交群體雌株和雄株中擴(kuò)增的聚丙烯凝膠電泳圖之二； 英譯漢 l、SSR(Simple Sequence Repeats)標(biāo)記：是近年來發(fā)展起來的一種以特異引物PCR為 基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù)，也稱為微衛(wèi)星DNA (Microsatellite DNA)，是一類由幾個(gè)核苷酸(一 般為1?6個(gè)）為重復(fù)單位組成的長達(dá)幾十個(gè)核苷酸的串聯(lián)重復(fù)序列。
[0018] 2、PCR :Polymerase Chain Reaction,聚合酶鏈反應(yīng)，是80年代中期發(fā)展起來的體 外核酸擴(kuò)增技術(shù)。

【具體實(shí)施方式】
[0019] 下面結(jié)合附圖和實(shí)施例詳細(xì)說明： 若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。
[0020] -、分子標(biāo)記A002的獲得 試驗(yàn)地點(diǎn)：中國湖北省大悟縣；試驗(yàn)時(shí)間：2014年4月 材料：試驗(yàn)選用174份'山梨'和'桂海4號'雜交群體為獼猴桃分子遺傳研究的群體， 其中包括87份獼猴桃雄株和87份獼猴桃雌株。山梨(A 獼猴桃維生素 C含量極 低，抗寒、耐儲(chǔ)，果柄基部不生成離層，具有越冬不落果的特性。'桂海四號'認(rèn) cv. 'GuiHai No. 4'）維生素 C含量高，適應(yīng)性廣，抗逆性強(qiáng)，耐高溫干旱，且抗炭疽病、日灼 病的能力強(qiáng)，感病率低。
[0021] ①構(gòu)建獼猴桃高密度遺傳圖譜 利用具有各自優(yōu)良性狀且遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)的'山梨'和'桂海四號'構(gòu)建雜交群體?；?第二代測序的RAD-seq技術(shù)，對基因組進(jìn)行簡化測序，快速檢測親本及分離群體的SNP基因 型，構(gòu)建基因型數(shù)據(jù)庫；運(yùn)用JoinMap 4. 1作圖軟件構(gòu)建獼猴桃的高密度遺傳連鎖圖譜。
[0022] ②收集性別表型轉(zhuǎn)換為表型標(biāo)記 調(diào)查收集雜交群體中各單株的雌雄性別，建立性別表型數(shù)據(jù)庫，將雌株和雄株的性別 表型轉(zhuǎn)換為一個(gè)表型分子標(biāo)記。
[0023] ③在遺傳圖譜上定位表型標(biāo)記 結(jié)合基因型SNP標(biāo)記和表型分子標(biāo)記，運(yùn)用JoinMap 4. 1作圖軟件將性別表型標(biāo)記定 位在遺傳連鎖圖上的第9號連鎖群上(見圖1)。
[0024] ④在基因組序列上確定性別決定區(qū)間 整理性別表型標(biāo)記附近的SNP分子標(biāo)記A002,將SNP標(biāo)記A002的核苷酸序列比對到獼 猴桃基因組序列；比對結(jié)果顯示性別表型標(biāo)記鄰近的SNP標(biāo)記均來自于第25號染色體上， 具體位置在2Mb附近；因此，將獼猴桃性別相關(guān)區(qū)段鎖定在第25號染色體的I. 5-2. 5Mb區(qū) 間內(nèi)。
[0025] ⑤篩選性別決定區(qū)間內(nèi)SSR標(biāo)記A002 提取獼猴桃基因組第25號染色體上I. 5-2. 5Mb區(qū)間的核苷酸序列，搜索到有功能的簡 單重復(fù)序列30個(gè)；利用Primerf. 0軟件，針對簡單重復(fù)序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物；利用設(shè)計(jì)合成 的引物，對獼猴桃雌株和雄株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，摸索合適的擴(kuò)增條件，保證擴(kuò)增條帶的清晰度 和穩(wěn)定性；篩選得到本分子標(biāo)記能在雄株和雌株中各擴(kuò)增得到一條特征譜帶(見圖2)。
[0026] 二、分子標(biāo)記A002的應(yīng)用 1、分子標(biāo)記在山梨獼猴桃和中華獼猴桃'桂海4號'雜交群體中的應(yīng)用之一 采集中國湖北省大悟縣山梨獼猴桃和中華獼猴桃'桂海4號'雜交群體中87份雌株和 87份雄株的嫩葉片，提取植株基因組DNA;采用分子標(biāo)記引物SEQ. ID N〇3和SEQ. ID N〇4對 174份獼猴桃DNA樣本進(jìn)行擴(kuò)增。
[0027] PCR反應(yīng)擴(kuò)增體系為：10yL反應(yīng)體系包括正、反向引物各0. 2μΜ，0. 2mM dNTPs， 2mM MgCl2, 1μ I IOX Taq buffer，。· 5 units Taq 聚合酶，50ng DNA 模板； PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5°C預(yù)變性5min;95°C變性30s，58 °C退火35s，72°C延伸50s，33個(gè) 循環(huán)；72°C延伸5-10min。174份樣本均擴(kuò)增到兩條譜帶，其中一條為雌雄株共有譜帶。在 所有的87份雄株中，均得到雄株特異擴(kuò)增譜帶（SEQ. ID Nol);在所有的87份雌株中，均得 到雌株特異擴(kuò)增譜帶（SEQ. ID N〇2);圖3顯示了本分子標(biāo)記在雜交群體雌株和雄株中擴(kuò)增 的聚丙烯凝膠電泳圖。
[0028] 鑒定結(jié)果：

【權(quán)利要求】
1. 一種用于獼猴桃雜交群體雌雄性別鑒定的SSR分子標(biāo)記A002,其特征在于： 雄株特異片段核苷酸序列如SEQ. ID Nol所示； 雌株特異片段核苷酸序列如SEQ. ID N〇2所示； 所述SSR分子標(biāo)記A002的引物序列如SEQ. ID No3和SEQ. ID No4所示。
2. 按權(quán)利要求I所述的SSR分子標(biāo)記A002的獲得方法，其特征在于包括下列步驟： ① 構(gòu)建獼猴桃高密度遺傳圖譜； ② 收集性別表型轉(zhuǎn)換為表型標(biāo)記； ③ 在遺傳圖譜上定位表型標(biāo)記； ④ 在基因組序列上確定性別決定區(qū)間； ⑤ 篩選性別決定區(qū)間內(nèi)SSR標(biāo)記。
3. 按權(quán)利要求1所述的SSR分子標(biāo)記A002的應(yīng)用，其特征在于： 分子標(biāo)記在山梨獼猴桃和中華獼猴桃'桂海4號'雜交群體中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12Q1/68GK104313019SQ201410524999
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年9月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月30日
【發(fā)明者】黃宏文, 張瓊, 鐘彩虹, 龔俊杰, 劉春燕 申請人:中國科學(xué)院武漢植物園