一種新的轉(zhuǎn)基因地衣芽孢桿菌檢測試劑盒及其檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明名稱為“一種新的轉(zhuǎn)基因地衣芽孢桿菌檢測試劑盒及其檢測方法”，涉及轉(zhuǎn)基因微生物檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，本發(fā)明通過巧妙地設(shè)計(jì)針對轉(zhuǎn)基因地衣芽孢桿菌序列的帶標(biāo)記引物和探針，結(jié)合PCR擴(kuò)增和核酸試紙條檢測技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了轉(zhuǎn)基因地衣芽孢桿菌的高效快速檢測。該方法特異性強(qiáng)，靈敏度高和穩(wěn)定性好，對于提高轉(zhuǎn)基因地衣芽孢桿菌的準(zhǔn)確性、縮短檢測時(shí)間具有重要的作用。本檢測試劑盒使用方便快捷，節(jié)約成本和時(shí)間，原理和操作簡單，可用于快速檢測轉(zhuǎn)基因地衣芽孢桿菌。
【專利說明】一種新的轉(zhuǎn)基因地衣芽孢桿菌檢測試劑盒及其檢測方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因微生物檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，提供了一種利用PCR擴(kuò)增和核酸試紙條 技術(shù)相結(jié)合的快速檢測轉(zhuǎn)基因地衣芽孢桿菌的試劑盒，適用于轉(zhuǎn)基因地衣芽孢桿菌的快速 檢測。

【背景技術(shù)】
[0002] 地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis)，屬于芽孢桿菌目、芽孢桿菌科、芽孢桿 菌屬的一種細(xì)菌，是一種在土壤中常見的革蘭氏陽性嗜熱細(xì)菌。地衣芽孢桿菌可用于生物 洗衣粉中的堿性蛋白酶，是一種重要的工業(yè)用菌種。
[0003] 隨著地衣芽孢桿菌菌株全基因組，細(xì)菌基因功能的發(fā)現(xiàn)、改在技術(shù)越來越發(fā)達(dá)，目 前酶制劑產(chǎn)品中的轉(zhuǎn)基因地衣芽孢桿菌檢測的技術(shù)還是主要依靠傳統(tǒng)分離培養(yǎng)的形態(tài)學(xué) 檢測方法，檢測靈敏度低，通常需要幾天時(shí)間。近些年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展， PCR技術(shù)成了快速檢測的常用手段。但是PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測需要電泳、紫外凝膠成像，步 驟多，耗時(shí)長，而且存在溴化乙錠這種核酸染色劑環(huán)境不友好的問題。
[0004] 本研究通過巧妙地設(shè)計(jì)針對轉(zhuǎn)基因地衣芽孢桿菌的帶標(biāo)記的特異性引物和探針， 應(yīng)用PCR擴(kuò)增和核酸試紙條檢測技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了轉(zhuǎn)基因地衣芽孢桿菌的高效快速檢測。該方 法特異性強(qiáng)，靈敏度高和穩(wěn)定性好，對于提高轉(zhuǎn)基因地衣芽孢桿菌檢測的準(zhǔn)確性、縮短檢測 時(shí)間具有重要的作用。。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明需要解決的技術(shù)問題是提供用于檢測轉(zhuǎn)基因地衣芽孢桿菌的兩套特異性 引物和探針。
[0006] 本發(fā)明用于檢測轉(zhuǎn)基因地衣芽孢桿菌的兩套PCR引物及探針序列為：

【權(quán)利要求】
1. 在兩套用于轉(zhuǎn)基因地衣芽孢桿菌檢測的特異性引物和探針，其特征在于，序列為：
2. -種用于檢測轉(zhuǎn)基因地衣芽孢桿菌的試劑盒其特征在于，包括如下成分： (1) 陽性對照轉(zhuǎn)基因地衣芽孢桿菌DNA模板和陰性對照野生型地衣芽孢桿菌DNA模板 (2) 轉(zhuǎn)基因地衣芽孢桿菌AprL、MprL上下游特異引物和探針
(3) IOXTaq PCR Buffer，ddH20，2. 5 mM dNTP，5 U/ii I Taq 酶 (4) 生物素（Biotin)、熒光素（Fitc)抗原標(biāo)記的薄膜層析試紙條。
3. -種轉(zhuǎn)基因地衣芽孢桿菌的快速檢測方法，包括如下步驟： (1) PCR反應(yīng)體系：
PCR反應(yīng)條件：94 °C預(yù)變性I min，94 °C變性30 s，58 °C退火30 s，72 °C延伸30 s, 30個(gè)循環(huán)，72 °C延伸5 min (2) 探針雜交：擴(kuò)增結(jié)束后，加入探針（IOii mol/L) 2 iil，94 °C變性30 s，60 °C退火 30 s (3) 判定結(jié)果：用AprUMprL兩套特異引物探針進(jìn)行擴(kuò)增、雜交，PCR產(chǎn)物用試紙條檢 測，兩套引物、探針控制線正常，檢測線都呈現(xiàn)陽性時(shí)，則說明該樣品含有轉(zhuǎn)基因地衣芽孢 桿菌，若有一套或兩套引物、探針試紙條檢測結(jié)果顯示為陰性，則判定樣品中沒有轉(zhuǎn)基因地 衣芽孢桿菌。
【文檔編號】C12N15/11GK104212906SQ201410484724
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2014年9月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月22日
【發(fā)明者】張?jiān)＞? 賀艷, 趙瑾源, 劉躍庭, 趙衛(wèi)東 申請人:天津出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物與食品檢測中心