一種表達(dá)α-淀粉酶工程菌的構(gòu)建及該工程菌在動物飼料中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，也屬于動物飼料科學(xué)領(lǐng)域，公開了一種表達(dá)α-淀粉酶工程菌的構(gòu)建及該工程菌在動物飼料中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了一株耐高溫釀酒酵母FCN(Saccharomyces cerevisiae FCN，保藏號為CCTCC M 2014390)、一種α-淀粉酶基因的核苷酸序列(SEQ ID No.1)及其編碼的氨基酸序列(SEQ ID No.2)，本發(fā)明還提供了包含上述基因的重組載體、重組菌株及其在動物飼料中的應(yīng)用。利用該基因構(gòu)建的重組工程菌能高效表達(dá)α-淀粉酶，在以可溶性淀粉為底物時該酶可以達(dá)到490U/mL粗酶液。該工程菌能夠利用淀粉生產(chǎn)菌體，降低生產(chǎn)成本；在瘤胃發(fā)酵中，該工程菌可以提高飼料中淀粉的利用率，增加微生物蛋白和總揮發(fā)性脂肪酸含量，降低氨態(tài)氮含量，促進(jìn)動物健康生長。
CCTCC M2014390
2014.08.22
【專利說明】一種表達(dá)a-淀粉酶工程菌的構(gòu)建及該工程菌在動物飼料 中的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程和動物飼料科學(xué)領(lǐng)域，具體闡述一種表達(dá)a -淀粉酶工程菌 的構(gòu)建及該工程菌在動物飼料中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 目前，國外對飼料酵母及酵母培養(yǎng)物（Yeast Culture, YC)已經(jīng)進(jìn)行了很深入的 研究，但我國開展研究的時間比較遲。近年來，由于國家限制抗生素類產(chǎn)品在動物飼料中使 用，所以酵母及酵母培養(yǎng)物已經(jīng)成為替代抗生素的重要產(chǎn)品之一，其實際生產(chǎn)意義是深遠(yuǎn) 的。酵母菌具有很多生理功能，使其在飼料工業(yè)中得到了廣泛的研究與應(yīng)用。在反芻動物 上，酵母培養(yǎng)物能保持動物胃腸道微生態(tài)平衡；增強(qiáng)動物免疫功能；消除動物體內(nèi)有毒物 質(zhì)及抗氧化作用；改善動物生長性能。但天然野生的釀酒酵母不含淀粉酶，不能分泌淀粉 酶，且反芻動物的消化過程中淀粉得不到充分消化，約會殘留5%左右。
[0003] 因此，研究攜淀粉酶的釀酒酵母作為反芻動物飼料添加劑對瘤胃微生物發(fā)酵的影 響有著重要的意義。攜淀粉酶的釀酒酵母作為反芻動物飼料添加劑，不僅能促進(jìn)瘤胃微生 物發(fā)酵、提高生產(chǎn)性能，還能提高飼料中淀粉的利用率。因此，可以通過基因工程的方法把 外源淀粉酶基因轉(zhuǎn)入到釀酒酵母菌中表達(dá)，從而使釀酒酵母菌可以分泌淀粉酶。
[0004] 在基因工程中，酵母表達(dá)系統(tǒng)已經(jīng)發(fā)展很久了，其最先使用的是釀酒酵母，因為釀 酒酵母一直以來被認(rèn)為是安全生物，并且遺傳背景相對清楚。釀酒酵母表達(dá)載體可以有自 主復(fù)制型游離質(zhì)粒和隨染色體同步復(fù)制的整合型兩種。自主復(fù)制型質(zhì)粒由于含有來自酵母 天然質(zhì)粒2 Ii m復(fù)制起點序列ARS(autonomously replicating sequence)，能夠獨立于酵母 染色體外自主復(fù)制，拷貝數(shù)通常可達(dá)30拷貝以上，但在多數(shù)情況下，如果沒有選擇壓力，它 們是不穩(wěn)定的，容易丟失。整合型載體不含自主復(fù)制序列（ARS)，可整合到酵母宿主菌的染 色體上，這類載體的優(yōu)點是穩(wěn)定性好，但它的缺點是拷貝數(shù)低。一般來說，外源基因在酵母 中的表達(dá)和基因的轉(zhuǎn)錄水平有密切的關(guān)系，所以，選用強(qiáng)啟動子對高效表達(dá)就十分重要。目 前，釀酒酵母組成型的強(qiáng)啟動子有PGK、ADH1、GPD等，誘導(dǎo)型強(qiáng)啟動子有GALUGAL7等。（董 清華，沈元月.酵母表達(dá)系統(tǒng)研究進(jìn)展與展望.北京農(nóng)學(xué)院學(xué)報[J]，200823 (2) :72-75.) 釀酒酵母表達(dá)分泌到細(xì)胞外的蛋白質(zhì)是通過信號肽來實現(xiàn)的，信號肽是存在于分泌蛋白質(zhì) N末端的特異氨基酸序列，引導(dǎo)新合成的分泌性蛋白質(zhì)至不同的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)。酵母表達(dá)系統(tǒng)的 信號肽主要可以分為4種：一蛋白質(zhì)自身信號肽，二酵母信號肽，三外源信號肽，四改造信 號肽。（覃曉琳，劉朝奇，鄭蘭英。信號肽對酵母外源蛋白質(zhì)分泌效率的影響[J]。生物技 術(shù)，2010, 20 (3) :95-97.)現(xiàn)在已有多種淀粉酶基因在釀酒酵母中成功表達(dá)。
[0005] 然而，野生釀酒酵母一般在39°C (反芻動物瘤胃的溫度）下代謝緩慢，分泌淀粉酶 的能力降低，所以有必要得到耐高溫的突變菌株。本發(fā)明就是構(gòu)建一株在39°C下能正常生 長的可分泌淀粉酶的釀酒酵母用于反芻動物飼料添加劑，以促進(jìn)瘤胃微生物發(fā)酵，提高生 產(chǎn)性能和飼料中淀粉的利用率。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一株耐高溫的釀酒酵母菌FCN (Saccharomyces cerevisiae FCN)，其在中國典型培養(yǎng)物保藏中心（中國湖北省武漢市武昌珞珈山，武漢大 學(xué)）的保藏號為：CCTCC M 2014390。
[0007] 本發(fā)明的另一目的是提供一種真菌的編碼a _淀粉酶的基因，極其編碼的蛋白 質(zhì)。
[0008] 本發(fā)明的另一目的是提供包含上述a _淀粉酶基因的重組載體。
[0009] 本發(fā)明的另一目的是提供包含上述a _淀粉酶基因的工程菌。
[0010] 本發(fā)明的另一目的是提供上述工程菌在動物飼料中的應(yīng)用。
[0011] 本發(fā)明的具體方法步驟：
[0012] 1.從牛瘤胃中篩選耐高溫釀酒酵母菌：取少許瘤胃液加入馬鈴薯-葡萄糖液體培 養(yǎng)基，39°C下富集耐高溫釀酒酵母菌，然后在虎紅培養(yǎng)基上39°C下分離耐高溫釀酒酵母菌。 篩選在39°C下生長最旺盛的一株釀酒酵母菌FCN(Saccharomyces cerevisiae FCN)，將其 接種在淀粉-Yro培養(yǎng)基平板上生長。
[0013] 2. a -淀粉酶基因重組載體的構(gòu)建：從一種真菌基因組上PCR擴(kuò)增a -淀粉酶基 因，其DNA序列如SEQ ID NO. 1所示，有1485個堿基組成，該基因編碼的蛋白質(zhì)序列如SEQ ID NO. 2所示，有494個氨基酸組成。PCR兩條引物的5'端有與大腸桿菌和釀酒酵母穿梭 表達(dá)質(zhì)粒pAUR123(購自TaKaRa)相對應(yīng)的酶切位點。PCR產(chǎn)物連接T-載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 測序。a -淀粉酶基因DNA序列測序正確的大腸桿菌提取質(zhì)粒，該質(zhì)粒與pAUR123載體用相 應(yīng)的限制性內(nèi)切酶雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收對應(yīng)的酶切片斷?；厥盏腶-淀粉酶 基因DNA片斷和pAUR123載體片斷用T4連接酶連接，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，通過測序驗證是 否連接正確，從而完成a-淀粉酶基因重組載體（PAUR123-AMY)的構(gòu)建。
[0014] 3.含a-淀粉酶基因的工程菌轉(zhuǎn)化、用碳源為淀粉的培養(yǎng)基培養(yǎng)工程菌以及工程 菌a-淀粉酶活性的測定：優(yōu)選耐高溫釀酒酵母菌為宿主菌。從步驟2中轉(zhuǎn)化的大腸桿菌中 提取質(zhì)粒pAUR123_AMY，用醋酸鋰法轉(zhuǎn)化釀酒酵母菌FCN(Saccharomyces cerevisiae FCN) (具體步驟參見TaKaRa的pAUR123載體說明書），用含有AureobasidinA的YNB培養(yǎng)基篩 選到的陽性轉(zhuǎn)化子，得到含有a -淀粉酶基因的工程菌。
[0015] 用碳源為淀粉的培養(yǎng)基培養(yǎng)工程菌，培養(yǎng)的菌液離心得到的上清就是a _淀粉酶 的粗酶液。a-淀粉酶活性的測定采用二硝基水楊酸法。
[0016] 4.工程菌在動物飼料中的應(yīng)用：過0.5mm篩的黃豆粉、干稻草粉和可溶性淀粉，按 5 : 3 : 1比例配成人工飼料。瘤胃液從裝有永久瘤胃瘺管的成年肉牛瘤胃內(nèi)采集，在厭 氧狀態(tài)下用四層醫(yī)用紗布過濾，得到備用瘤胃液。向15個IOOml培養(yǎng)瓶中分別加入經(jīng)準(zhǔn)確 稱量的人工飼料〇. 4g、瘤胃液IOml和人工唾液10ml，然后將15個培養(yǎng)瓶分成3組，每組5 個，第一組加Iml經(jīng)過離心的不含菌體的原始菌培養(yǎng)液，第二組加Iml培養(yǎng)原始菌的菌液， 第三組加Iml培養(yǎng)工程菌的菌液。整個操作過程在是充滿N 2無O2的狀態(tài)下完成的。加好 料的15只培養(yǎng)瓶密封后充分混勻，在39°C下恒溫培養(yǎng)。
[0017] 分別取發(fā)酵12、18和24h的發(fā)酵液樣品，用碘液檢測發(fā)酵液是否還存在淀粉殘留； 取發(fā)酵24h的發(fā)酵液樣品，用氣相色譜法測定樣品中的總揮發(fā)性脂肪酸的濃度，用嘌呤法 測定樣品中的微生物蛋白質(zhì)含量，用比色法測定樣品中氨態(tài)氮的濃度。
[0018] 本發(fā)明所具有的優(yōu)點：
[0019] 1.由于本發(fā)明的工程菌能夠利用淀粉作為碳源，而可以不必利用價格相對昂貴的 葡萄糖作為碳源，這就給生產(chǎn)菌體節(jié)約了大量的成本。
[0020] 2.在瘤胃發(fā)酵中，工程菌能促進(jìn)飼料中淀粉的利用率，從而提高飼料的利用率。
[0021] 3.在瘤胃發(fā)酵中，工程菌能提高促進(jìn)動物生長的揮發(fā)性脂肪酸和微生物蛋白的含 量。
[0022] 4.在瘤胃發(fā)酵中，工程菌能降價對動物有毒害作用的氨態(tài)氮，有利于動物的康健 生長。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0023] 圖1為篩選的耐高溫釀酒酵母菌在淀粉-Yro培養(yǎng)基平板上生長的情況。
[0024] 圖2為Xbal和Hpal雙酶切后純化的穿梭質(zhì)粒pAUR123的DNA片斷和淀粉酶基因 DNA片斷。泳道1為雙酶切后純化的穿梭質(zhì)粒pAUR123的DNA片斷，泳道2為雙酶切后純化 的淀粉酶基因DNA片斷，泳道Ml為Ikb DNAMarker，泳道M2為DL2000DNAMarker。
[0025] 圖3為含有a -淀粉酶基因重組載體（PAUR123-AMY)的構(gòu)建圖。
[0026] 圖4為含有a -淀粉酶基因的陽性轉(zhuǎn)化子，即所要的工程菌。

【具體實施方式】
[0027] 下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)描述。
[0028] 實施例1
[0029] 從牛瘤胃中篩選耐高溫釀酒酵母菌：取少許瘤胃液加入馬鈴薯-葡萄糖液體培養(yǎng) 基，39°C下富集耐高溫釀酒酵母菌，然后在虎紅培養(yǎng)基上39°C下分離耐高溫釀酒酵母菌。篩 選在39°C下生長最旺盛的一株釀酒酵母菌FCN(Saccharomyces cerevisiae FCN)(在中國 典型培養(yǎng)物保藏中心的保藏號為：CCTCC M 2014390)，其在淀粉-YH)培養(yǎng)基平板上生長的 情況如圖1所示。
[0030] 馬鈴薯-葡萄糖液體培養(yǎng)基：馬鈴薯200g/L，葡萄糖20g/L。馬鈴薯去皮切片 200g，加水煮沸30min，紗布過濾，加入葡萄糖20g，補(bǔ)足蒸餾水1L，自然PH。
[0031] 虎紅（孟加拉紅）培養(yǎng)基：蛋白胨5. Og/L，葡萄糖10g/L，KH2PO4L Og/L, MgSO4O. 5g/L，孟加拉紅 0? 033g/L，氯霉素 0? lg/L，瓊脂 15g/L。
[0032] 淀粉-YH)培養(yǎng)基：可溶性淀粉10g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖10g/L， 瓊脂15g/L。
[0033] 實施例2
[0034] a-淀粉酶基因重組載體的構(gòu)建：從一種真菌基因組上PCR擴(kuò)增a-淀粉酶基因， 其DNA序列如SEQ ID NO. 1所示，有1485個堿基組成，該基因編碼的蛋白質(zhì)序列如SEQ ID NO. 2所示，有494個氨基酸組成。PCR兩條引物的5'端分別有與穿梭質(zhì)粒pAUR123相對應(yīng) 的Xbal和Hpal酶切位點。PCR產(chǎn)物連接T-載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a測序。
[0035] PCR 的引物，Up : TCTAGAATGCAAATTTCAAAAGCTGCTTTGCTTG ;
[0036] Down ：GTTAACTCATGAACAAATGTCAGAAGCATATTTAG
[0037] PCR 反應(yīng)體系（50 ii L):
[0038]

【權(quán)利要求】
1. 一株耐高溫的釀酒酵母菌FCN(Saccharomyces cerevisiae FCN)，其在中國典型培 養(yǎng)物保藏中心的保藏號為：CCTCC Μ 2014390。
2. -種編碼α -淀粉酶的基因，其特征在于有1485個核苷酸序列：SEQ ID No. 1。
3. 如權(quán)利要求2所述的α-淀粉酶基因所編碼的α-淀粉酶蛋白質(zhì)，基特征在于有494 個氨基酸序列：SEQ ID No. 2。
4. 如權(quán)利要求2所述α -淀粉酶基因的重組質(zhì)粒PAUR123-AMY，其特征在于將權(quán)利要 求2所述α -淀粉酶的基因克隆到pAUR123酵母表達(dá)載體中所得。
5. 含有權(quán)利要求權(quán)4所述重組質(zhì)粒的重組工程菌，其特征一在于優(yōu)選釀酒酵母菌為宿 主，其特征二在于耐高溫，其特征三在于以權(quán)利要求1所述的釀酒酵母為原始出發(fā)菌株，其 特征四在于能夠表達(dá)權(quán)利要求3所述的α-淀粉酶。
6. 利用淀粉為碳源生產(chǎn)如權(quán)利要求5所述的重組工程菌。
7. 如權(quán)利要求5所述的重組工程菌在動物飼料中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N1/19GK104293688SQ201410464589
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年9月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月15日
【發(fā)明者】王東升, 黃黃, 黃江麗, 張國華, 田曉娟, 于一尊, 丁建南 申請人:江西省科學(xué)院生物資源研究所