一種重組腺相關(guān)病毒rAAV載體的分離純化方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種重組腺相關(guān)病毒載體(rAAV)的分離純化方法，通過添加磷灰石色譜中的鈣離子，有效地改善磷灰石色譜對(duì)rAAV載體的結(jié)合與分離能力，通過所述方法獲得的病毒載體，其純度與二次氯化銫離心方法相當(dāng)，并具有體內(nèi)外生物活性，該方法純化的重組腺相關(guān)病毒載體有望用于基因治療。
【專利說明】-種重組腺相關(guān)病毒rAAV載體的分離純化方法

【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明涉及用于基因治療的重組腺相關(guān)病毒載體rAAV的分離純化。

【背景技術(shù)】：
[0002] 將目的基因?qū)氚屑?xì)胞，糾正先天基因缺陷或者合成具有治療作用的蛋白， 從而達(dá)到預(yù)防或治療疾病的目的，是基因治療的重要手段。病毒載體因能介導(dǎo)外源基 因長期表達(dá)而廣受關(guān)注。目前較為常用病毒載體有逆轉(zhuǎn)錄病毒（Retrovirus)、慢病毒 (Lentivirus)、腺病毒（Adenovirus)和腺相關(guān)病毒（Adeno-associated virus，AAV)等[許 瑞安等，《分子基因藥物學(xué)》，北京大學(xué)出版社&北京大學(xué)醫(yī)學(xué)出版社，2008,北京]。
[0003] AAV是無包膜單鏈DNA病毒，屬于細(xì)小病毒家族，包含4. 7kb的單鏈DNA基因，是復(fù) 制依賴型病毒，要在與輔助病毒如腺病毒或單純皰疹病毒與其同時(shí)存在時(shí)才能在宿主細(xì)胞 中復(fù)制、包裝，產(chǎn)生新的病毒顆粒。AAV具有廣泛的宿主范圍，在人類和其他動(dòng)物體的感染是 無癥狀的，并且沒有致病性，可以轉(zhuǎn)染分裂或者非分裂細(xì)胞的廣泛哺乳動(dòng)物細(xì)胞。AAV在體 內(nèi)具有特定的組織分布，并且在體內(nèi)可以長期表達(dá)。目前，已發(fā)現(xiàn)其有13種亞型及120多種 變型。不同的亞型在人體內(nèi)具有不同的器官靶向性，不同亞型的AAV在不同器官中表達(dá)蛋 白的效率是不同的，這就為基因治療的器官或組織特異性表達(dá)提供了可能。研究表明，AAV1 可以高效轉(zhuǎn)導(dǎo)骨骼肌和其他組織，AAV2可以廣泛轉(zhuǎn)導(dǎo)腦、視網(wǎng)膜，AAV4可以特異性地轉(zhuǎn)導(dǎo) 中樞神經(jīng)系統(tǒng)的室管膜細(xì)胞，AAV7、8和9型病毒在肝臟中都能高效表達(dá)蛋白，同時(shí)AAV9在 肺部和肌肉組織中表達(dá)蛋白的效率最高[Dirk Kuck等，J Virol Meth，2007, 140:17-24。 Neal S等，N Engl J Med，2004, 350:586-97]。因此，就有了特定的血清型治療特定疾病的 臨床研究。
[0004] 重組腺相關(guān)病毒（rAAV)載體的生產(chǎn)，需要質(zhì)粒DNA、宿主細(xì)胞和培養(yǎng)基等作為原 材料，因此，采用合適的分離、純化方法，除去rAAV的細(xì)胞裂解液中可能存在的質(zhì)粒DNA，宿 主細(xì)胞蛋白，培養(yǎng)基成分，牛血清蛋白以及酶等雜質(zhì)，得到純度較高的病毒載體，才能用于 基因治療的試驗(yàn)研究。
[0005] 目前，色譜方法純化rAAV載體是保證臨床用載體純化的重要方法，已有不少的 研究報(bào)道，主要包括陰、陽離子交換色譜、疏水色譜以及親和色譜等。為了提高產(chǎn)品純度， 通常采取幾種色譜聯(lián)合應(yīng)用或者色譜與密度梯度離心方式相互結(jié)合。如碘克沙醇梯度離 心與肝素 P0R0S HE，或者與陽離子交換色譜UN0-S1聯(lián)合分離rAAV2[Zolotukhin，S等， Methods, 2002, 28 (2) :158-167]，陽離子色譜 P0R0S HS 與陰離子色譜 Q S印harose xl 或者 P0R0S HQ聯(lián)合分離 rAAV2[US 2007/0243615A1]。陽離子色譜P0R0S HS 分離 rAAV2，rAAV6， 陰離子樹脂P〇R〇S HQ分離rAAVl，rAAV8,陰離子P0R0S PI分離rAAV5等。
[0006] 陶瓷輕磷灰石（ceramic hydroxyapatite, CHT)是一種由磷酸|丐構(gòu)成的無機(jī)鹽色 譜，以良好的流速、高結(jié)合能力，價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)，廣泛用于蛋白質(zhì)的工業(yè)分離。CHT主要通 過基質(zhì)中的磷酸根基團(tuán)或者鈣離子的親和性，與蛋白質(zhì)相互作用，分離蛋白質(zhì)[HJerten et al.，1956]。目前有研究報(bào)道，CHT色譜可以用于分離rAAV9[Jingmin Zhou，2011]以及rAAV 載體[CN 102803478A]。以上報(bào)道分離的rAAV載體，均系通過溶液中添加 PEG作為輔助成 分，從而增加 CHT色譜對(duì)rAAV的結(jié)合能力和純度。但是，實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，加入PEG組成之后， 溶液、管路會(huì)變得黏滑，樹脂不容易進(jìn)一步再生，操作不當(dāng)，極易對(duì)進(jìn)一步純化造成困難，因 而需要尋找更加合適的附加劑，輔助CHT色譜純化rAAV載體。
[0007] 在保持載體活性情況下，最大限度地兼顧載體的純度及得率，是rAAV載體純化工 藝的巨大挑戰(zhàn)。
[0008] 為了更好地解決上述問題，本實(shí)驗(yàn)室探討了利用鈣離子替代PEG用于rAAV載體的 純化，發(fā)現(xiàn)在鈣離子存在的條件下，磷灰石CHT色譜能夠在含有AAV的細(xì)胞裂解液中捕獲 rAAV顆粒，實(shí)現(xiàn)rAAV從CHT色譜中的分離純化。
[0009] 本發(fā)明所述將rAAV載體細(xì)胞裂解液或細(xì)胞培養(yǎng)上清液，經(jīng)Bezonase核酸內(nèi)切酶 處理、在金屬鈣離子存在的情況下，采用磷灰石色譜（CHT)，或陶瓷氟磷灰石（CHF)色譜，結(jié) 合細(xì)胞裂解液或者上清液中的rAAV載體，再經(jīng)含鈣離子的洗滌液洗滌和不含鈣離子的洗 脫液洗脫，然后經(jīng)陰離子色譜進(jìn)一步分離純化rAAV的方法，迄今尚未見有國內(nèi)外的相關(guān)報(bào) 道。


【發(fā)明內(nèi)容】
：
[0010] 本發(fā)明提供從細(xì)胞裂解液或細(xì)胞培養(yǎng)上清液中分離純化rAAV載體的方法，包括 以下步驟：
[0011] ⑴將要分離的細(xì)胞裂解液，經(jīng)過核酸內(nèi)切酶Bczonasc?處理，離心后的上清液用 調(diào)節(jié)成不同鈣離子濃度的結(jié)合緩沖液溶液，初步除去部分雜蛋白；
[0012] (2)經(jīng)過鈣離子處理澄清的細(xì)胞裂解液部分，流經(jīng)CHT色遒時(shí)，rAAV與CHT色譜結(jié) 合；
[0013] (3)rAAV與CHT色譜結(jié)合后，再經(jīng)含鈣離子的洗滌緩沖溶液和不含鈣離子的洗脫 緩沖溶液洗脫；
[0014] (4)然后經(jīng)陰離子色譜如 ANX-sepherose，P0R0S HQ，DEAE-sepherose 或者 Q-sepherose等進(jìn)一步分離純化rAAV。
[0015] 其中：
[0016] 與CHT結(jié)合及洗漆緩沖溶液所用的|丐離子濃度選自lppm到500ppm的任意一個(gè)； 與CHT結(jié)合溶液、洗滌緩沖溶液、洗脫緩沖溶液的pH值可在pH6. 5到pH10. 0的范圍，優(yōu)選中 性值PH7.0;所用的結(jié)合、洗滌、洗脫緩沖溶液，可以選用磷酸鹽、硼酸鹽、三羥甲基氨基甲 烷（Tris)、羥乙基哌嗪乙硫磺酸（Hepes)或者相互組合的緩沖溶液；所用結(jié)合溶液、洗滌、 洗脫緩沖溶液還包含l_2000mM的NaCl。
[0017] 本發(fā)明所述rAAV載體的分離方法可適用于rAAVl，rAAV2, rAAV3, rAAV4, rAAV5， rAAV6, rAAV7, rAAV8, rAAV9, rAAVIO, rAAVll, rAAV12, rAAV13, rAAV14, rAAV15, rAAV16, rAAV17, rAAV18, rAAV19, rAAV20 等載體的純化。

【專利附圖】

【附圖說明】：
[0018] 圖1.不同濃度鈣離子作用下的CHT色譜分離rAAV9
[0019] 其中：A-rAAV2基因組滴度回收率的百分比（η = 3, X土 s.)
[0020] B_rAAV2蛋白量回收率的百分比（η = 3, x土 s.)
[0021] **Ρ〈0· 05-無鈣組vs鈣離子組
[0022] 圖2. rAAV9與CHT色譜的結(jié)合能力
[0023] 其中：A-CHT分離rAAV9色譜圖
[0024] B-基因組拷貝數(shù)測定（η = 3，x土 s.)
[0025] 圖3. SDS/PAGE銀染鑒別rAAV9純度
[0026] 其中：A-CHT色譜方法純化
[0027] B-CsCl方法純化
[0028] 圖4.純化rAAV9_kal的活性測定
[0029] 其中：A-體外轉(zhuǎn)染rAAV9-kal NCI-H446細(xì)胞的kallistatin蛋白表達(dá)
[0030] (η = 3, X 土 s.)
[0031] Β-小鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)染rAAV9_kal裸鼠2周后血清中的kallistatin蛋白表達(dá)
[0032] (η = 3, X 土 s.)
[0033] 實(shí)施方案：
[0034] 以下實(shí)施例僅為幫助本領(lǐng)域技術(shù)人員更好地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本 發(fā)明。
[0035] 《實(shí)施例1》腺相關(guān)病毒載體的制備
[0036] 根據(jù)[Wright, J. F.等，Mol. Ther. 12, 171 - 178.]方法，ΗΕΚ293 細(xì)胞（ATCC)培 養(yǎng)于含有青霉素（10(^/1111)、鏈霉素（10(^8/1111)(6丨1^(3〇)、10%胎牛血清$85,81)的 DMEM(Gibico)培養(yǎng)基中，37°C，5%的C02培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到60% -70%時(shí)，胰酶消化， 按照2.0E7-3.0E7的細(xì)胞數(shù)量，接種于轉(zhuǎn)瓶（roller bottle)中，轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)箱，37°C，5%的 C02培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到60% -70%的時(shí)候，包裝質(zhì)粒pH29,腺病毒復(fù)制功能質(zhì)粒pfd6 以及目的基因載體質(zhì)粒，三種質(zhì)粒按1:1:1的量，磷酸鈣轉(zhuǎn)染]到HEK293細(xì)胞[許瑞安、陳 凌、肖衛(wèi)東主編《分子基因藥物學(xué)》北京大學(xué)出版社&北京大學(xué)醫(yī)學(xué)出版社2008,北京]，次 日細(xì)胞換液，換成不含血清的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)72小時(shí)，收獲細(xì)胞。
[0037] 收獲的細(xì)胞，采用4000rpm/min，20°C，離心lOmin，得到細(xì)胞沉淀部分以及上清液 部分，分別處理。細(xì)胞沉淀部分加入30ml/ruller的200mM NaCl超聲破碎（NBRANS0N)，力口 入 benzonase (Sigma)至終濃度為 50U/ml，37°C水浴 60min，8000rpm/min，4°C離心 30min，得 到細(xì)胞裂解液。
[0038] 《實(shí)施例2》重組腺相關(guān)病毒載體的氯化銫超速離心法分離純化
[0039] 采用優(yōu)化的氯化銫（CsCl)超速離心法[E.Ayuso,2010]，將澄清的細(xì)胞裂解液 加入 40 % PEG 8000/2. 5M NaCl 至終濃度為 8 % PEG 8000/U 5MNaCl，4 °C 放置 2 小時(shí)， 4, 000rpm/min離心30分鐘，保留沉淀，細(xì)胞沉淀部分，按照100ml細(xì)胞裂解液加入20ml CsCl輕液（1. 37g/cm3)溶解，然后覆蓋到CsCl重液（1. 5g/cm3)上層，采用Beckman超速離心 機(jī)的T70i轉(zhuǎn)子，20°C，18, 000rpm/min超速離心24h。離心結(jié)束，收集載體條帶部分，再進(jìn)行 第二次CsCl超速離心，米用Beckman超速離心機(jī)的NTI65轉(zhuǎn)子，20°C，50, 000rpm/min超速 離心20h，注射器吸取載體部分，放入透析袋，PBS透析3次，最后一次透析液為含有0. 01% 的F-68[CN 101018858A]的PBS。滴度測定之后，制成1X1013V. G./ml，0. 2um過濾，無菌分 裝-80°C保存?zhèn)溆谩?br> [0040] 《實(shí)施例3》不同濃度鈣離子對(duì)CHT與rAAV結(jié)合的影響
[0041] 細(xì)胞裂解溶液，采用1M CaCl2調(diào)整終濃度至1200, 960,720, 480, 240, 120ppm，室溫 放置2小時(shí)，8000rpm/min，4°C離心30分鐘，上清溶液部分用去離子水稀釋4倍，0. 2um濾膜 過濾后用于色譜純化。將50mM NaCl，5mM NaP04，pH7. 0的平衡緩沖溶液加入1M CaCl2調(diào)整 終濃度為 300、240、180、120、60、3(^口111平衡(：!11'色譜10個(gè)柱體積（(3〇11111111￥〇1111116,0〇，之 后，30ml澄清的細(xì)胞裂解液上樣，結(jié)束之后采用平衡緩沖溶液洗滌10CV，然后180mM NaCl 的20mM NaP04(pH7.0)洗脫3CV，分別收集穿透、洗滌及洗脫峰，測定穿透、洗滌及洗脫峰中 不同濃度鈣離子條件下rAAV基因組滴度及蛋白質(zhì)的回收率（圖1)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，加入鈣離子 的病毒滴度收率均在90%以上，不同濃度的鈣離子對(duì)載體的產(chǎn)率沒有顯著性差異，但是與 不加入鈣離子的溶液相比，則有顯著性差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果還表明，高濃度的鈣離子可能與溶液 中存在的磷酸根離子結(jié)合，生成磷酸鈣沉淀，可能會(huì)導(dǎo)致儀器管路的堵塞，因此30ppm的鈣 離子濃度足夠用于載體與樹脂的結(jié)合。
[0042] 《實(shí)施例4》不同pH值細(xì)胞裂解液對(duì)CHT與rAAV結(jié)合的影響
[0043] 細(xì)胞裂解溶液，采用1M CaCl2調(diào)整終濃度至Ca2120ppm，室溫放置2小時(shí)，8000rpm/ min，4°C離心30分鐘，上清溶液部分用去離子水稀釋4倍，0. 2um濾膜過濾后用于色譜純化。 將50mM NaCl，30ppm Ca2+的5mM NaP04的平衡緩沖溶液以及稀釋的細(xì)胞裂解液調(diào)整至pH為 6. 5、7. 0、7. 5、8. 0、8. 5、9. 0,平衡緩沖溶液至 10 個(gè)柱體積（column volume, CV)，之后，30ml 澄清的細(xì)胞裂解液A泵上樣，上樣結(jié)束之后采用平衡緩沖溶液洗滌10CV，然后180mM NaCl 的20mM NaP04(pH7. 0)洗脫3CV，收集洗脫峰。測定不同pH條件下洗脫液rAAV9載體滴度 及蛋白得率（表1)，結(jié)果表明，不同pH值對(duì)載體的產(chǎn)率沒有顯著性差異，但是，過高pH值同 樣有生成磷酸鈣沉淀的風(fēng)險(xiǎn)。因此，本發(fā)明確定選擇平衡細(xì)胞裂解液pH值為中性的7. 0作 為CHT分離rAAV的條件。
[0044] 表.1.不同pH條件下rAAV9洗脫液得率（η = 3, x±s.)
[0045]

【權(quán)利要求】
1. 一種重組腺相關(guān)病毒載體rAAV的分離純化方法，其特征是，所述方法是將rAAV載 體細(xì)胞裂解液或細(xì)胞培養(yǎng)上清液經(jīng)Bezormse?核酸內(nèi)切酶處理，在鈣離子存在下，采用磷 灰石色譜與經(jīng)緩沖液處理的細(xì)胞裂解液或者上清液中的rAAV載體結(jié)合，再經(jīng)含鈣離子的 洗滌緩沖溶液洗滌和不含鈣離子的洗脫緩沖溶液洗脫，然后經(jīng)陰離子色譜進(jìn)一步分離純化 rAAV 〇
2. 權(quán)利要求1所述的rAAV分離純化方法，其中的磷灰石色譜，包含陶瓷羥基磷灰石 CHT和陶瓷氟磷灰石CHF色譜。
3. 權(quán)利要求1所述的rAAV分離純化方法，其中的結(jié)合緩沖溶液和洗滌緩沖溶液均包含 鈣離子。
4. 權(quán)利要求1所述的rAAV分離純化方法，其中的結(jié)合緩沖溶液和洗滌緩沖溶液的鈣離 子濃度選自Ippm至500ppm。
5. 權(quán)利要求1所述rAAV的分離純化方法，其中的結(jié)合、洗滌、洗脫緩沖溶液pH值可以 在6. 5-10. 0范圍，優(yōu)選中性ρΗ7· 0。
6. 權(quán)利要求1所述rAAV的分離純化方法，其中的結(jié)合、洗滌、洗脫緩沖溶液選自磷酸 鹽、硼酸鹽、三羥甲基氨基甲烷Tris和羥乙基哌嗪乙硫磺酸H印es緩沖溶液，或者相互組合 的緩沖溶液。
7. 權(quán)利要求1所述rAAV的分離純化方法，其中的陰離子色譜可以是ANX-sepherose、 POROS HQ、DEAE_sepherose 或者 Q-sepherose。
8. 權(quán)利要求1所述rAAV的分離純化方法，其中可適用的rAAV載體包括：rAAVl、rAAV2、 rAAV3、rAAV4、rAAV5、rAAV6、rAAV7、rAAV8、rAAV9、rAAV10、rAAV11、rAAV12、rAAV13、rAAV14、 rAAV 15、rAAV 16、rAAV 17、rAAV 18、rAAV 19、rAAV20 等載體的純化。
【文檔編號(hào)】C12N15/864GK104232687SQ201410474564
【公開日】2014年12月24日 申請(qǐng)日期:2014年9月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月17日
【發(fā)明者】許瑞安, 曲偉紅 申請(qǐng)人:許瑞安