一種脂肪酶基因colip及其編碼的脂肪酶的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于人工合成基因領域，具體涉及一種脂肪酶基因COLIP及其編碼的脂肪酶、表達脂肪酶基因COLIP的基因工程菌。本發(fā)明公開了一種脂肪酶基因COLIP，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，由其編碼的脂肪酶的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明所獲得的脂肪酶基因COLIP可在畢赤酵母中超高效表達，所構建的畢赤酵母基因工程菌GS115（COLIP）可以用來大量生產(chǎn)脂肪酶。發(fā)酵結果顯示：在10L發(fā)酵罐條件下，發(fā)酵120小時，發(fā)酵液中脂肪酶的酶活可穩(wěn)定在45,000U/mL以上，發(fā)酵液中蛋白含量穩(wěn)定在3.2g/L以上。
【專利說明】-種脂肪酶基因 COL IP及其編碼的脂肪酶

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于人工合成基因領域，具體涉及一種脂肪酶基因 C0LIP及其編碼的脂肪 酶、表達脂肪酶基因 C0LIP的基因工程菌。

【背景技術】
[0002] 脂肪酶（EC3. 1. 1. 3,又稱三酰甘油?；饷福┦侵匾墓I(yè)用酶，廣泛應用于 飼料、食品、制革、洗滌、油酯化工、前體藥物的合成、手性藥物的拆分以及生物能源等工業(yè) 領域。脂肪酶在脂質代謝中發(fā)揮重要的作用，是脂肪消化利用最基本的酶，能將脂肪水解為 游離脂肪酸、甘油和甘油單酯供動物吸收利用。單胃的幼齡動物消化機能發(fā)育不健全，內源 消化酶分泌不足，脂肪消化吸收率低。在飼糧中添加脂肪酶可靶向解決動物內源消化酶不 足，以提高脂肪消化吸收利用，減少動物腸道疾病發(fā)生，提高飼料中脂肪的能量利用率，促 進脂溶性維生素吸收，發(fā)揮動物生產(chǎn)潛力、降低飼料成本，提高經(jīng)濟效益。
[0003] 在生物能源領域，利用脂肪酶的轉酯作用可將油脂和短鏈醇轉化為生物柴油。以 脂肪酶為催化劑的生物柴油的新型生產(chǎn)工藝具有顯著的優(yōu)點：①工藝簡單。后繼工藝省略 了中和、洗滌等工序；②催化劑可回收，可多次重復利用；③低能耗，反應條件溫和，反應溫 度在60°C以內。④反應效率高，無副反應發(fā)生，且甲醇用量低；⑤環(huán)境友好，無堿液污染，反 應過程無有害物產(chǎn)生。因此，以脂肪酶為催化劑的生物柴油酶法制備工藝是生物柴油制備 工藝中最先進的工藝之一，也是生物柴油制備工藝的發(fā)展方向。在國家科技政策的支持下， 我國在酶法制備工藝方面已有長足的發(fā)展。
[0004] 脂肪酶具有廣闊的市場需求。如在飼用脂肪酶領域，依照我國年飼料產(chǎn)量1. 33億 噸（http://animal. aweb. com. cn)，每噸飼料的添加量500g/t計算。我國飼用脂肪酶的年 需求量為6. 65萬噸，市場需求巨大。但目前，脂肪酶的產(chǎn)量相對較低，難以滿足市場對脂肪 酶的需求。
[0005] 畢赤酵母表達系統(tǒng)是目前使用最廣泛的真核單細胞表達系統(tǒng)。它具有營養(yǎng)需求簡 單、適于工業(yè)化大規(guī)模高密度發(fā)酵生產(chǎn)；副產(chǎn)物少、主產(chǎn)物純度高，后繼分離純化工藝簡單 等優(yōu)點。
[0006] 但目前大多數(shù)異源的脂肪酶基因在畢赤酵母中的表達量均較低，不能滿足脂肪酶 工業(yè)化生產(chǎn)的要求。導致異源基因在畢赤酵母中表達量低的主要因素包括：1)基因密碼子 的使用頻率。由于不同宿主密碼子使用的偏好性不同，在一個宿主能高效轉錄的密碼子，在 畢赤酵母中極有可能變成低頻密碼子，低頻率密碼子是基因表達的主要限制性因素之一； 2)mRNA的二級結構，二級結構越復雜，蛋白質的表達量越低；3)GC含量以及分布，通常情況 GC含量越高越影響基因的表達量，而過低的GC含量容易造成表達的提前終止；4)酶分子中 易受蛋白酶攻擊的位點或蛋白酶作用位點等影響基因表達產(chǎn)物的穩(wěn)定性。由于受到上述因 素的影響及其它諸多因素的綜合作用，導致異源脂肪酶基因在畢赤酵母中表達時，表達量 和表達產(chǎn)物的活性均不高，難以滿足工業(yè)化生產(chǎn)的需要。


【發(fā)明內容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供一種脂肪酶基因 C0LIP。
[0008] 本發(fā)明的第二個目的是提供一種由上述脂肪酶基因 C0LIP編碼的脂肪酶。
[0009] 本發(fā)明的第三個目的是提供一種包含上述脂肪酶基因 C0LIP的重組表達載體。
[0010] 本發(fā)明的第四個目的是提供一種高效表達上述脂肪酶基因 C0LIP的重組工程菌。
[0011] 本發(fā)明的第五個目的是提供重組表達載體和重組基因工程菌的制備方法。
[0012] 為解決上述技術問題，本發(fā)明采取了如下的技術方案：
[0013] 本發(fā)明公開了一種脂肪酶基因 C0LIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0014] 本發(fā)明公開了一種由上述脂肪酶基因 C0LIP編碼的脂肪酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2 所示。
[0015] 本發(fā)明中，根據(jù)脂肪酶一級結構的基本特征，設計一段長為912個核苷酸，編碼 303個氨基酸的脂肪酶基因 C0LIP序列；在設計過程中，根據(jù)密碼子在畢赤酵母中的使用頻 率表，將氨基酸序列轉換為密碼子序列，在轉換過程中對于有同義密碼子，盡可能采用高頻 密碼子；同時通過控制GC含量和GC在基因中的分布，避免出現(xiàn)富含GC或AT的區(qū)域，降低 該基因的最小自由能；消除脂肪酶中的蛋白酶作用位點，保持脂肪酶的穩(wěn)定性。根據(jù)脂肪酶 轉換而成的密碼子序列，結合本發(fā)明的設計思路，并采用人工合成基因的方法合成得到脂 肪酶基因 C0LIP。
[0016] 本發(fā)明還公開了一種包含上述脂肪酶基因 C0LIP(核苷酸序列如SEQ ID N0. 2所 示）的重組表達載體，命名為PPIC-C0LIP。將本發(fā)明的脂肪酶基因插入到表達載體合適 的限制性酶切位點之間，使其核苷酸序列與可操作的表達調控序列相連接。優(yōu)選地，將本 發(fā)明的脂肪酶基因插入到質粒pPICZ α A上EcoR I/Not I酶切位點之間，使該核苷酸序列 位于A0X1啟動子的下游并受其控制，得到受甲醇氧化酶啟動子A0X1誘導表達的重組子 pPIC-COLIP。
[0017] 本發(fā)明中重組表達載體的構建方法包括如下步驟：1)將合成的脂肪酶基因 C0LIP 克隆到中間載體PMD18-T，獲得重組質粒pMD-COLIP ;2)以pPICZ α A為載體，將該C0LIP基 因通過EcoR I/Not I酶切位點插入pPICZ α A載體，構建成重組表達載體pPIC-COLIP。
[0018] 本發(fā)明還公開了一種高效表達上述脂肪酶基因 C0LIP的重組基因工程菌。
[0019] 上述重組基因工程菌為畢赤酵母重組工程菌，命名為畢赤酵母重組工程菌 GS115 (C0LIP);具體地，通過將所述重組表達載體轉化畢赤酵母GS115細胞獲得。
[0020] 本發(fā)明中畢赤酵母重組基因工程菌GS115(C0LIP)的構建方法包括如下步驟： 1)將合成的脂肪酶基因 C0LIP克隆到中間載體pMD18-T，獲得重組質粒pMD-COLIP ;2)以 pPICZ α A為載體，將該C0LIP基因通過EcoR I/Not I酶切位點插入pPICZ α A載體，構建 成表達載體pPIC-COLIP ;3)將pPIC-COLIP導入畢赤酵母GS115細胞，獲得含脂肪酶基因 C0LIP的畢赤酵母基因工程菌GS115(C0LIP)。
[0021] 本發(fā)明中，載體PMD18-T來源于寶生物工程有限公司，商品號：3271，研究者可通 過正常渠道購買。大腸桿菌來源于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號是CCTCC AB93006， 研究者可從保藏機構索取。pPICZ α A為載體來源于Invitrogen公司，商品號：V195-20,研 究者可通過正常渠道購買。畢赤酵母GS115細胞來源于Invitrogen公司，商品號：C181-00， 研究者可通過正常渠道購買。
[0022] 本發(fā)明的有益效果：與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明所獲得的脂肪酶基因 COLIP可在畢 赤酵母中超高效表達，所構建的畢赤酵母基因工程菌GS115 (C0LIP)可以用來大量生產(chǎn)脂 肪酶。發(fā)酵結果顯示畢赤酵母基因工程菌GS115(C0LIP)在10 L發(fā)酵罐條件下，發(fā)酵120 小時（甲醇誘導表達90小時），發(fā)酵液中脂肪酶的酶活可穩(wěn)定在45, 000 U/mL以上，發(fā)酵液 中蛋白含量穩(wěn)定在3. 2g/L以上。因此，將本發(fā)明所述的脂肪酶基因 C0LIP應用于工業(yè)生產(chǎn) 中，可以大大降低生產(chǎn)成本，具有非常實際的應用前景。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0023] 附圖1是畢赤酵母基因工程菌GS115(C0LIP)在發(fā)酵過程中通氣、轉速和溶氧隨時 間變化的曲線。
[0024] 附圖2是畢赤酵母基因工程菌GS115(C0LIP)在發(fā)酵過程中畢赤酵母基因工程菌 生物量（細胞鮮重）、脂肪酶酶活及脂肪酶含量變化，其中A為發(fā)酵液中基因工程菌生物 量（細胞鮮重）、脂肪酶活性和脂肪酶含量隨時間變化曲線；B為發(fā)酵液中總蛋白質含量的 SDS-PAGE檢測結果。
[0025] 附圖3是脂肪酶在不同pH和溫度下的酶活。其中A為脂肪酶在不同pH條件下的 酶活；B這脂肪酶在不同溫度下的酶活。 具體實施方案
[0026] 下面對本發(fā)明的實施例作詳細說明，本實施例在以本發(fā)明技術方案為前提下進行 實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護范圍不限于下述的實施 例。
[0027] 實施例1脂肪酶基因 C0LIP序列的設計及合成
[0028] 在BioEdit軟件的輔助下推導出脂肪酶的氨基酸序列，保證脂肪酶的活性中心， 特定的空間結構特性不變，并消除了脂肪酶中的蛋白酶作用位點，防止其降解。在DM2. 0 軟件（https://www. dna20. com/)的輔助下，將氨基酸序列轉換成核苷酸序列，設計出一種 脂肪酶基因 C0LIP。在設計過程中主要改進了以下影響因素：對于同一氨基酸的同義密碼 子，使用畢赤酵母的高頻密碼子代替原有的低頻密碼子（其中，脂肪酶的氨基酸序列中，有 21個氨基酸存在同義密碼子，該同義密碼子在畢赤酵母中的使用頻率見表1);消除了復雜 的mRNA二級結構，降低了自由能；消除基因中的GC含量高于75%或低于35%的區(qū)域。設 計得到的脂肪酶基因 C0LIP序列見SEQ ID N0:1。完成設計后由DNAMAN軟件將其轉換成 氨基酸序列SEQ ID N0 :2,驗證設計的準確性。所設計的脂肪酶C0LIP序列交由蘇州金唯 智生物科技有限公司合成，所合成的脂肪酶基因 C0LIP通過序列分析，其準確性為100%。
[0029] 表1 21個氨基酸的同義密碼子在畢赤酵母中的使用頻率
[0030]

【權利要求】
1. 一種脂肪酶基因 COLIP，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
2. 權利要求1所述的脂肪酶基因 COLIP所編碼的脂肪酶，其特征在于，其氨基酸序列如 SEQ ID NO. 2 所示。
3. 包含權利要求1所述的脂肪酶基因 COLIP的重組表達載體。
4. 根據(jù)權利要求3所述的重組表達載體，其特征在于，所述重組表達載體為 pPIC-COLIP。
5. 包含權利要求1所述的脂肪酶基因 COLIP的重組基因工程菌。
6. 根據(jù)權利要求5所述的重組基因工程菌，其特征在于，所述重組基因工程菌的宿主 細胞為畢赤酵母GS115。
7. 權利要求3所述的脂肪酶基因 C0LIP的重組表達載體的制備方法，其特征在于， 包括如下步驟：（1)將合成的脂肪酶基因 C0LIP克隆到中間載體pMD18-T，獲得重組質粒 pMD-COLIP ; (2)以pPICZaA為載體，將該C0LIP基因通過feoR ?Λνο? I酶切位點插入 pPICZaA載體，構建成重組表達載體pPIC-COLIP。
8. 權利要求5所述的重組基因工程菌的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：（1) 將合成的脂肪酶基因 C0LIP克隆到中間載體pMD18-T，獲得重組質粒pMD-COLIP ;(2)以 pPICZaA為載體，將該C0LIP基因通過feoR Ι/Μ-- I酶切位點插入pPICZaA載體，構建成表 達載體pPIC-COLIP ; (3)將pPIC-COLIP導入畢赤酵母GS115宿主細胞中，獲得含脂肪酶基 因 C0LIP的畢赤酵母重組基因工程菌。
【文檔編號】C12R1/84GK104152471SQ201410416419
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2014年8月22日 優(yōu)先權日:2014年8月22日
【發(fā)明者】楊江科, 詹志春, 周文靜, 毛玲, 繆禮鴻 申請人:武漢輕工大學