一種測定原料和制劑中阿氏假囊酵母菌相對含量的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及原料和制劑中阿氏假囊酵母菌相對含量的方法，屬于分子生物學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】。原料主要是以黃豆為原料，經(jīng)阿氏假囊酵母菌發(fā)酵后的產(chǎn)物；其制劑是以該產(chǎn)物為原料，精制加工而成的制劑。本發(fā)明設(shè)計了針對阿氏假囊酵母菌核糖體RNA亞基內(nèi)26SrDNA的引物，提取原料及其制劑內(nèi)DNA為模板，聚合酶鏈反應(yīng)進(jìn)行DNA擴(kuò)增，用電泳檢測法檢測阿氏假囊酵母菌。之后通過凝膠成像儀上檢視和圖像分析軟件分析凝膠片顯示的亮度，以無菌雙蒸水為陰性對照，已知含量的DNA梯度標(biāo)記物內(nèi)不同分子量梯度DNA為基準(zhǔn)值，計算出阿氏假囊酵母菌DNA經(jīng)聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增后DNA特異產(chǎn)物含量，間接推算出原料和制劑中阿氏假囊酵母菌的相對含量。
【專利說明】一種測定原料和制劑中阿氏假囊酵母菌相對含量的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及測定藥品、食品、飼料、肥料等原料和制劑中阿氏假囊酵母菌含量的新 方法，屬于分子生物學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] 酵母菌是一些單細(xì)胞真菌，在自然界廣泛分布，主要生長在潮濕、含糖環(huán)境中，可 在缺氧環(huán)境中生存。酵母菌是人類應(yīng)用最早的微生物。
[0003] 酵母菌主要功用是發(fā)酵。在面包和饅頭生產(chǎn)中，酵母發(fā)酵產(chǎn)生大量二氧化碳使面 團(tuán)膨脹，形成松軟的組織；在食品工業(yè)上常見的酵母菌有啤酒酵母，用于生產(chǎn)啤酒、白酒和 酒精。
[0004] 酵母菌功用之二是營養(yǎng)強化。人們發(fā)現(xiàn)酵母菌本身也具有很高的營養(yǎng)價值，氨基 酸的比例接近聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO)推薦的較理想的氨基酸組成值，其菌體含水量占干重 的159Γ25%，含蛋白質(zhì)占干重的459Γ60%，包括人體必需的氨基酸，特別是谷物蛋白中含量 較少的賴氨酸。從酵母菌中提取的蛋白質(zhì)色澤乳白，無異味，純度高，主要作為營養(yǎng)強化劑 添加到面包、餅干中，也添加到香腸、火腿等食品中，增強產(chǎn)品的口味。酵母菌中水溶性維生 素和麥角留醇（維生素 D的前體）含量也非常豐富。值得一提的是，酵母菌富集硒元素，經(jīng) 過特殊工藝添加到食品后可以補充人體內(nèi)的硒元素。目前市場上已有硒酵母片，適用于低 硒的腫瘤、肝病、心腦血管疾病病人或其他低硒引起的疾病。
[0005] 酵母菌功用之三是調(diào)味。酵母精也叫酵母味素，是以酵母為原料，經(jīng)過使用酵母自 身酶系或添加酶制劑進(jìn)行分解消化，再經(jīng)過濾、濃縮等精制而成的天然調(diào)味料。酵母精滋味 鮮美，肉香味濃郁，后味悠長，并富含多種氨基酸、維生素及微量元素等，集調(diào)味與營養(yǎng)于一 體，可與動物肉類提取物相媲美，廣泛地應(yīng)用于食品加工中。酵母精還具有緩和酸味、除去 苦味、屏蔽成味及異味的效果。
[0006] 酵母菌在食品、藥品、飼料、化肥等方面有著重要作用，因此通過鑒別酵母菌和測 定酵母菌含量來判斷其發(fā)酵產(chǎn)品質(zhì)量就顯得非常必要。對于單純酵母菌來說，酵母菌鑒別 和含量測定較為簡單，一是菌體烘干稱重，二是直接取菌液，用分光光度計測其吸光度來推 算菌體量，但是對于酵母菌發(fā)酵產(chǎn)品，酵母菌鑒別和含量測定極為不易。文獻(xiàn)報道，有些學(xué) 者采用聚合酶鏈反應(yīng)（Polymerase Chain Reaction, PCR)結(jié)合電泳檢測法，或者采用實 時突光定量 PCR 技術(shù)（Real-time quantitative Polymerase Chain Reaction, Real Time PCR)測定酵母菌特異DNA片段，來鑒別酵母菌和推算酵母菌發(fā)酵產(chǎn)品中酵母菌含量。
[0007] 傳統(tǒng)的酵母菌鑒定一般是通過表型特征，即形態(tài)觀察和生理生化試驗，根據(jù)結(jié)果 判斷菌株的種屬，這種方式費時費力，重現(xiàn)性不好；另外由于環(huán)境影響，某些酵母菌表型特 征差異不顯著，傳統(tǒng)的鑒定方法難以區(qū)分。近年來，采用遺傳特性鑒定酵母菌有了突破，其 中編碼核糖體RNA基因內(nèi)rDNA序列分析是重要的鑒定方法之一【楊靜靜，孟鎮(zhèn)，鐘其頂，熊 正河，周韓玲，潘勤春，欒興社.分子生物學(xué)技術(shù)在酵母菌多相分類鑒定中的應(yīng)用.中國 釀造 2011，（4) :17-19】。
[0008] PCR結(jié)合熒光染色技術(shù)能準(zhǔn)確定位rDNA基因位置【唐玲，劉平，黃瑛，楊江科，閩 云君.酵母的分子生物學(xué)鑒定.生物技術(shù)通報2008,（5) :84-87】，測定rDNA序列（如26S rDNA的D1/D2、18S rDNA、ITS、5. 8S rDNA)能鑒定物種同源性，該技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于酵 母菌的分類鑒定中【馬愛瑛.rDNA分析在真菌分類鑒定中的應(yīng)用.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)2010， 38(32):18079-18081】。
[0009] 26S rDNA是編碼核糖體RNA -個亞基（26S rRNA)的基因。26S rDNA的D1/D2區(qū) 域位于大亞基的5'端，長度600bp左右【陳源源，沈微，石貴陽，王正祥.兩種分子標(biāo)識在 酵母分子鑒定中的比較·食品工業(yè)科技2011，32(2) :175-177】。1988年，Gutell和Fox研 究表明，這段區(qū)域有較高的變異率，可用于親緣關(guān)系較近的菌株間的分類研究【Gutell RR， Fox GE. Compilation of large subunit RNA sequences presented in a structural format. Nucleic Acids Res，1988,（16) : 175-269】。1991 年，Peterson 等研究顯不，同種 酵母菌核糖體大亞基5'端可變區(qū)D1/D2區(qū)域的堿基差異率一般小于1%，不同種菌株的堿基 差異率大于1%，為菌株鑒定提供了一種新的技術(shù)【Peterson SW，Kurtzman CP. Ribosomal RNA sequence divergence among sibling species of yeasts. Syst Appl Microbiol, 1991， （14):124-129】。
[0010] 阿氏假囊酵母菌是酵母菌中的一種，主要用于治療萎縮性胃炎的藥物--維酶 素(原料）和制劑的生產(chǎn)。維酶素是以黃豆為主要原料，經(jīng)阿氏假囊酵母(依利蒙）菌固體 發(fā)酵后的產(chǎn)物；維酶素制劑是以維酶素為主要原料，精制加工而成的復(fù)方制劑。維酶素及 其制劑主要成份為核黃素及核黃素的衍生物，其中維生素12種，其中以維生素 B2最多， 還含有氨基酸18種，微量元素23種以及糖類、粗纖維等。維酶素及其制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)是 2002年由化學(xué)藥品地方標(biāo)準(zhǔn)上升為國家藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，現(xiàn)行執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)為《國家藥品標(biāo)準(zhǔn) WS-10001-(HD-0890)-2002》【國家藥品監(jiān)督管理局.化學(xué)藥品地方標(biāo)準(zhǔn)上升國家標(biāo)準(zhǔn)(第 九冊)，2002年】，含量只測定了維生素 B2含量，鑒別只檢測了核黃素的熒光和氨基酸的茚三 酮反應(yīng)。該標(biāo)準(zhǔn)過于簡單，甚至低于2002年以前地方藥品標(biāo)準(zhǔn)，如1992年《湖北省藥品標(biāo) 準(zhǔn)》（湖北省衛(wèi)生廳.湖北省藥品標(biāo)準(zhǔn).湖北省衛(wèi)生出版社，武漢，P547,1992年）和1987 年《廣東省藥品標(biāo)準(zhǔn)》【廣東省衛(wèi)生廳.廣東省藥品標(biāo)準(zhǔn)(下冊）.廣東省衛(wèi)生出版社，廣 州，plllO, 1987年】。由于維酶素及其制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)過低，特別是沒有檢測其特異成分一阿 氏假囊酵母菌，使得維酶素及其制劑質(zhì)量難以保證，甚至市場上出現(xiàn)了假藥和劣藥【孫力， 敖力實，朱晶，李鶴，孟令姝，張成穎，吳建華.維酶素片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)探討.中國藥品 標(biāo)準(zhǔn) 2006, 7(4) : 16】。
[0011] 阿氏假囊酵母菌是其發(fā)酵產(chǎn)物中特有物質(zhì)，通過PCR結(jié)合電泳測定法檢測其發(fā)酵 產(chǎn)物(原料)及其制劑中糖體RNA亞基（26S rRNA)內(nèi)26S rDNA的D1/D2區(qū)特異DNA片段，可 以鑒定阿氏假囊酵母菌；如果通過定量方法測定其發(fā)酵產(chǎn)物(原料）及其制劑中糖體RNA亞 基（26S rRNA)內(nèi)26S rDNA的D1/D2區(qū)特異DNA片段含量，推算出阿氏假囊酵母菌總量，就 可以知道其發(fā)酵產(chǎn)物(原料)及其制劑是否真正由阿氏假囊酵母菌發(fā)酵所得。如果將PCR結(jié) 合電泳測定法檢測阿氏假囊酵母菌發(fā)酵產(chǎn)物(原料)及其制劑中核糖體RNA亞基（26S rRNA) 內(nèi)26S rDNA的D1/D2區(qū)特異DNA片段，以及結(jié)合電泳檢測法測定阿氏假囊酵母菌含量，將 其應(yīng)用到產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，特別是藥用的維酶素及其制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，從一定程度上能 鑒別出假冒偽劣產(chǎn)品。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0012] 本發(fā)明主要是通過PCR結(jié)合電泳測定法檢測其糖體RNA亞基（26S rRNA)內(nèi)26S rDNA的D1/D2區(qū)特異DNA片段，鑒別阿氏假囊酵母菌發(fā)酵產(chǎn)物(原料)及其制劑中阿氏假囊 酵母菌；并采用無菌雙蒸水為陰性對照，已知含量的分子量DNA標(biāo)記物內(nèi)不同分子量梯度 DNA為基準(zhǔn)值，通過DNA條帶亮度比對，間接推算出原料和制劑中阿氏假囊酵母菌的相對含 量。
[0013] ⑴引物設(shè)計 GenBank公布的阿氏假囊酵母菌核糖體RNA亞基（26S rRNA)內(nèi)26S rDNA序列 (GenBank: AY046143.1， Eremothecium ashbyi 26S ribosomal RNA gene, partial sequence)： tcgtgagaca ggttag_tttt accctactga tgaatgttat cgcaatagta attgaactta gtacgagagg aacagttcat tcagataatt ggtttttgcg gctgtccgat cgggcattgc cgcgaagcta ccatctgttg gattatggct gaacgcctct aagtcagaat ccatgctaga aagcgatgat ttcttgcctc acacattata gatggatacg aataaggtgc ttttagcatc gctgaaccat agcaggctga caatggtgct cttaacggaa aggttttggg tacttgtcgg cgaattgcaa tgtcattttg cgtgaggata aatcatttgt atacgactta aatgtacaac ggggtattgt aagcag〇
[0014] 據(jù)此，設(shè)計了阿氏假囊酵母菌26S rDNA引物，對應(yīng)位置見序列中標(biāo)記部分，擴(kuò)增產(chǎn) 物為246bp。
[0015] 上游引物：5' -TTTACCCTACTGATGAATGT (起于18對脫氧核苷酸）； 下游引物：5' - TTGTCAGCCTGCTATGGTTC (止于263對脫氧核苷酸)。
[0016] ⑵弓丨物驗證 阿氏假囊酵母菌總DNA為陽性對照，無菌雙蒸水為陰性對照，進(jìn)行PCR反應(yīng)，DNA分子 量標(biāo)記物為DNA梯度標(biāo)記物(含250bp DNA)，瓊脂糖凝膠電泳檢測。
[0017] 阿氏假囊酵母菌總DNA制備：取適量阿氏假囊酵母菌菌種置離心管中，力口 0.03mol/L?0.07氫氧化鈉溶液800μ1?980μ1，振蕩混勻；93° C?97° C保溫疒13分鐘， 加 0· 7Μ?I. 3Μ Tris-HCl 液（pH 8. 0)20 μ 1 ?200 μ 1，振蕩混勻。900rpnTl5000rpm 離心 3 分 鐘?7分鐘，取上清液50 μ 1?150 μ 1，加850 μ 1?950 μ 1無菌雙蒸水，振蕩混勻，即得阿氏假 囊酵母菌總DNA。
[0018] PCR反應(yīng)：在離心管中進(jìn)行反應(yīng)，總體積為20 μ 1?30 μ 1，包括7倍?13倍PCR反應(yīng) 緩沖液 l?4yl，dNTP (2.0mmol/L)各 2μ1 ?3μ1，鎂離子溶液（25.0mmol/L)lyl ?2μ1， 上游引物（10以111〇1/1)0.84 1?1.24 1，下游引物（1(^111〇1/1)0.84 1?1.24 1，丁&90嫩 聚合酶（4?6"111)0.4111?0.6111和樣品0嫩1111?3111，最后用無菌雙蒸水補足至相應(yīng) 體積。
[0019] 將離心管置于PCR反應(yīng)儀，PCR反應(yīng)參數(shù)為92°C?96°C預(yù)變性60秒~180秒， 97 °C?99 °C變性7秒?13秒，55 °C?65 °C退火20?40秒，64 °C?72 °C延伸45秒?75秒， 64°C?72°C終延伸200秒?400秒，共循環(huán)反應(yīng)20?35次。
[0020] 電泳檢測：配置29Γ5%濃度的瓊脂糖凝膠，膠中加入核酸凝膠染色劑(如DNA Green)，取適量的PCR反應(yīng)溶液和DNA分子量標(biāo)記物分別上樣，電泳（電壓4〇ν?8〇ν)20分鐘 飛O分鐘，凝膠片在凝膠成像儀上檢視。
[0021] 結(jié)果判定：陽性對照在250bp處可觀察到一條明顯DNA條帶，其亮度與加入DNA量 相關(guān)，但陰性對照無條帶（圖1)。說明設(shè)計的PCR反應(yīng)引物能滿足檢測阿氏假囊酵母菌26S rDNA的要求。
[0022] ③檢測原料及其制劑阿氏假囊酵母菌 本發(fā)明中原料是指阿氏假囊酵母菌發(fā)酵產(chǎn)物，如以黃豆為主要原料，經(jīng)阿氏假囊酵母 (依利蒙）菌固體發(fā)酵后的產(chǎn)物(藥品名稱為維酶素)。
[0023] 樣品DNA提取：取一定量的原料（以維酶素為例）或其制劑適量，用研缽磨成超細(xì) 粉末，稱取適量粉末置離心管中，加〇.〇3mol/L~0.07氫氧化鈉溶液800μ 1 ~980μ 1，振蕩 混勻；93。C ?97。C 保溫 7 ?13 分鐘，加 0.7Μ?1.3Μ Tris-HCl 液（pH 8·0)20μ1 ?200μ1，振 蕩混勻。900rpnTl5000rpm離心3分鐘?7分鐘，取上清液50 μ廣150 μ 1，加850 μ廣950 μ 1 無菌雙蒸水，振蕩混勻，即得樣品DNA模板。
[0024] PCR反應(yīng)：阿氏假囊酵母菌總DNA為陽性對照，無菌雙蒸水為陰性對照，DNA標(biāo)記物 為DNA總量和不同分子量梯度DNA含量經(jīng)過標(biāo)定的市售DNA梯度標(biāo)記物(含250bp DNA)，即 DNA總量和不同分子量梯度DNA含量是已知的DNA梯度標(biāo)記物。
[0025] 在離心管中進(jìn)行反應(yīng),總體積為20 μ 1?30 μ 1,包括7倍?13倍PCR反應(yīng)緩沖液 1 ?4yl，dNTP (2.0mmol/L)各 2μ1 ?3μ1，鎂離子溶液（25.0mmol/L)lyl ?2μ1，上游引 物（10μ--〇1/υ〇·8μ 1 ?1·2μ 1，下游引物（10μ--〇1/υ〇·8μ 1 ?1·2μ 1，TaqDNA 聚合酶 (4?6"以1)0.4以1?0.6以1和樣品0嫩1以1?3以1，最后用無菌雙蒸水補足至相應(yīng)體積。
[0026] 將離心管置于PCR反應(yīng)儀，PCR反應(yīng)參數(shù)為92°C?96°C預(yù)變性60秒?180秒， 97 °C?99 °C變性7秒?13秒，55 °C?65 °C退火20?40秒，64 °C?72 °C延伸45秒?75秒， 64°C?72°C終延伸200秒?400秒，共循環(huán)反應(yīng)20?35次。
[0027] 電泳檢測：配置29Γ5%濃度的瓊脂糖凝膠，膠中加入核酸凝膠染色劑(如DNA Green)，取適量的PCR反應(yīng)溶液和DNA分子量標(biāo)記物分別上樣，電泳（電壓4〇ν?8〇ν)20分鐘 飛0分鐘，凝膠片在凝膠成像儀上檢視。
[0028] 結(jié)果判定：原料或其制劑樣品在約250bp處可觀察到一條明顯DNA條帶，與陽性對 照DNA條帶一致，但是陰性對照無 DNA條帶（圖2)。
[0029] ? PCR反應(yīng)擴(kuò)增DNA產(chǎn)物序列分析 用Centri SeP柱純化引物驗證中得到的PCR反應(yīng)產(chǎn)物，全自動DNA測序儀進(jìn)行DNA 測序。結(jié)果顯示，阿氏假囊酵母菌PCR反應(yīng)產(chǎn)物基因長度為246bp，其序列與阿氏假囊酵 母菌 26S rDNA 中 18-263 位點序列（GenBank: AY046143.1，Eremothecium ashbyi 26S ribosomal RNA gene, partial sequence) 一致，即246bp脫氧核糖核酸堿基對，說明發(fā)明 的PCR反應(yīng)檢測到產(chǎn)物為阿氏假囊酵母菌。
[0030] ◎測定原料和制劑中阿氏假囊酵母菌相對含量 電泳結(jié)束后，凝膠片在凝膠成像儀上檢視，用圖像分析軟件分析的無菌雙蒸水、DNA梯 度標(biāo)記物、原料和制劑約250bp處DNA條帶的灰度，根據(jù)下列計算公式測算出原料和制劑中 阿氏假囊酵母菌相對含量，并以DNA含量表示。
[0031] 計算公式： DNA梯度標(biāo)記物中250bp DNA含量X (原料或制劑約250bp處DNA條帶的灰度-無菌 雙蒸水的灰度/DNA梯度標(biāo)記物約250bp處DNA條帶的灰度-無菌雙蒸水的灰度） 其中，DNA梯度標(biāo)記物為DNA總量和不同分子量梯度DNA含量經(jīng)過標(biāo)定的市售DNA標(biāo)志 物，即DNA總量和不同分子量梯度DNA含量是已知的DNA標(biāo)志物，如寶生物工程（大連）有 限公司生產(chǎn)的DNA梯度標(biāo)記物（QDL2, OOO Quantitative DNA Marker)，其DNA濃度為92ng/ μ 1 (含 5ng/y I 250bp DNA)。
[0032] 也就是說，測定原料和制劑中阿氏假囊酵母菌相對含量是在電泳檢測法中采用凝 膠成像儀檢視和圖像分析軟件分析所得DNA條帶亮度值，來比較阿氏假囊酵母菌DNA經(jīng)聚 合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增后DNA特異產(chǎn)物條帶亮度，得出的亮度相對值，其中以無菌雙蒸水作為陰 性對照，已知DNA標(biāo)志物內(nèi)約含250對脫氧核苷酸堿基的DNA條帶亮度為基準(zhǔn)值。
[0033] 最后，依據(jù)阿氏假囊酵母菌DNA經(jīng)聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增后DNA特異產(chǎn)物條帶亮度相 對值，間接推算出阿氏假囊酵母菌的相對含量。
[0034] (6)相關(guān)描述 發(fā)明所用的原料，主要是依據(jù)《國家藥品標(biāo)準(zhǔn)WS-10001-(HD-0890) -2002》規(guī)?；a(chǎn) 產(chǎn)品，即以黃豆為主要原料，經(jīng)阿氏假囊酵母(依利蒙）菌固體發(fā)酵后的產(chǎn)物，經(jīng)檢測核黃素 的熒光和氨基酸的茚三酮反應(yīng)呈陽性，核黃素?zé)晒夥磻?yīng)陽性，氨基酸茚三酮反應(yīng)陽性，維生 素 B2含量應(yīng)大于8mg/g，藥品名稱為維酶素。
[0035] 發(fā)酵所得原料，主要指維酶素的滅菌方法包括經(jīng)過干熱、蒸汽、高壓蒸汽、輻射等 滅菌方法處理。
[0036] 制劑是以阿氏假囊酵母發(fā)酵產(chǎn)物(如維酶素）為主要原料，加入適當(dāng)輔料，精制加 工而成的復(fù)方制劑。
[0037] 制劑劑型有片劑、膠囊、顆粒劑、散劑、膜劑等。
[0038] 片劑分為普通片、包衣片、多層片、咀嚼片、分散片、泡騰片、溶液片、長效片等。
[0039] 包衣片包括糖衣片、薄膜衣片和腸溶衣片。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0040] 圖1阿氏假囊酵母菌26S rDNA引物驗證； 圖2阿氏假囊酵母菌發(fā)酵產(chǎn)物（原料）及其制劑阿氏假囊酵母菌PCR反應(yīng)； 圖3測定新鄉(xiāng)恒久遠(yuǎn)藥業(yè)有限公司生產(chǎn)的維酶素片中阿氏假囊酵母菌含量。

【具體實施方式】
[0041] 實施例新鄉(xiāng)恒久遠(yuǎn)藥業(yè)有限公司生產(chǎn)的維酶素片中阿氏假囊酵母菌含量加測 樣品DNA提?。喝⌒锣l(xiāng)恒久遠(yuǎn)藥業(yè)有限公司生產(chǎn)的維酶素片10片（每片含維酶 素0. 2g),用研缽磨成超細(xì)粉末，稱取相當(dāng)于片芯重量25mg粉末，置I. 5ml離心管中，力口 0· 05mol/L氫氧化鈉溶液890μ 1，振蕩混勻。95° C保溫10分鐘，加 I. OM Tris-HCl液（pH 8. 0)110 μ 1，振蕩混勻。12000rpm離心5分鐘，取上清液100 μ 1，加900 μ 1無菌雙蒸水，振 蕩混勻，即得DNA模板。
[0042] 對照品制備：取適量阿氏假囊酵母菌菌種置I. 5ml離心管中，加 0. 05mol/L氫氧化 鈉溶液890 μ 1，振蕩混勻。95° C保溫10分鐘，加 LOM Tris-HCl液（pH 8.0) IlOyMJg 蕩混勻。12000rpm離心5分鐘，取上清液100 μ 1，加900 μ 1無菌雙蒸水，振蕩混勻，得陽性 對照品。無菌雙蒸水為陰性對照。DNA分子量標(biāo)記物為濃度為92ng/μ I DNA梯度標(biāo)記物 (含 5ng/μ I 25Obp DNA)【QDL2, OOO Quantitative DNA Marker 寶生物工程（大連）有限 公司】。
[0043] PCR 反應(yīng)：上游弓丨物：5'TTTACCCTACTGATGAATGT3'，下游弓丨物： 5 ' TTGTCAGCCTGCTATGGTTC3 '。PCR反應(yīng)體系：在200 μ 1離心管中進(jìn)行，反應(yīng)總體積為 25. 0μ 1，包括 10XPCR 緩沖液 2· 5μ 1，dNTP (2. Ommol/L) 2· 5μ 1，鎂離子（25. Ommol/L) 1·5μ 1，上游引物（10μ--〇1/υ 1μ 1，下游引物（10μ--〇1/υ 1μ l，TaqDNA 聚合酶（5υ/μ I) 0.5 μ 1，樣品DNA 2 μ 1，無菌雙蒸水14. 0 μ 1。將離心管置PCR儀，PCR反應(yīng)參數(shù)：94°C預(yù)變 性2分鐘，98°C變性10秒，60°C退火30秒，68°C延伸1分鐘，68°C終延伸5分鐘，共循環(huán)反 應(yīng)27次。
[0044] 電泳檢測：凝膠濃度3%，加入核酸凝膠染色劑溴化乙錠（Ethidium bromide，EB); PCR反應(yīng)液和DNA分子量標(biāo)記物上樣，60V電泳40分鐘，凝膠片在凝膠成像儀上檢視。
[0045] 結(jié)果判定：樣品在250bp處可觀察到一條明顯DNA條帶，并與陽性對照DNA條帶一 致，陰性對照無條帶（圖3)。采用凝膠成像儀檢視和圖像分析軟件分析約250bp處DNA條 帶亮度值，其中以無菌雙蒸水作為陰性對照，已知DNA標(biāo)志物內(nèi)約含250對脫氧核苷酸堿基 的DNA條帶亮度為基準(zhǔn)值，計算出阿氏假囊酵母菌DNA經(jīng)聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增后DNA特異產(chǎn) 物條帶亮度的相對值，并依據(jù)阿氏假囊酵母菌DNA經(jīng)聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增后DNA特異產(chǎn)物條 帶亮度相對值，間接推算出阿氏假囊酵母菌的相對含量。最終測算出新鄉(xiāng)恒久遠(yuǎn)藥業(yè)有限 公司生產(chǎn)的維酶素片中阿氏假囊酵母菌含量均大于IOng DNA量（以250bpDNA計)。
【權(quán)利要求】
1. 一種測定原料和制劑中阿氏假囊酵母菌相對含量的方法，其特征在于采用已知含 量的DNA分子量標(biāo)記物內(nèi)不同分子量梯度DNA為基準(zhǔn)值，檢測阿氏假囊酵母菌DNA經(jīng)聚合 酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增后DNA特異產(chǎn)物含量，間接推算出原料和制劑中阿氏假囊酵母菌的相對含 量。
2. 權(quán)利要求1所述的DNA分子量標(biāo)記物，其特征是DNA總量和不同分子量梯度DNA含 量經(jīng)過標(biāo)定的市售DNA標(biāo)記物，即DNA總量和不同分子量梯度DNA含量是已知的梯度DNA 標(biāo)記物。
3. 權(quán)利要求1所述的特異產(chǎn)物，其特征是阿氏假囊酵母菌核糖體RNA亞基內(nèi)26S rDNA 序列片段。
4. 權(quán)利要求3所述的阿氏假囊酵母菌核糖體RNA亞基內(nèi)26S rDNA序列，其特征為376 對脫氧核苷酸堿基，序列如下： tcgtgagaca ggttag_tttt accctactga tgaatgttat cgcaatagta attgaactta gtacgagagg aacagttcat tcagataatt ggtttttgcg gctgtccgat cgggcattgc cgcgaagcta ccatctgttg gattatggct gaacgcctct aagtcagaat ccatgctaga aagcgatgat ttcttgcctc acacattata gatggatacg aataaggtgc ttttagcatc gctgaaccat agcaggctga caatggtgct cttaacggaa aggttttggg tacttgtcgg cgaattgcaa tgtcattttg cgtgaggata aatcatttgt atacgactta aatgtacaac ggggtattgt aagcag〇
5. 權(quán)利要求1所述的聚合酶鏈反應(yīng)，其特征是其引物依據(jù)阿氏假囊酵母菌核糖體RNA 亞基內(nèi)26S rDNA序列設(shè)計出來的，其序列如下： 上游引物：5' -TTTACCCTACTGATGAATGT， 下游引物：5' - TTGTCAGCCTGCTATGGTTC。
6. 權(quán)利要求5所述的引物，其特征是經(jīng)聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增后特異產(chǎn)物含246對脫氧核 昔酸喊基。
7. 權(quán)利要求6所述的聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增后特異產(chǎn)物，其特征是與阿氏假囊酵母菌核糖 體RNA亞基內(nèi)26S rDNA序列相對應(yīng)。
8. 權(quán)利要求1所述的檢測，其特征是電泳檢測法中以無菌雙蒸水作為陰性對照，已知 分子量DNA標(biāo)記物內(nèi)約含250對脫氧核苷酸堿基的DNA條帶亮度為基準(zhǔn)值，比較阿氏假囊 酵母菌DNA經(jīng)聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增后DNA特異產(chǎn)物條帶亮度，得出亮度相對值的方法。
9. 權(quán)利要求1所述的相對含量，其特征是依據(jù)阿氏假囊酵母菌DNA經(jīng)聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò) 增后DNA特異產(chǎn)物條帶亮度相對值，間接推算出阿氏假囊酵母菌相對含量的方法。
10. 權(quán)利要求1所述的原料，其特征是指以黃豆為主要原料，經(jīng)阿氏假囊酵母(依利蒙） 菌固體發(fā)酵后的產(chǎn)物，藥品名稱為維酶素。
11. 權(quán)利要求10所述的維酶素，其特征是經(jīng)過干熱、蒸汽、高壓蒸汽、輻射等滅菌方法 處理的產(chǎn)物。
12. 權(quán)利要求1所述的制劑，其特征是其主要原料為維酶素。
13. 權(quán)利要求1所述的制劑，其特征在于該劑型包括片劑、膠囊、顆粒劑、散劑、膜劑。
14. 權(quán)利要求13所述的片劑，其特征包括普通片、包衣片、多層片、咀嚼片、分散片、泡 騰片、溶液片、長效片。
15. 權(quán)利要求14所述的包衣片，其特征包括糖衣片、薄膜衣片、腸溶衣片。
【文檔編號】C12Q1/68GK104293915SQ201410454818
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年9月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月10日
【發(fā)明者】楊俊 , 劉友勛, 趙玉峰, 閆明科, 孫方杰, 高樹崇, 李長正, 張澤橋 申請人:新鄉(xiāng)恒久遠(yuǎn)藥業(yè)有限公司