一種蠟樣芽孢桿菌及其在制備亞硝酸鹽還原酶中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種蠟樣芽胞桿菌及其在制備亞硝酸鹽還原酶中的應(yīng)用，所述芽孢桿菌從豆瓣醬中分離，經(jīng)鑒定為蠟樣芽孢桿菌（Bacilluscereus)LJ01,已于2014年6月19日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCCNo.9360。菌株LJ01用于制備亞硝酸鹽還原酶（NiR)，從蠟樣芽胞桿菌LJ01提取的NiR的活力高，NiR降解亞硝酸鹽的條件簡(jiǎn)單■’本發(fā)明所公開的條件可使NiR的酶活損失少，得到的NiR純度高，NiR為解決蔬菜發(fā)酵、肉制品和養(yǎng)殖水體等3個(gè)領(lǐng)域中含亞硝酸鹽的問題提供了一種新方法。
【專利說明】一種蠟樣芽孢桿菌及其在制備亞硝酸鹽還原酶中的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物制品領(lǐng)域，具體涉及利用來自傳統(tǒng)豆瓣醬中的蠟樣芽孢桿菌，及 其在制備亞硝酸鹽還原酶中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 亞硝酸鹽是一種潛在的致癌物質(zhì)，在蔬菜發(fā)酵過程中極易積累，給產(chǎn)品帶來潛在 的食品安全問題，且過量攝入亞硝酸鹽可誘發(fā)高鐵血紅蛋白癥，因此嚴(yán)格控制食品中亞硝 酸鹽的含量非常重要。許多研究表明亞硝酸鹽是亞硝胺的前體物，亞硝胺是一種強(qiáng)致癌物， 可以誘發(fā)消化系統(tǒng)中的多種癌變，如胃癌、腸癌和肝癌。鑒于食品可能存在超標(biāo)亞硝酸鹽污 染，肉制品中含有亞硝酸鹽的潛在食品安全問題，水產(chǎn)養(yǎng)殖水體亞硝酸鹽超標(biāo)導(dǎo)致潛在食 品安全問題等一系列的問題，尋求有效控制或降解亞硝酸鹽的方法勢(shì)在必行，除了加入食 用安全的微生物外，還可利用亞硝酸鹽還原酶（Nitrite reductase,簡(jiǎn)稱為NiR)進(jìn)行亞硝 酸鹽的生物降解。但是，目前對(duì)如何得到大量的食用安全的NiR還沒有很好的方法。
[0003] NiR是一種胞內(nèi)酶，在高等植物、藻類植物和許多微生物中廣泛存在。這些胞內(nèi)酶 在細(xì)胞內(nèi)能有效地發(fā)揮作用，但在細(xì)胞外效果較差。NiR是一種氧化還原酶，反應(yīng)過程中需 要電子傳遞體的參與，而且受氧氣的抑制。硝酸鹽還原和亞硝酸鹽還原是自然界中無機(jī)氮 轉(zhuǎn)化為有機(jī)氮的極其重要的過程，由于NiR是生物體在厭氧環(huán)境中產(chǎn)生的胞內(nèi)酶，所以其 活性受環(huán)境條件的影響較大，如pH、溫度、化學(xué)物質(zhì)、光照等。
[0004] 降解亞硝酸鹽的方法主要有：（1)氧化法，亞硝酸根離子中的氮為中間價(jià)態(tài)，具 有被氧化的特性，當(dāng)介質(zhì)中的NCV遇氧化劑時(shí)則會(huì)改變氮的價(jià)態(tài)，發(fā)生得失電子的變化而 被氧化，最終NCV會(huì)被轉(zhuǎn)變?yōu)槎拘暂^小甚至無毒的物質(zhì)，此法很少采用的主要原因是在這 些強(qiáng)氧化劑在常規(guī)使用濃度下對(duì)亞硝酸鹽減降解率低，此外氧化法降解亞硝酸鹽還存在 容易反彈的弱點(diǎn)；（2)還原法，利用NCV在酸性條件下具有氧化性而被還原的特點(diǎn)，將其 還原降解為易揮發(fā)氣體而自動(dòng)溢出，常冬寅發(fā)現(xiàn)鑄鐵屑對(duì)NCV有一定的脫除效果（常冬 寅，陳天虎，劉海波，等.氫氣還原針鐵礦去除水中的亞硝酸鹽，硅酸鹽學(xué)報(bào)，2012,40(8): 1197-1203)，且隨鑄鐵屑量的增加，脫除效果增加，但是其降解率只能達(dá)到90%，不能完全 將亞硝酸鹽降解掉（尹倫甫，陳昌福.降解亞硝酸鹽的方法與"調(diào)水降亞靈"的開發(fā)，五指 峰科技專欄，2008, 7:77) ; (3)微生物降解法，采用具有降解亞硝酸鹽活力的微生物來降解 亞硝酸鹽，主要有假單胞菌屬[陳瑞芳，徐長安，劉麗梅，等.一株假單胞菌的亞硝酸鹽降解 特性及其對(duì)魚池底泥的凈化作用，研究報(bào)告，2011，35 ￠) :30-33]，芽孢桿菌屬，乳桿菌[張 馨月，劉冬梅，許喜林，等.LCR6013降解亞硝酸鹽的途徑及其亞硝酸鹽還原的初步定位，現(xiàn) 代食品科技，2013,11 (29) :2627-2632]等，而在芽孢桿菌屬中，最常見的是枯草芽孢桿菌 [丁祥力，王震，陳薇，等.枯草芽孢桿菌WH-5的分離鑒定及凈水研究，湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011， (01) :15-19]，蠟樣芽孢桿菌降亞硝酸鹽未見報(bào)道。另外，在食品以及食品源頭中進(jìn)行降 解亞硝酸鹽，首先必須考慮是保證食用安全，但上述的氧化法中加強(qiáng)氧化劑、還原法中加鐵 屑、微生物降解中假單胞菌有一定毒性等必將影響食用安全，因此尋求一種食用安全、降解 亞硝酸鹽效果好的方法勢(shì)在必行。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明目的在于提供一種蠟樣芽胞桿菌及其NiR生產(chǎn)方法和應(yīng)用，利用傳統(tǒng)豆瓣 醬中的蠟樣芽胞桿菌，通過培養(yǎng)制備粗酶液，進(jìn)一步通過層析分離制備電泳純NiR。
[0006] 本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0007] 本發(fā)明從傳統(tǒng)豆瓣醬中分離出一株芽孢桿菌，編號(hào)為LJ01，根據(jù)菌株的形態(tài)特征、 生理生化和16S rDNA克隆分子鑒定的結(jié)果，確定LJOl菌株為蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus)，錯(cuò)樣芽孢桿菌（Bacillus cereus) LJOl已于2014. 6. 19保藏于中國微生物菌種保 藏管理委員會(huì)普通微生物中心（CGMCC)，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國科 學(xué)院微生物研究所，保藏編號(hào)為CGMCC No. 9360。
[0008] Bacillus cereus LJOl的16S rDNA測(cè)序用引物、反應(yīng)試劑、測(cè)序儀、方法：引物為 M13F(-47)為 CGCCAGGGITTTCCCAGTCACGAC(SEQ ID N0.2) ;M13R(-48)為 AGCGGATAACAAITT CACACAGGA(SEQ ID NO. 3);反應(yīng)試劑：BigDye⑧ Terminator ν3· ICycle Sequencing Kit (Applied Biosystems);測(cè)序儀：ABI PRISMTM3730XL DNA Analyzer;克隆所用試劑及 耗材：感受態(tài)細(xì)胞E. coli DH5a，pMD18_T(TaKaRa公司，如圖1)，氨芐青霉素；克隆測(cè)序方 法：（I)PCR擴(kuò)增，以菌株LJOl的DNA為模板，以M13F (-47)和M13R (-48)引物在一定條件下 擴(kuò)增；（2)樣品鑒定，利用瓊脂糖電泳鑒定PCR產(chǎn)物的特異性；（3)割膠回收純化目的PCR產(chǎn) 物；（4)將經(jīng)純化的PCR產(chǎn)物裝入pMD18-T載體并轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞E. coli DH5 α ; (5)測(cè) 序驗(yàn)證重組克隆中PCR產(chǎn)物的序列信息。重組克隆條件：氨芐青霉素抗性；質(zhì)粒DNA體積： 10 μ 1?20 μ 1 ;含質(zhì)粒的菌液體積：200 μ 1?300 μ 1 ;儲(chǔ)存條件：-20°C。根據(jù)16SrDNA測(cè) 序的結(jié)果（如附16SrDNA的核苷酸序列SEQ ID NO. 1)，繪制如圖3的進(jìn)化樹，菌株LJOl與 蠟樣芽胞桿菌的同源性高達(dá)100%。
[0009] Bacillus cereus LJOl (CGMCC NO. 9360)菌株具有如下特征，（1)形態(tài)特征：革蘭 氏陽性，桿狀，菌體單個(gè)，成對(duì)排列，有芽孢（如圖2)，菌落表面干燥不透明，邊緣不整齊，呈 蠟狀；液體培養(yǎng)基中呈沉淀性混濁。（2)生理生化特征：接觸酶陽性，氧化酶陰性，液化明 膠，還原硝酸鹽，淀粉水解陽性，苯丙氨酸脫氨酶陰性，能耐2%?10%的NaCl，檸檬酸鹽利 用陰性，卵凝脂酶陽性，吲哚試驗(yàn)陰性，脲酶試驗(yàn)陰性，酪素水解陰性，酪氨酸水解陰性，V-P 試驗(yàn)陽性，革蘭氏染色為陽性菌，兼性厭氧菌，不可利用L-阿拉伯糖、D-木糖、D-甘露糖、葡 萄糖產(chǎn)氣，可以利用D-葡萄糖，能運(yùn)動(dòng)，能在30°C、40°C溫度下生長，在50°C溫度不生長。
[0010] 根據(jù)LJOl保守序列16S rDNA的信息、形態(tài)特征和生理生化特征，鑒定LJOl菌株 為蠟樣芽胞桿菌。
[0011] 上述蠟樣芽孢桿菌在制備亞硝酸鹽還原酶中的應(yīng)用。具體包括如下步驟：
[0012] (1)將處于對(duì)數(shù)期生長的蠟樣芽孢桿菌LJOl的菌懸液接種于發(fā)酵誘導(dǎo)培養(yǎng)基中， 接種量為1%?5% (體積百分比），進(jìn)行誘導(dǎo)發(fā)酵培養(yǎng)，將得到的培養(yǎng)液離心得菌泥，用無 菌水清洗后離心，得菌體并稱重；所述的發(fā)酵誘導(dǎo)培養(yǎng)基為含50mg/mL?lOOmg/mL亞硝酸 鈉的肉湯培養(yǎng)基，PH7. 0?7. 6 ;
[0013] (2)加入提酶緩沖液，使LJOl菌體濃度為lOOmg/mL?500mg/mL，加入溶菌酶，混 勻后進(jìn)行LJOl菌體破壁（2h?5h)，破壁后的菌液經(jīng)離心后的上清液即為亞硝酸鹽還原酶 粗酶液。
[0014] 步驟（1)所述誘導(dǎo)發(fā)酵培養(yǎng)的條件為30°C?40°C，150r/min?250r/min搖床培 養(yǎng)，發(fā)酵時(shí)間為18h?30h。優(yōu)選地，所述發(fā)酵培養(yǎng)條件為30°C，180r/min搖床培養(yǎng)，發(fā)酵時(shí) 間 24h。
[0015] 步驟⑵所述溶菌酶的濃度為5mg/mL?20mg/mL。
[0016] 所述提酶緩沖液中含有1 μ g/mL?3 μ g/mL的胰蛋白酶抑制劑和0. 5 μ mol/mL? 2. 0 μ mol/mL 的二硫蘇糖醇（DTT)。
[0017] 所述亞硝酸鹽還原酶粗酶液還經(jīng)過如下分離純化步驟：所述粗酶液經(jīng)過DEAE Sepharose Fast Flow(高流速離子型瓊脂糖凝膠）陰離子交換層析柱和Sephadex G-150 (葡聚糖凝膠）葡聚糖凝膠層析柱中的一種或兩種層析，制得純亞硝酸鹽還原酶。
[0018] 其中，陰離子交換層析是將粗酶液上樣至陰離子交換層析柱上，先用無NaCl的 HEPES緩沖液將蛋白質(zhì)洗至基線，再用含OmM?500mM的NaCl的HEPES緩沖液進(jìn)行NaCl梯 度洗脫，分部收集，測(cè)定每個(gè)洗脫峰的亞硝酸鹽還原酶酶活，合并具有亞硝酸鹽還原酶的組 分，并用聚乙二醇20000濃縮；
[0019] 葡聚糖凝膠層析是經(jīng)陰離子交換層析后所得的亞硝酸鹽還原酶組分上樣至葡聚 糖凝膠層析柱上，用TriS-HCl緩沖液進(jìn)行洗脫，分部收集，測(cè)定每個(gè)洗脫峰的亞硝酸鹽還 原酶酶活，合并具有亞硝酸鹽還原酶酶活的組分。
[0020] 所述HEPES緩沖液（無NaCl和含NaCl)的濃度為20mM?lOOmM，pH為7. 0? 7. 6 ；
[0021] 所述Tris-HCl緩沖液的濃度為20mM?lOOmM，pH為7. 8?8. 6 ;
[0022] 所述陰離子交換層析和葡聚糖凝膠層析中洗脫的流速分別為lmL/min和0. 5mL/ min〇
[0023] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點(diǎn)：
[0024] (1)本發(fā)明中使用的蠟樣芽孢桿菌LJOl是發(fā)明人從豆瓣醬中篩選得到的，并進(jìn)行 了急性毒理實(shí)驗(yàn)證明是食用安全的，其發(fā)酵產(chǎn)酶穩(wěn)定，培養(yǎng)基來源廣泛，發(fā)酵生產(chǎn)成本低， 具有良好的商業(yè)前景。
[0025] (2)利用本發(fā)明方法的培養(yǎng)蠟樣芽孢桿菌LJ01，得到的亞硝酸鹽酶活力高，例如 以亞硝酸鈉為底物測(cè)定粗酶液的酶活，其最大酶活達(dá)到227. 93U，最大降解亞硝酸鹽的量為 250 μ g/mL〇
[0026] (3)所制備的NiR活力高，NiR降解亞硝酸鹽的條件簡(jiǎn)單，最適酶催化溫度為37°C， 最適pH為7. 4,在30°C?40°C內(nèi)具有穩(wěn)定的酶活。本發(fā)明所公開的條件可使NiR的酶活損 失少，得到的NiR純度高，NiR為解決蔬菜發(fā)酵、肉制品和養(yǎng)殖水體等3個(gè)領(lǐng)域中含亞硝酸 鹽的問題提供了 一種新方法。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0027] 圖1為用于蠟樣芽孢桿菌LJOl的16S rDNA克隆測(cè)序的質(zhì)粒pMD18-T圖譜。
[0028] 圖2為本發(fā)明所得蠟樣芽孢桿菌LJ 01的顯微鏡觀察圖（10X 100倍放大）。
[0029] 圖3為本發(fā)明實(shí)施所得蠟樣芽孢桿菌LJOl的16S rDNA基因進(jìn)化樹。
[0030] 圖4為蠟樣芽孢桿菌LJOl粗酶液用陰離子交換層析柱（DEAE S印harose Fast Flow)分離后的蛋白質(zhì)曲線圖（其中第3個(gè)峰有NiR活性）。
[0031] 圖5為蠟樣芽孢桿菌LJOl粗酶液經(jīng)陰離子柱分離后第3個(gè)峰的蛋白質(zhì)用葡聚糖 凝膠層析柱（Sepharose G-150)分離后的蛋白質(zhì)曲線圖（其中第2個(gè)峰有NiR活性）。
[0032] 圖6是本發(fā)明經(jīng)分離后酶液的SDS-PAGE凝膠電泳圖（分離膠濃度為12. 5 %，濃縮 膠濃度為4%，從左至右各條泳道分別為標(biāo)記蛋白、粗酶液、經(jīng)陰離子柱分離后酶液、經(jīng)葡聚 糖凝膠柱分離后19管、18管酶液）。

【具體實(shí)施方式】
[0033] 以下結(jié)合實(shí)例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。
[0034] 實(shí)施例1
[0035] 從LJOl試管斜面上挑取一環(huán)菌體至含IOOmL種子培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中，于 30°C和180r/min的恒溫?fù)u床上培養(yǎng)24h后，為LJOl種子液。所述種子培養(yǎng)基組成為：蛋白 胨l〇g，牛肉膏粉3g，NaC15g，蒸餾水1L，最終pH7. 4±0. 2。
[0036] 配制含50mg/mL?100mg/mL亞硝酸鈉，調(diào)節(jié)其pH為7· 4的發(fā)酵誘導(dǎo)培養(yǎng)基，于 121°C下滅菌冷卻后，按1%?5% (體積百分比）接種量接入LJOl種子液，于30°C?40°C 和150r/min?250r/min下培養(yǎng)18h?30h后，得發(fā)酵液于4°C和9000r/min下離心IOmin 后，除上清液，菌泥用無菌水洗后在4°C和9000r/min下離心IOmin,清洗和離心的操作重復(fù) 2次，得菌體并稱重，加入提酶緩沖液，使LJOl菌體濃度為lOOmg/mL?500mg/mL，加入溶菌 酶并使其濃度為5mg/mL?20mg/mL，混勻后于30°C和180r/min下進(jìn)行LJOl菌體破壁2h? 5h，然后在4°C用8000r/min離心20min，離心后的上清液為NiR粗酶液，測(cè)定其亞硝酸鹽酶 的酶活。
[0037] 將NiR粗酶液于4°C和8000r/min下離心5min，上清液上樣至預(yù)先用ρΗ7· 0?7. 6 的20mM?IOOmM的HEPES緩沖液平衡好的陰離子交換層析柱上，先用無NaCl的緩沖液將 蛋白質(zhì)洗至基線，再用含50mM?500mM的NaCl的緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，流速為lmL/min，分 部收集，測(cè)定每個(gè)洗脫峰的NiR酶活，合并具有NiR組分，并用聚乙二醇20000濃縮，備用。
[0038] 經(jīng)陰離子交換層析后所得的NiR組分上樣至預(yù)先用pH7. 8?8. 6的20mM?IOOmM 的Tris-HCl緩沖液平衡的葡聚糖凝膠層析柱上，用相同的Tris-HCl緩沖液進(jìn)行洗脫，流速 為0. 5mL/min，分部收集，測(cè)定每個(gè)洗脫峰的NiR酶活，合并具有NiR酶活的組分，備用。
[0039] 以亞硝酸鈉為底物，采用分光光度法測(cè)定各步驟得到的酶液的NiR酶活。具體測(cè) 定和計(jì)算方法如下：稱取5mg亞硝酸鈉溶于IL蒸餾水中得到濃度為5 μ g/L的亞硝酸鹽溶 液；分別吸取〇· 〇mL、0. 2mL、0. 4mL、0. 6mL、0. 8mL、l. 0mL、L 5mL、2. 0mL、2. 5mL的5μ g/L亞硝 酸鹽溶液于25mL容量管中，加蒸餾水定容至20mL，再分別加入2mL的0. 4%對(duì)氨基苯磺酸， 搖勻，靜置3111；[11?51]1；[11，最后加入11111^的0.2%鹽酸萘乙二胺，用蒸饋水定容251111^搖勻，靜 置15min，用分光光度計(jì)測(cè)定前述的反應(yīng)液在538nm的吸光度，以亞硝酸鹽濃度為橫坐標(biāo)， 以測(cè)的的吸光度為縱坐標(biāo)，制訂亞硝酸鹽-吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線和方法；取ImL待測(cè)樣品加入 到251^容量瓶，加蒸餾水定容至201^，再分別加入21^的0.4%對(duì)氨基苯磺酸，搖勻，靜置 3111；[11?51]1；[11，最后加入11111^的0.2 (%鹽酸萘乙二胺，用蒸饋水定容251111^搖勻，靜置151]1；[11， 用分光光度計(jì)測(cè)定其在538nm的吸光度，該吸光度代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程后，可計(jì)算出待測(cè)樣 品中的亞硝酸鹽含量，單位為μ g/L。
[0040] NiR反應(yīng)體系（總體積為500 μ L):在300 μ L的ρΗ7· 4的50mM的HEPES緩沖溶液 為反應(yīng)液中，加入100 μ L的500 μ g/mL亞硝酸鹽（使亞硝酸鹽濃度為100 μ g/mL),再加入 100 μ L酶液，于30°C?37°C下靜置反應(yīng)16h?24h后，滅酶，最后測(cè)定反應(yīng)體系中亞硝酸鹽 含量。
[0041] NiR的酶活單位：在反應(yīng)體系每小時(shí)每毫克蛋白質(zhì)降解亞硝酸鈉的納克（ng)數(shù)為 一個(gè)酶活單位（U)。酶活計(jì)算公式如下：Activity (U) =m/(MXt),其中m為降解的亞硝酸 鈉的質(zhì)量，單位為ng ;M為反應(yīng)物中酶蛋白質(zhì)的質(zhì)量，單位為mg ;t為反應(yīng)時(shí)間，單位為min。
[0042] 實(shí)施例2
[0043] 蠟樣芽孢桿菌生產(chǎn)制備NiR的方法
[0044] 將含100mg/mL亞硝酸鈉、pH為7. 4的發(fā)酵誘導(dǎo)培養(yǎng)基（肉湯培養(yǎng)基），于121°C 下滅菌冷卻后，按2% (體積百分比）接種量接入LJOl種子液，于30°C和250r/min下培養(yǎng) 24h后，得發(fā)酵液于4°C和9000r/min離心IOmin后，除上清液，菌泥用無菌水洗后在4°C和 9000r/min下離心lOmin，清洗和離心的操作重復(fù)2次，得菌體并稱重，加入提酶緩沖液（含 有3 μ g/mL的胰蛋白酶抑制劑和0. 5 μ mol/mL的DTT)，使LJOl菌體濃度為200mg/mL，加入 溶菌酶，使溶菌酶濃度為20mg/mL，混勻后于30°C和180r/min下進(jìn)行LJOl菌體破壁3h，然 后在4°C用8000r/min離心20min，離心后的上清液為NiR粗酶液，其NiR酶活為227. 93U。
[0045] 將NiR粗酶液于4°C和8000r/min下離心5min，上清液上樣至預(yù)先用ρΗ7· 4的50mM 的HEPES緩沖液平衡好的DEAE Sepharose Fast Flow陰離子交換層析柱上，先用無NaCl的 緩沖液將蛋白質(zhì)洗至基線，再用含OmM?200mM的NaCl的HEPES緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，流速 為lmL/min，分部收集，從左到右蛋白峰的洗脫NaCl濃度為OmM、100mM、200mM，整個(gè)洗脫階 段出現(xiàn)3個(gè)大小不一的蛋白質(zhì)峰（圖4)，在測(cè)定酶活時(shí)發(fā)現(xiàn)在測(cè)定酶活時(shí)發(fā)現(xiàn)第3個(gè)峰具 有NiR活性，合并具有NiR活性的組分，并用聚乙二醇20000濃縮，其NiR酶活為2540. 67U。
[0046] 經(jīng)陰離子交換層析后所得的NiR組分上樣至預(yù)先用pH8. 0的50mM的Tris-HCl緩 沖液平衡的S印hadex G-150葡聚糖凝膠層析柱上，用相同的Tris-HCl緩沖液進(jìn)行洗脫，流 速為0. 5mL/min，分部收集，洗脫過程中出現(xiàn)3個(gè)不同的蛋白質(zhì)峰（圖5)，在對(duì)各個(gè)洗脫峰 進(jìn)行活性測(cè)定時(shí)，分部收集并合并具有NiR活性的組分，其NiR酶活為4004. 89U。
[0047] 以上陰離子交換層析和葡聚糖凝膠層析等步驟中，NiR的純化倍數(shù)和得率如下 表1所示。各步驟分離后獲得的NiR的SDS-PAGE電泳圖如圖6所示，經(jīng)葡聚糖凝膠層析 收集的NiR經(jīng)SDS-PAGE電泳后可以看到較明顯的條帶，經(jīng)過葡聚糖凝膠過濾后的目的 蛋白條帶含量很少，因此跑出來的條帶顏色很淺，NiR的分子量最可能為60KDa，與文獻(xiàn) (Javier Vigara, Maria I, Garcia-Sanchez, et al. Purification and characterization of ferredoxin-nitrite reductase from the eukaryotic microalga Monoraphidium braunii. Plant Physiology and Biochemistry, 2002(40) :401-405)的粒藻中含鐵氧還原 蛋白的亞硝酸鹽還原酶（其分子量為63KDa)接近，說明本發(fā)明的NiR種類可能與粒藻中的 NiR種類相同，這種差異與NiR的亞基結(jié)構(gòu)有關(guān)。
[0048] 表1蠟樣芽孢桿菌LJOl的NiR純化
[0049]

【權(quán)利要求】
1. 一種錯(cuò)樣芽孢桿菌，其特征在于，該芽孢桿菌為錯(cuò)樣芽孢桿菌（Bacillus cereus) LJ01，已于2014年6月19日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，簡(jiǎn)稱 CGMCC，保藏編號(hào)為 CGMCC No. 9360。
2. 權(quán)利要求1所述蠟樣芽孢桿菌在制備亞硝酸鹽還原酶中的應(yīng)用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，包括如下步驟： (1) 將處于對(duì)數(shù)期生長的蠟樣芽孢桿菌LJOl的菌懸液接種于發(fā)酵誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，接種 量為1%?5%體積百分比，進(jìn)行誘導(dǎo)發(fā)酵培養(yǎng)，將得到的培養(yǎng)液離心得菌泥，用無菌水清 洗后離心，得菌體并稱重； (2) 加入提酶緩沖液，使LJOl菌體濃度為lOOmg/mL?500mg/mL，加入溶菌酶，混勻后 進(jìn)行LJOl菌體破壁，破壁后的菌液經(jīng)離心后的上清液即為亞硝酸鹽還原酶粗酶液。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，步驟（1)所述誘導(dǎo)發(fā)酵培養(yǎng)的條件為 30°C?40°C，150r/min?250r/min搖床培養(yǎng)，發(fā)酵時(shí)間為18h?30h。
5. 根據(jù)權(quán)利要求書3所述的應(yīng)用，其特征在于，步驟（2)所述溶菌酶的濃度為5mg/ mL ?20mg/mL〇
6. 根據(jù)權(quán)利要求書3所述的應(yīng)用，其特征在于，步驟⑵所述的提酶緩沖液中含有胰蛋 白酶抑制劑和二硫蘇糖醇，其濃度分別為1 μ g/mL?3 μ g/mL和0. 5 μ mol/mL?2. 0 μ mol/ mL〇
7. 根據(jù)權(quán)利要求書3或4或5或6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述亞硝酸鹽還原酶粗 酶液還經(jīng)過如下分離純化步驟：所述粗酶液經(jīng)過高流速離子型瓊脂糖凝膠DEAE Sepharose Fast Flow陰離子交換層析柱和葡聚糖凝膠Sephadex G-150層析柱中的一種或兩種層析， 制得純亞硝酸鹽還原酶。
8. 根據(jù)權(quán)利要求書7所述的應(yīng)用，其特征在于， 陰離子交換層析是將粗酶液上樣至陰離子交換層析柱上，先用無NaCl的HEPES緩沖液 將蛋白質(zhì)洗至基線，再用含OmM?500mM的NaCl的HEPES緩沖液進(jìn)行NaCl梯度洗脫，分部 收集，測(cè)定每個(gè)洗脫峰的亞硝酸鹽還原酶酶活，合并具有亞硝酸鹽還原酶的組分，并用聚乙 二醇20000濃縮； 葡聚糖凝膠層析是經(jīng)陰離子交換層析后所得的亞硝酸鹽還原酶組分上樣至葡聚糖凝 膠層析柱上，用Tris-HCl緩沖液進(jìn)行洗脫，分部收集，測(cè)定每個(gè)洗脫峰的亞硝酸鹽還原酶 酶活，合并具有亞硝酸鹽還原酶酶活的組分。
9. 根據(jù)權(quán)利要求書8所述的應(yīng)用，其特征在于， 所述HEPES緩沖液的濃度為20mM?lOOmM，pH為7. 0?7. 6 ; 所述Tris-HCl緩沖液的濃度為20mM?lOOmM，pH為7. 8?8. 6 ; 所述陰離子交換層析和葡聚糖凝膠層析中洗脫的流速分別為lmL/min和0. 5mL/min。
10. 根據(jù)權(quán)利要求書8所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的發(fā)酵誘導(dǎo)培養(yǎng)基為含50mg/ mL?100mg/mL亞硝酸鈉的肉湯培養(yǎng)基，pH7. 0?7. 6。
【文檔編號(hào)】C12N9/06GK104212739SQ201410390980
【公開日】2014年12月17日 申請(qǐng)日期:2014年8月8日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月8日
【發(fā)明者】劉冬梅, 羅彤暉, 郭均, 吳暉, 李曉鳳, 袁現(xiàn) 申請(qǐng)人:華南理工大學(xué)