一種攜帶靶向分裂期磷蛋白1基因的小發(fā)夾rna的重組溶瘤腺病毒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物藥學領域，涉及一種攜帶靶向人源驅(qū)動蛋白——分裂期磷蛋白1基因的小發(fā)夾RNA的重組溶瘤腺病毒及其制備方法。本發(fā)明提供一種全新的肝癌藥物靶標——分裂期磷蛋白1，其彌補傳統(tǒng)基因治療藥物靶標p53基因的廣譜性；本發(fā)明還提供了一種表達針對分裂期磷蛋白1的小發(fā)夾RNA的重組溶瘤腺病毒制備方法；同時本發(fā)明提供了該重組溶瘤腺病毒在制備癌癥治療藥物中的應用。
【專利說明】-種攜帶靶向分裂期磷蛋白1基因的小發(fā)夾RNA的重組溶 瘤腺病毒
[0001]

【技術領域】
[0002] 本發(fā)明涉及生物藥學領域，具體來說，涉及一種攜帶靶向人源驅(qū)動蛋白--分裂 期磷蛋白1基因的小發(fā)夾RNA的重組溶瘤腺病毒及其制備方法。

【背景技術】
[0003] 原發(fā)性肝癌在世界范圍內(nèi)每年約發(fā)病26萬例。我國肝癌發(fā)病率約占全世界的40% 以上，每年新發(fā)病例約10余萬。我國肝癌死亡率位居所有癌癥死亡人數(shù)的第二位，每年約 有13萬患者死于肝癌。傳統(tǒng)外科切除和微創(chuàng)外科手術是目前主要的治療手段。然而由于 肝部瘤體積過大、位置不佳以及肝功能儲備不足等原因常常導致手術失敗，再加上術后的 高復發(fā)率使得手術治療肝癌往往達不到預期。而由于肝癌對化療的不敏感性或易產(chǎn)生耐藥 性等原因，單獨運用化學療法治療肝癌的效果十分有限。因此，作為新興的治療手段，基因 療法治療肝癌被寄予厚望。
[0004] 目前，我國一類新藥"今又生"一重組人P53腺病毒注射液，是世界上第一個以 重組腺病毒作為載體進行癌癥基因治療的上市藥物，臨床上主要用于治療鼻咽癌、頭頸部 鱗癌、喉癌等實體瘤。但這類以非復制型腺病毒載體攜帶抗癌基因的藥物在臨床應用上也 存在難以克服的不足之處。首先，以一類新藥"今又生"為例，該藥以抗癌基因 P53為靶點， 在腫瘤細胞中引入外源P53蛋白以達成抗癌作用。但現(xiàn)在已有很多文獻報道，p53基因在一 半以上的癌癥中失活，或者由于突變以及顯性抑制作用，其抗癌作用失去甚至由抑癌基因 變?yōu)榘┗?。如果不事先對病人進行基因診斷和預測，對占一半以上的P53基因失活或?qū)?P53不敏感癌癥患者使用這類藥物，將很難實現(xiàn)其抗癌效果。因此，尋找p53替代抗癌通路 中的分子靶點，是目前應用基因療法治療癌癥研究中的關鍵。第二，目前該類藥物的病毒載 體缺乏較強的腫瘤靶向作用，使得藥物難于在靶部形成聚集，欲提高藥物局部濃度需加大 用藥劑量，容易引起機體免疫反應造成不良后果；第三，由于其載體是非復制型病毒載體， 在感染腫瘤細胞后外源抗癌基因表達時間相對較短，往往在抗癌蛋白表達尚未形成有效的 抗癌濃度之前已經(jīng)被機體所清除，導致基因治療效果不佳。
[0005] 發(fā)明人在尋找腫瘤治療的新靶點過程中，通過分析肝癌臨床樣本發(fā)現(xiàn)驅(qū)動蛋白家 族中的一個成員-分裂期磷蛋白1 (M-phase phosphoprotein 1，MPH0SPH1)基因，在絕 大多數(shù)肝癌組織中相比癌旁組織及非肝癌組織顯著高表達。該結(jié)果以前未見國內(nèi)外文獻報 道?；赗NA干擾（RNAi)技術，發(fā)明人構(gòu)建了表達MPH0SPH1的小發(fā)夾RNA(small hairpin RNA，shRNA)的重組腺病毒載體（以下簡稱為Ad-shMPPl，如圖1所示)，該重組腺病毒能在小 鼠體內(nèi)下調(diào)肝癌細胞內(nèi)源MPH0SPH1的表達，顯著阻滯細胞有絲分裂，并同時誘導多倍體細 胞的形成，最終誘導肝癌細胞發(fā)生衰老及有絲分裂后凋亡，與傳統(tǒng)P53信號通路相比具有 不同的抗癌機制。動物體內(nèi)結(jié)果顯示，靜脈注射該重組腺病毒，不僅能顯著抑制小鼠原位肝 癌的發(fā)生，恢復動物由于肝癌所導致的肝損傷，且能顯著提升肝癌對于化療藥物紫杉醇的 敏感性，產(chǎn)生協(xié)同抗癌作用，顯示了良好的臨床應用價值。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明所要解決的的第一個問題在于提供一種全新的肝癌藥物靶標--分裂期 磷蛋白1，其彌補傳統(tǒng)基因治療藥物靶標P53基因的廣譜性；本發(fā)明所要解決的第二個問題 是提供了一種表達針對分裂期磷蛋白1的小發(fā)夾RNA的重組溶瘤腺病毒及其制備方法；本 發(fā)明所要解決的第三個問題，是提供了該重組溶瘤腺病毒在制備癌癥治療藥物中的應用。
[0007] 本發(fā)明提供了一種攜帶靶向人源的驅(qū)動蛋白分裂期磷蛋白1的小發(fā)夾RNA的重 組溶瘤腺病毒Ad-shMPPl的構(gòu)建方法，與野生型腺病毒相比，該重組溶瘤腺病毒由腫瘤特 異性啟動子--存活素啟動子替換病毒復制必需基因 E1A的啟動子，刪除復制非必需基因 E1B55KD，并插入分裂期磷蛋白1的小發(fā)夾RNA的表達框(如圖1所示)，其具體方案如下： 步驟一，質(zhì)粒PSP-A55/ shMPPl的構(gòu)建 1) 用油<31和fe?HI限制性內(nèi)切酶，雙酶切消化pXC2質(zhì)粒，回收1170 kp片段并克隆 到經(jīng)同樣雙酶切的PZD55載體中，構(gòu)建成質(zhì)粒pXC2-A55 ; 2) 以HEK293細胞基因組DNA為模板，引物如下： 正向：5, -ATG AAT TCC GCG TTC TTT GAA AGC AG-3'（SEQ ID No 1)， 反向：5, -AAT CTC GAG TGC CGC CGC CGC CAC CT-3，（SEQ ID No 2)， 經(jīng)PCR擴增，得到含人269 bp存活素（survivin)基因的啟動子部分片段，并克隆到 PTG19-T載體上，構(gòu)成質(zhì)粒pTG19-SP ; 3) pTG19-SP經(jīng)ZAoI andfe/I雙酶切，回收280 bp片段并克隆到pXC2-A55的 限制性位點，經(jīng)過鑒定存活素基因啟動子的方向，得到質(zhì)粒PSP-Λ 55 ; 4) 合成如下兩條寡聚核苷酸： 正向：5, -GTGAAGAAGTGCGACCGAAGAAGACTTCGGTCGCACTTC TTCACCTTTTTG-3'（SEQ ID No 3)， 反向：5, -AATTCAAAAAGGTGAAGAAGTGCGACCGAAGTCTTCTTC GGTCGCACT TCTTCAC-3， (SEQ ID No 4)， 分別退火，克隆到經(jīng)如al/feoRI雙酶切的pBS/U6載體上，其中經(jīng)T4 DNA聚合酶 處理成平端，得到質(zhì)粒pBS/U6-shMPPl ; 5) pBS/U6-shMPPl經(jīng)消化，回收400 bp包含U6/shMPPl表達框的片段并克隆到 pSP-Λ 55的你"/11位點上得到質(zhì)粒pSP-shMPPl-Λ 55 ; 步驟二，同源重組法構(gòu)建重組溶瘤腺病毒 6孔板每孔鋪入4.0 X105人胚腎細胞系--HEK293細胞，共轉(zhuǎn)染穿梭質(zhì)粒 pSP-shMPPl- Λ 55與大質(zhì)粒pBHGE3,二周之后觀察細胞狀態(tài)直至產(chǎn)生空斑； 步驟三，病毒收集純化 從空斑中挑選病毒單克隆，鑒定后大規(guī)模復制病毒，收集細胞培養(yǎng)物，經(jīng)氯化銫密度梯 度離心純化病毒。
[0008] 本發(fā)明重組腺病毒Ad-shMPPl作為肝癌基因治療的新型載體其突出優(yōu)點有三點， 首先，其靶標分子--分裂期磷蛋白1是發(fā)明人在肝癌中發(fā)現(xiàn)的一個全新的癌基因，該蛋白 在細胞分裂末期中的胞質(zhì)分裂過程中起著至關重要的作用。使用小發(fā)夾RNA能夠極大的 抑制該蛋白活性，阻止肝癌細胞有絲分裂，顯著抑制肝癌的發(fā)生和發(fā)展，并且與抗細胞微管 類化療藥物(其藥物機理也是抑制細胞分裂）聯(lián)用，如紫杉醇，會顯著降低肝癌對紫杉醇的 藥物抵抗，產(chǎn)生顯著的協(xié)同抗癌作用，在臨床上對于應用化療治療肝癌具有較好的促進作 用；第二，Ad-shMPPl能顯著改善由于肝癌所導致的肝損傷，這一突出優(yōu)點使得靶向分裂期 磷蛋白1的肝癌基因治療在臨床應用上尤其具有積極意義。總所周知，目前臨床上治療肝 癌第一選擇是外科手術，但是由于種種原因，特別是由于肝癌患者肝功能儲備不足而難以 實施手術。因此，如果能在治療肝癌，縮小瘤體積的同時恢復病人肝功能儲備，對于病人進 一步的積極治療，比如說手術切除，肝移植等具有極其重要的意義；第三，Ad-shMPPl使用 的是腫瘤特異復制性重組腺病毒。該病毒在野生型腺病毒的基礎上替換病毒復制必需基因 E1A的啟動子為腫瘤特異性啟動子存活素啟動子，并刪除了病毒在正常細胞中復制必需基 因 E1B55KD，使得病毒復制嚴格限制在腫瘤細胞中，而在正常細胞中不復制，在提高基因治 療效果的同時也提高了其對正常組織的安全性，克服了以往使用非復制型病毒作為基因治 療載體的一系列不足之處。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0009] 圖1為腺病毒基因組結(jié)構(gòu)示意圖，上排為野生型腺病毒，下排為Ad-shMPPl。
[0010] 圖2為Ad-shMPPl抑制裸鼠肝癌原位移植瘤的發(fā)生。
[0011] 圖3為Ad-shMPPl顯著降低動物血中谷草轉(zhuǎn)氨酶指標并提高白蛋白指標。
[0012] 圖4為Ad-shMPPl抑制動物皮下移植瘤，并顯示和紫杉醇具有協(xié)同抗癌作用。
[0013] 圖5為重組溶瘤腺病毒在肝癌細胞中特性復制，并特異性在腫瘤細胞中大量表達 外源報告基因。

【具體實施方式】
[0014] 下面結(jié)合附圖和實施例進一步說明本發(fā)明。
[0015] 實施例1 :重組腺病毒Ad-shMPPl的構(gòu)建方法 質(zhì)粒pSP- Λ 55/ shMPPl的構(gòu)建 1)用油<31和fe?HI限制性內(nèi)切酶，雙酶切消化pXC2質(zhì)粒，回收1170 kp片段并克隆 到經(jīng)同樣雙酶切的PZD55載體中，構(gòu)建成質(zhì)粒pXC2-Λ 55。
[0016] 2)以ΗΕΚ293細胞基因組DNA為模板，引物如下： 正向：5, -ATG AAT TCC GCG TTC TTT GAA AGC AG-3'， 反向：5, -AAT CTC GAG TGC CGC CGC CGC CAC CT-3，， 經(jīng)PCR擴增，得到含人269 bp存活素（survivin)基因的啟動子部分片段，并克隆到 PTG19-T載體上，構(gòu)成質(zhì)粒pTG19-SP。
[0017] 3)pTG19-SP 經(jīng)ZAoI and 5^1 雙酶切，回收 280 bp 片段并克隆到 PXC2-A55 的 1限制性位點，經(jīng)過鑒定存活素基因啟動子的方向，得到質(zhì)粒pSP- Λ 55。
[0018] 4)合成如下兩條寡聚核苷酸： 正向：5，-GTGAAGAAGTGCGACCGAAGAAGACTTCGGTCGCACTTC TTCACCTTTTTG-3，， 反向：5, -AATTCAAAAAGGTGAAGAAGTGCGACCGAAGTCTTCTTC GGTCGCACT TCTTCAC-3，， 分別退火，克隆到經(jīng)如al/feoRI雙酶切的pBS/U6載體上，其中經(jīng)T4 DNA聚合酶 處理成平端，得到質(zhì)粒pBS/U6-shMPPl。
[0019] 5)pBS/U6-shMPPl經(jīng)漢·ΗΙ消化，回收400 bp包含U6/shMPPl表達框的片段并克 隆到pSP-Λ 55的你/II位點上得到質(zhì)粒pSP-shMPPl-Λ 55。
[0020] 6孔板每孔鋪入4. 0 X 105人胚腎細胞系--HEK293細胞，待細胞密度到80%左 右進行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染時，將上步得到的穿梭質(zhì)粒pSP-shMPPl-Λ 55與大質(zhì)粒pBHGE3按 照質(zhì)量比2:1混合，每孔加入1. 5 μ g DNA并補加 Buffer EC至總體積100 μ 1，然后加入 12 μ 1 Enhancer,震蕩混勻；室溫放置5分鐘離心；加入15 μ 1 Effectene Transfection Reagent，吹打混勻，室溫放置20分鐘；向轉(zhuǎn)染復合物中加入600 μ 1完全培養(yǎng)基，混勻后加 入孔中，并輕輕搖動平板是復合物均勻混合。37°C培養(yǎng)6-18小時后換液。繼續(xù)培養(yǎng)48小 時后，吸干培液并在每孔中加入2ml低熔點瓊脂糖（1. 25% agarose，7. 5% FBS)，等瓊脂糖 凝固后轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)箱。之后觀察細胞狀態(tài)直至產(chǎn)生空斑。
[0021] 從空斑中挑選病毒單克隆，經(jīng)過PCR鑒定后進行大規(guī)模培養(yǎng)，收集細胞培養(yǎng)物，經(jīng) 氯化銫密度梯度離心純化病毒。具體操作過程如下： 將293細胞鋪于50-80個10cm培養(yǎng)皿，待細胞密度達到90%以后，每塊板感染合適滴度 的病毒，待細胞全部病變后（4-7天），每塊板中加入約500 μ? 10% Nonidet P 40 (NP40) 裂解液以裂解細胞。收集整個細胞裂解物，12000 rpm離心10分鐘，棄細胞碎片，收集上清。 每 100 ml 上清加入 50 ml PEG8000 (20% PEG8000，2.5M NaCl)，冰上 2 小時沉淀病毒。 12000 rpm離心上述混合物20分鐘，棄上清，將沉淀物懸浮在10 ml密度為1. 10g/ml的氯 化銫溶液中（溶劑為20 mM Tris-Hcl，pH 8. 0) 4°C 7000 rpm低溫離心5分鐘，收集病毒 懸浮液。氯化銫密度梯度溶液的制備：加入2. 0 ml的氯化銫（密度1. 40 g/ml，溶劑同上）， 再加入3.0 ml密度為1.30 g/ml的氯化銫溶液，再加入5 ml的病毒懸浮液。20000 rpm， 室溫離心2小時。收集密度在1. 30-1. 40g/ml之間的病毒條帶至透析袋中，透析袋用前用 10 mM的EDTA溶液煮沸10分鐘。在透析緩沖液（0. 15M蔗糖，0. 01M Tris-HCl pH 8. 0,2mM MgCl2)中，4°C透析過夜，中間換一次透析液。收集病毒，凍存于_80°C。三種密度的CsCl溶 液配制（溶于滅菌20 mM Tris, ρΗ8· 0)如下： 表1三種密度的氯化銫溶液配方

【權利要求】
1. MPH0SPH1在作為肝癌基因治療藥物靶標上的應用。
2. -種攜帶靶向分裂期磷蛋白1基因的小發(fā)夾RNA的重組溶瘤腺病毒的構(gòu)建方法，其 特征在于，包括如下步驟： 步驟一，質(zhì)粒PSP-A55/ shMPPl的構(gòu)建 用油al和fe?HI限制性內(nèi)切酶，雙酶切消化pXC2質(zhì)粒，回收1170 kp片段并克隆到經(jīng) 同樣雙酶切的PZD55載體中，構(gòu)建成質(zhì)粒pXC2-A55 ; 以HEK293細胞基因組DNA為模板，引物如下： 正向：5, -ATG AAT TCC GCG TTC TTT GAA AGC AG-3'， 反向：5, -AAT CTC GAG TGC CGC CGC CGC CAC CT-3，， 經(jīng)PCR擴增，得到含人269 bp存活素基因的啟動子部分片段，并克隆到pTG19-T載體 上，構(gòu)成質(zhì)粒PTG19-SP ; 3. pTG19-SP經(jīng)ZAoI andfe/I雙酶切，回收280 bp片段并克隆到pXC2-A55的 限制性位點，經(jīng)過鑒定存活素基因啟動子的方向，得到質(zhì)粒PSP-Λ 55 ; 4) 合成如下兩條寡聚核苷酸： 正向：5，-GTGAAGAAGTGCGACCGAAGAAGACTTCGGTCGCACTTC TTCACCTTTTTG-3，， 反向：5, -AATTCAAAAAGGTGAAGAAGTGCGACCGAAGTCTTCTTC GGTCGCACT TCTTCAC-3，， 分別退火，克隆到經(jīng)如al/feoRI雙酶切的pBS/U6載體上，其中經(jīng)T4 DNA聚合酶 處理成平端，得到質(zhì)粒pBS/U6-shMPPl ; 5. pBS/U6-shMPPl經(jīng)消化，回收400 bp包含U6/shMPPl表達框的片段并克隆到 pSP-Λ 55的你"/11位點上得到質(zhì)粒pSP-shMPPl-Λ 55 ; 步驟二，同源重組法構(gòu)建重組溶瘤腺病毒 6孔板每孔鋪入4.0 X105人胚腎細胞系--HEK293細胞，共轉(zhuǎn)染穿梭質(zhì)粒 pSP-shMPPl- Λ 55與大質(zhì)粒pBHGE3,二周之后觀察細胞狀態(tài)直至產(chǎn)生空斑； 步驟三，病毒收集純化 從空斑中挑選病毒單克隆，鑒定后大規(guī)模復制病毒，收集細胞培養(yǎng)物，經(jīng)氯化銫密度梯 度離心純化病毒。
3. 權利要求2所構(gòu)建的重組溶瘤腺病毒在制備治療肝癌藥物中的應用。
【文檔編號】C12N7/01GK104195117SQ201410470155
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年9月16日 優(yōu)先權日:2014年9月16日
【發(fā)明者】黃昆, 劉欣然, 鄭凌, 吳瓊 申請人:武漢百奧京生物醫(yī)藥有限公司