一種人膽管癌血清中的腫瘤標(biāo)記物及其檢測方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種人膽管癌血清中的腫瘤標(biāo)記物及其檢測方法和應(yīng)用，主要是一種人膽管癌血清exosome中的微小RNA的序列及其檢測技術(shù)。所述腫瘤標(biāo)記物的miRNA序列為：miR-CCA序列：3’UGAUCGACUGUGCCUCUGGAU5’。檢測方法主要包括以下步驟：1.提取外周血血清，超濾離心去除大部分游離miRNA，保留exosome;2.exosome中miRNA的提取；3.通過RT-PCR方法檢測血清exosome中miR-CCA的表達(dá)水平。本發(fā)明能夠快速、便捷、準(zhǔn)確的檢查出血清exosome中miR-CCA的表達(dá)水平，有助于人膽管癌的診斷和鑒別診斷。
【專利說明】一種人膽管癌血清中的腫瘤標(biāo)記物及其檢測方法和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及人膽管癌的診斷方法,尤其是一種人膽管癌血清中的exosome miRNA 腫瘤標(biāo)志物及其檢測方法和應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 人膽管癌是繼肝癌之后的第二大肝膽系惡性腫瘤。目前，手術(shù)切除或肝移植是可 能治愈人膽管癌唯一有效的治療手段，但由于人膽管癌發(fā)病隱匿，侵襲性強，大部分患者就 診時已出現(xiàn)淋巴或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致其手術(shù)根治率低，因此總生存預(yù)后結(jié)局非常差，其5年生 存率僅為20% - 40%。早期預(yù)防、早期發(fā)現(xiàn)、早期治療是提高人膽管癌手術(shù)根治率和5年 生存率的關(guān)鍵。
[0003] 目前針對人膽管癌的診斷手段仍然有限，B超、CT、MRI等影像學(xué)檢查技術(shù)仍然是 人膽管癌的主要診斷方法，但當(dāng)患者出現(xiàn)臨床癥狀，或影像學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)腫瘤時，患者大多已 是進(jìn)展期腫瘤，手術(shù)切除率和根治率低，目前針對人膽管癌，仍然缺乏一種特異的和敏感的 血清學(xué)診斷方法。目前，血清CA 19-9是人膽管癌診斷的主要血清學(xué)腫瘤標(biāo)記物，對鑒別人 膽管癌和原發(fā)性肝癌具有一定的診斷價值，對人膽管癌術(shù)后復(fù)發(fā)亦有提示作用，但對人膽 管癌的早期診斷和早期發(fā)現(xiàn)，仍然缺乏特異性和敏感性，其它蛋白質(zhì)和肽類的血清學(xué)腫瘤 標(biāo)記物目前還未發(fā)現(xiàn)有優(yōu)于CA 19-9的。
[0004] 微小RNA(microRNA，miRNA)是一類內(nèi)源性的具有調(diào)控功能的長約20?25個核苷 酸的非編碼RNA，其功能是通過堿基互補配對的方式識別靶mRNA，導(dǎo)致靶mRNA降解或者阻 遏靶mRNA的翻譯，是真核生物基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)mRNA翻譯的重要手段。2008年，血清中的 miRNA首次被發(fā)現(xiàn)，其表達(dá)穩(wěn)定，在腫瘤分類、分子分期和追蹤轉(zhuǎn)移灶等方面具有獨特優(yōu)勢， 特別適合原發(fā)腫瘤的篩查和早期診斷。此后有多項研究均發(fā)現(xiàn)某些循環(huán)miRNA的表達(dá)水 平與腫瘤發(fā)生和預(yù)后存在相關(guān)性，相關(guān)的研究疾病包括肺癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌、胰腺 癌、結(jié)直腸癌等等。miRNA以其在血清中的穩(wěn)定性，易于檢測，與腫瘤發(fā)生相關(guān)性1?，具有其 特定的生物學(xué)功能等特點，成為新的腫瘤標(biāo)記物廣受重視。
[0005] 腫瘤細(xì)胞分泌入血清的miRNA主要有2種，一種稱為游離miRNA，另一種是通過外 切體（exosome)囊泡中的miRNA，稱為exosome miRNA。外切體（exosome)是指由多種細(xì)胞 分泌釋放到細(xì)胞外基質(zhì)的一種直徑約60?IOOnm的膜性囊泡，其內(nèi)可能含有MHC I類和/ 或II類分子、熱休克蛋白及一些生物酶類等，具有誘導(dǎo)機體免疫激活的功能。
[0006] 目前對于腫瘤相關(guān)的循環(huán)miRNA的研究大多集中于血清總體miRNA表達(dá)水平的變 化，而對血楽中exosomal miRNA表達(dá)水平的相關(guān)研究報道極少，其原因與血楽中exosome 分離困難、提取量少、費用昂貴有關(guān)。Exosomal miRNA在細(xì)胞外環(huán)境中比游離miRNA更加穩(wěn) 定，能抵御RNA酶、蛋白酶的降解，并且冷熱酸堿環(huán)境下它的活性改變不大；另外exosomal miRNA還具有獨特的介導(dǎo)細(xì)胞間通訊的功能，能特異性抑制靶細(xì)胞中的靶基因表達(dá)，因此與 血清總體miRNA相比，血清exosomal miRNA水平的變化更加能代表惡性腫瘤的生物學(xué)功能 的變化。發(fā)明人通過前期研究建立了一種基于超濾離心技術(shù)的exosome提取方法，極大地 簡化了 exosome的提取步驟和費用，可方便地用于血楽exosomal miRNA的提取和檢測。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于，克服現(xiàn)有缺陷，提供一種血清exosome miRNA腫瘤標(biāo)記物 (miR-CCA)為人膽管癌的早期診斷，提供新的檢測技術(shù)。
[0008] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明可采取下述技術(shù)方案：
[0009] 一種人膽管癌血清中的腫瘤標(biāo)記物，其miRNA序列為：
[0010] miR-CCA 序列：3, UGAUCGACUGUGCCUCUGGAU 5，。
[0011] 本發(fā)明的另一個目的是提供一種人膽管癌血清中腫瘤標(biāo)記物的檢測方法，包括以 下步驟：
[0012] a.提取外周血血清，超濾離心去除血清中大部分游離miRNA,保留exosome ;b.提 取exosome中的miRNA ;c.通過RT-PCR方法檢測血清exosome中miR-CCA的表達(dá)水平。
[0013] 進(jìn)一步，所述步驟 c 中采用的 RT 引物：GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTG GATACGACACTAGCT，上游引物：ATCCAGAGACACAG，下游通用引物：GTGCAGGGTCCGAGGT。
[0014] 具體的，前述核苷酸序列表為：
[0015]
[0016]

【權(quán)利要求】
1. 一種人膽管癌血清中的腫瘤標(biāo)記物，其特征在于，miRNA序列為：miR-CCA 序列：3' UGAUCGACUGUGCCUCUGGAU 5'
2. -種人膽管癌血清中的腫瘤標(biāo)記物的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟： 提取外周血血清，超濾離心去除血清中大部分游離miRNA,保留exosome;b.提取 exosome中的miRNA ;c.通過RT-PCR方法檢測血清exosome中miR-CCA的表達(dá)水平。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測方法，其特征在于，步驟c中采用的RT引物：GTCGTAT CCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACTAGCT，上游引物：ATCCAGAGACACAG，下游通 用引物：GTGCAGGGTCCGAGGT。
4. 如權(quán)利要求1所述的腫瘤標(biāo)記物在制備人膽管癌診斷試劑中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N15/11GK104372001SQ201410391140
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2014年8月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月11日
【發(fā)明者】曹利平, 丁國平, 陳炯煌 申請人:浙江大學(xué)