青蒿AaMYBL1蛋白編碼序列及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】的青蒿AaMYBL1蛋白編碼序列及其應(yīng)用。所述青蒿MYB-like類轉(zhuǎn)錄因子編碼序列AaMYBL1，所述編碼序列編碼的氨基酸序列如SEQ?ID?NO：4所示。本發(fā)明的編碼R3MYB類轉(zhuǎn)錄因子AaMYBL1，參與調(diào)控青蒿腺毛的密度；利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將青蒿AaMYBL1轉(zhuǎn)錄因子干擾載體轉(zhuǎn)化青蒿可以有效調(diào)控青蒿表皮的腺毛密度，從而提高青蒿素的含量。在非轉(zhuǎn)基因普通青蒿的葉片表皮腺毛密度為24個每平方毫米，抑制AaMYBL1基因表達(dá)的轉(zhuǎn)基因青蒿的葉片腺毛密度提高到34個每平方毫米。而每片葉片總腺毛數(shù)量從61947個提高到93683個。與之對應(yīng)的青蒿素含量從非轉(zhuǎn)基因青蒿的8mg/g?DW提高到12mg/g?DW，該發(fā)明對于為青蒿素的規(guī)?；a(chǎn)提供高產(chǎn)、穩(wěn)定新藥源具有重要意義。
【專利說明】青蒿AaMYBLI蛋白編碼序列及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種青蒿AaMYBLI蛋白編碼序列及其應(yīng) 用。

【背景技術(shù)】
[0002] 植物新陳代謝分為初生代謝和次生代謝，初生代謝產(chǎn)物（如糖類、脂類和核酸）存 在于所有植物中，是維持細(xì)胞生命活動所必需的，而植物次生代謝產(chǎn)物是指植物中一大類 并非植物生長發(fā)育所必需的小分子有機化合物，其產(chǎn)生和分布具有種屬、組織器官和生長 發(fā)育特異性。大多數(shù)植物葉片表面并不是光滑的，而是具有許多類型的毛狀結(jié)構(gòu)。根據(jù)其功 能和形態(tài)分為兩大類：一類是不具有分泌功能的纖毛；另一類是具有分泌功能的腺毛。前 一類的主要代表是棉花的棉纖維，它是棉花種子表皮特化的單細(xì)胞纖毛。而分泌型腺毛是 植物表皮細(xì)胞特化出的一種多細(xì)胞結(jié)構(gòu)，近年來對腺毛的研究發(fā)現(xiàn)，許多有價值的次生代 謝產(chǎn)物都是在這一結(jié)構(gòu)中特異性合成和儲存。比如以薄荷精油，玫瑰精油為代表的一大類 天然香精香料；以青蒿素為代表的中草藥有效成分；以啤酒花為代表的天然植物添加劑。
[0003] 在天然植株中產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物含量極低，而使用化學(xué)合成的方法，工藝流程 復(fù)雜、成本高，并且很多次生代謝產(chǎn)物添加到食品化妝品行業(yè)，使用天然的植物材料更加安 全。因此，研究人員開始探索其他的提高植物次生代謝產(chǎn)物含量的方法，在諸多方法之中， 提高腺毛密度被認(rèn)為是一種直接有效的方法。在腺毛中特異性合成的次生代謝產(chǎn)物有個共 同的特點，即參與這些次生代謝產(chǎn)物合成的關(guān)鍵酶基因只在腺毛中特異表達(dá)。因此，利用基 因工程的方法調(diào)控腺毛密度是頗具應(yīng)用價值的植物遺傳操作手段。
[0004] 近年來，在非分泌型的單細(xì)胞腺毛發(fā)育調(diào)控中，研究人員已經(jīng)取得了很多成果。比 如，在模式植物擬南芥中，單細(xì)胞纖毛的發(fā)育調(diào)控機制已經(jīng)基本清楚。在有重要經(jīng)濟價值的 棉花中，單細(xì)胞纖毛（棉纖維）的發(fā)育調(diào)控機制也取得了很多的研究成果。而在次生代謝 領(lǐng)域，關(guān)于分泌型腺毛的報道還比較少。特別是在傳統(tǒng)中草藥青蒿的研究中，研究主要集中 在對合成關(guān)鍵酶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控方面，還沒有調(diào)控腺毛密度的報道。
[0005] 如果通過對青蒿栽培種的品種分析，轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)分析等技術(shù)，從青蒿中克隆 出可以調(diào)控青蒿腺毛密度的基因，那么就可以使用基因工程手段提高青蒿葉片表皮腺毛密 度，從而提高重要次生代謝產(chǎn)物青蒿素的含量。通過對兩個地區(qū)青蒿栽培種的品種分析，從 青蒿中克隆了一個R3MYB類轉(zhuǎn)錄因子，采用基因工程手段，將該轉(zhuǎn)錄因子干擾載體轉(zhuǎn)化青 蒿，可以顯著提高青蒿腺毛密度，從而提高青蒿中的次生代謝物質(zhì)青蒿素的含量。為提高青 蒿素含量提供了一種新的策略和靶標(biāo)基因。為進(jìn)一步研究青蒿腺毛發(fā)育提供了理論基礎(chǔ)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種青蒿AaMYBLI蛋白編碼序 列，該基因編碼R3MYB類轉(zhuǎn)錄因子（AaMYBLI)，它參與調(diào)控青蒿腺毛的密度；利用轉(zhuǎn)基因技 術(shù)將青蒿AaMYBLI轉(zhuǎn)錄因子干擾載體轉(zhuǎn)化青蒿可以有效調(diào)控青蒿表皮的腺毛密度，從而 提高青蒿素的含量。在非轉(zhuǎn)基因普通青蒿的葉片表皮腺毛密度為24個每平方毫米，抑制 AaMYBLl基因表達(dá)的轉(zhuǎn)基因青蒿的葉片腺毛密度提高到34個每平方毫米。而每片葉片總 腺毛數(shù)量從61947個提高到93683個（圖1)。與之對應(yīng)的青蒿素含量從非轉(zhuǎn)基因青蒿的 8mg/g DW提高到12mg/g DW(圖2)，該發(fā)明對于為青蒿素的規(guī)?；a(chǎn)提供高產(chǎn)、穩(wěn)定新藥 源具有重要意義。
[0007] 本發(fā)明是通過以下的技術(shù)方案實現(xiàn)的，
[0008] 第一方面，本發(fā)明涉及一種青蒿MYB-like類轉(zhuǎn)錄因子編碼序列AaMYBLl，所述編 碼序列編碼的氨基酸序列如SEQ ID N0 :4所不。
[0009] 優(yōu)選地，所述編碼序列的核苷酸序列如SEQ ID N0 :3所示。
[0010] 第二方面，本發(fā)明涉及一種多肽，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID N0 :4所示。
[0011] 第三方面，本發(fā)明涉及一種前述的青蒿MYB-like類轉(zhuǎn)錄因子編碼序列AaMYBLl在 提高青蒿素含量中的應(yīng)用，所述編碼序列通過提高青蒿腺毛密度而提高青蒿素含量。
[0012] 優(yōu)選地，所述應(yīng)用包括如下步驟：
[0013] 步驟一，將青蒿MYB-like類轉(zhuǎn)錄因子編碼序列AaMYBLl連于植物表達(dá)調(diào)控序列 上，構(gòu)建含青蒿MYB-like類轉(zhuǎn)錄因子編碼序列的植物表達(dá)載體；
[0014] 步驟二，將步驟一中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，將農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)入青蒿；
[0015] 步驟三，通過抗生素篩選，獲得含有青蒿青蒿MYB-like類轉(zhuǎn)錄因子編碼序列 AaMYBLl的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，再生轉(zhuǎn)基因植株，所述轉(zhuǎn)基因植株的青蒿素含量得到提高。
[0016] 優(yōu)選地，步驟二中，所述轉(zhuǎn)入具體為：采用凍融法進(jìn)行轉(zhuǎn)入。
[0017] 第四方面，本發(fā)明涉及一種提高青蒿中青蒿素含量的方法，包括如下步驟：
[0018] (1)對兩個青蒿栽培種MYB類轉(zhuǎn)錄因子分析，從青蒿cDNA文庫中克隆到青蒿 R3MYB類轉(zhuǎn)錄因子AaMYBLl ;
[0019] (2)把AaMYBLl基因可操作性地連接于表達(dá)調(diào)控序列，形成含AaMYBLl基因的植物 RNA干擾載體；
[0020] (3)將含AaMYBLl基因的植物干擾表達(dá)載體轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌H1105,獲得具有該干 擾表達(dá)載體的根癌農(nóng)桿菌菌株；
[0021] (4)利用所構(gòu)建的根癌農(nóng)桿菌菌株轉(zhuǎn)化青蒿，經(jīng)卡那霉素篩選得到抗性苗，再經(jīng) PCR檢測為陽性的植株即為轉(zhuǎn)基因青蒿苗；
[0022] (5)對獲得的轉(zhuǎn)基因青蒿進(jìn)行腺毛密度通過，獲得腺毛密度顯著提高的轉(zhuǎn)基因青 蒿，進(jìn)而獲得青蒿素含量提高的青蒿植株。
[0023] 優(yōu)選地，步驟（4)中，所述的經(jīng)PCR檢測的轉(zhuǎn)基因青蒿植株是指，分別設(shè)計合成 AaMYBLl基因的檢測引物，進(jìn)行DNA擴增，紫外線下觀察到目的條帶的陽性株系即為轉(zhuǎn)基因 青蒿植株，所述的腺毛密度檢測是指在熒光顯微鏡下，青蒿分泌型腺毛在特定波長下顯示 明亮熒光，經(jīng)拍照后再統(tǒng)計其數(shù)量和密度。
[0024] 其中，對獲得的轉(zhuǎn)基因青蒿中青蒿素含量進(jìn)行HPLC-ELSD測定。
[0025] 本發(fā)明通過對兩個青蒿品種分析，從青蒿中克隆AaMYBLl基因，構(gòu)建含AaMYBLl 基因的植物干擾表達(dá)載體，用根癌農(nóng)桿菌EH105介導(dǎo)，采用葉盤法將AaMYBLl基因干擾表 達(dá)載體轉(zhuǎn)化青蒿；PCR檢測外源目的基因 AaMYBLl的整合情況，通過熒光顯微鏡觀察和統(tǒng) 計腺毛密度，獲得了腺毛密度顯著提高的轉(zhuǎn)基因青蒿；高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測器 (HPLC-ELSD)測定青蒿中青蒿素含量，表明獲得的青蒿表皮腺毛密度顯著提高的轉(zhuǎn)基因青 蒿中的青蒿素含量也顯著提高。
[0026] 在本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體，包括質(zhì)粒，粘粒等。在 生產(chǎn)本發(fā)明的青蒿AaMYBLl蛋白多肽時，可以將青蒿AaMYBLl蛋白編碼序列可操作地連于 表達(dá)調(diào)控序列，從而形成青蒿AaMYBLl蛋白表達(dá)載體。
[0027] 如本文所用，"可操作地連于"指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠影 響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號肽DNA作為前體表達(dá)并參與多肽的 分泌，那么信號肽（分泌前導(dǎo)序列）DNA就是可操作地連于多肽DNA ;如果啟動子控制序列 的轉(zhuǎn)錄，那么它是可操作地連于編碼序列；如果核糖體結(jié)合位點被置于能使其翻譯的位置 時，那么它是可操作地連于編碼序列。一般，"可操作地連于"意味著相鄰，而對于分泌前導(dǎo) 序列則意味著在閱讀框中相鄰。
[0028] 本發(fā)明中所涉及的農(nóng)桿菌為根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens)菌 株H1105,該菌株可以從市場上公開購買（來源于澳大利亞CAMBIA公司，菌株編號為 Gambarl)〇

【專利附圖】

【附圖說明】
[0029] 通過閱讀參照以下附圖對非限制性實施例所作的詳細(xì)描述，本發(fā)明的其它特征、 目的和優(yōu)點將會變得更明顯：
[0030] 圖1在青蒿中抑制AaMYBLl的表達(dá)提高了腺毛密度。
[0031] 圖2在青蒿中抑制AaMYBLl的表達(dá)提高了青蒿素和二氫青蒿酸含量。

【具體實施方式】
[0032] 下面對本發(fā)明的實施例作詳細(xì)說明：本實施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行 實施，給出了詳細(xì)的實施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護范圍不限于下述的實施 例。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等分子 克?。簩嶒炇沂謨裕∟ew York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條 件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0033] 實施例1、青蒿AaMYBLl某閔的克降
[0034] 1.青蒿基因組總RNA的提取
[0035] 取青蒿葉片組織，置于液氮中研碎，加入盛有裂解液的1. 5mL Eppendorf (EP)離心 管中，充分振蕩后，按照TIANGEN試劑盒的說明書抽提總RNA。用甲醛變性膠電泳鑒定總RNA 質(zhì)量，然后在分光光度計上測定RNA含量。
[0036] 2.青蒿AaMYBLl基因的克隆
[0037] 以所提取的總RNA為模板，在PowerScript反轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成cDNA ;根據(jù) AaMYBLl基因的序列設(shè)計基因特異性引物（SEQ ID NO: 1和SEQ ID N0:2)，通過PCR從總 cDNA中擴增AaMYBLl基因，并測序。
[0038] 通過上述步驟，獲得了青蒿中該轉(zhuǎn)錄因子的全長編碼序列（SEQ ID N0:3)并推導(dǎo) 出其蛋白編碼序列（SEQ ID NO :4)，其中，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TGA。
[0039] 實施例2、含AaMYBLl某閔的棺物雙元干擾表汰載體的構(gòu)律
[0040] 1.中間載體pENTY-AaMYBLl的構(gòu)建
[0041] 在AaMYBLl基因的非保守區(qū)域設(shè)計上游引物和下游引物，用以構(gòu)建干擾載體。在 上游引物ATG堿基前添加 CACC四個堿基以構(gòu)建Gateway入門載體。按照Invitrogen公司 pENTRTM/D-T0P0? Cloning Kit的操作步驟，先用平端酶擴增得到AaMYBLl的片段，回收純 化后通過Gateway克隆技術(shù)連接到pENTR/D-TOPO載體。
[0042] 2.植物表達(dá)干擾載體pHELLSGATE-AaMYBLli的構(gòu)建
[0043] 按照 Invitrogen公司的LR Clonase? II Enzyme試劑盒的操作，將pENTR-AaMYBLl 載體中的AaMYBLl的干擾片段重組到RNA干擾載體pHELLSGATE的兩個可以形成發(fā)夾結(jié)構(gòu) 的重組位點中，得到AaMYBLl的RNA干擾載體pHELLSGATE-AaMYBLli。
[0044] 本實施例將青蒿AaMYBLl基因可操作性地連接于表達(dá)調(diào)控序列，形成含AaMYBLl 發(fā)卡結(jié)構(gòu)的植物表達(dá)干擾載體，該載體可用于通過代謝工程策略來調(diào)控青蒿中青蒿素的含 量。
[0045] 實施例3、根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的AaMYBLl干擾載體遺傳轉(zhuǎn)化青蒿獲得轉(zhuǎn)某閔青蒿棺 株
[0046] 1.含AaMYBLl干擾表達(dá)載體的根癌農(nóng)桿菌工程菌的獲得
[0047] 將實施例2中含AaMYBLl的植物雙元干擾表達(dá)載體采用凍融法轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌 (如EHA105,為市場有公開出售的生物材料，可以從澳大利亞CAMBIA公司購得，菌株編號為 Gambarl)，并進(jìn)行PCR驗證。結(jié)果表明，含AaMYBLl的植物雙元干擾表達(dá)載體已成功構(gòu)建到 根癌農(nóng)桿菌菌株中。
[0048] 2.根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)AaMYBLl基因轉(zhuǎn)化青蒿
[0049] 2. 1.外植體的預(yù)培養(yǎng)
[0050] 青蒿種子用75%乙醇浸泡111^11，再用20%似(：10浸泡2〇1^11，無菌水沖洗3-4次， 用無菌吸水紙吸干表面水分，接種于無激素的MS(Murashige and Skoog，1962)固體培養(yǎng)基 中，25°C、16h/8h(light/dark)光照培養(yǎng)，即可獲得青蒿無菌苗。待苗長至5cm左右后，剪 取無菌苗葉片外植體用于轉(zhuǎn)化。
[0051] 2. 2.農(nóng)桿菌與外植體的共培養(yǎng)
[0052] 將所述的葉片外植體，轉(zhuǎn)到共培養(yǎng)培養(yǎng)基（l/2MS+AS100ymol/L)中，滴加含活化 好的所述含AaMYBLl植物雙元干擾表達(dá)載體的根癌農(nóng)桿菌工程菌的1/2MS懸液，使外植體 與菌液充分接觸，28°C暗培養(yǎng)3d。以滴加在不帶有目的基因的根癌農(nóng)桿菌的1/2MS液體培 養(yǎng)基懸液的葉片外植體為對照。
[0053] 2. 3.抗性再生植株的篩選
[0054] 將所述的共培養(yǎng)3d的青蒿外植體轉(zhuǎn)入到發(fā)芽篩選培養(yǎng)基（MS+6-BA0. 5mg/ L+NAA0. 05mg/L+Kan50mg/L+Cb500mg/L)上于 25°C、16h/8h 光照培養(yǎng)，每兩周繼代培養(yǎng)一 次，經(jīng)過2-3次繼代后即可獲得Kan抗性叢生芽。將生長良好的抗性叢生芽剪下轉(zhuǎn)入生根 培養(yǎng)基（1/2MS+Cbl25mg/L)上培養(yǎng)至生根，從而獲得Kan抗性再生青蒿植株。
[0055] 3.轉(zhuǎn)基因青蒿植株的PCR檢測
[0056] 根據(jù)目的基因所在表達(dá)盒上游的35S啟動子區(qū)域和AaMYBLl分別設(shè)計正向引物設(shè) 計和反向引物對目的基因進(jìn)行檢測。結(jié)果表明，利用所設(shè)計的PCR特異引物，能擴增出特異 DNA片段。而以非轉(zhuǎn)化青蒿基因組DNA為模板時，沒有擴增出任何片段。
[0057] 本實施例將所述的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌，獲得用于轉(zhuǎn)化青蒿的含 AaMYBLl植物雙元干擾表達(dá)載體的根癌農(nóng)桿菌菌株，利用所構(gòu)建的根癌農(nóng)桿菌菌株轉(zhuǎn)化青 蒿，獲得經(jīng)PCR檢測的轉(zhuǎn)基因青蒿植株。轉(zhuǎn)基因青蒿植株的獲得為篩選獲得較高青蒿素含 量的青蒿株系提供了直接素材。
[0058] 實施例4、轉(zhuǎn)某閔青蒿表皮腺毛密度和總腺毛數(shù)量的統(tǒng)計
[0059] 使用奧林巴斯公司的BX51型號顯微鏡，在波長為450nm-480nm的激發(fā)光下觀察非 轉(zhuǎn)基因青蒿和轉(zhuǎn)AaMYBLli干擾載體青蒿的葉片。取同等大小的青蒿葉片，在不同的5個位 置隨機取樣，統(tǒng)計腺毛密度。測量青蒿葉片總面積，計算得到每個葉片總腺毛數(shù)量。
[0060] 在本發(fā)明中轉(zhuǎn)AaMYBLli干擾載體青蒿的腺毛密度顯著提高。在非轉(zhuǎn)基因青蒿的 腺毛密度為24個每平方毫米時，抑制AaMYBLl基因表達(dá)的轉(zhuǎn)基因青蒿的葉片腺毛密度提高 到34個每平方毫米。而每片葉片總腺毛數(shù)量從61947個提高到93683個（圖1)。圖1 :在 青蒿中抑制AaMYBLl的表達(dá)提高了腺毛密度。A，半定量檢測AaMYBLl-RNAi青蒿中AaMYBLl 表達(dá)量。B，定量PCR檢測AaMYBLl-RNAi青蒿中AaMYBLl表達(dá)量。C，熒光顯微鏡觀察野生 型青蒿葉片腺毛。D，熒光顯微鏡觀察AaMYBLl-RNAi青蒿葉片腺毛。E，每個葉片總腺毛數(shù) 量統(tǒng)計。*，Ρ〈〇. 〇1(Τ檢驗）。F，腺毛密度統(tǒng)計。*，P〈0. 01(T檢驗）。
[0061] 實施例5、利用HPLC-ELSD測定轉(zhuǎn)某閔青蒿中青蒿素含量
[0062] 1. HPLC-ELSD條件及系統(tǒng)適用性以及標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制
[0063] HPLC :采用water alliance2695系統(tǒng)，色譜柱為C-18反相娃膠柱 (SymmetryShieldTM C18,5ym，250X4.6mm，Waters),流動相為甲醇：水，甲醇：水的體積 比為70:30,柱溫30°C，流速1. OmL/min，進(jìn)樣量10 μ L，靈敏度（AUFS = 1. 0)，理論塔板數(shù)按 青蒿素峰計算不低于2000。
[0064] ELSD :采用water alliance2420系統(tǒng)，蒸發(fā)光散射檢測器漂移管溫度40°C，放 大系數(shù)（gain)為7,載氣壓力5bar ;
[0065] 精密稱取青蒿素標(biāo)準(zhǔn)品（Sigma公司）2. Omg用lmL甲醇完全溶解，得到2mg/mL青 蒿素標(biāo)準(zhǔn)品溶液，保存于_20°C備用。
[0066] 本發(fā)明中流動相為甲醇（methanol):水，比例為70% :30%時，青蒿素的保留時間 為5. lmin，峰型良好。理論塔板數(shù)按青蒿素計算不低于2000。
[0067] 2.標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作
[0068] 將所述對照品溶液在相應(yīng)色譜條件下分別進(jìn)樣2μ 1，4μ 1，6μ 1，8μ 1，10μ 1記 錄圖譜及色譜參數(shù)，分別以峰面積（γ)對標(biāo)準(zhǔn)品含量（X，μ g)進(jìn)行回歸分析。通過研究，本 發(fā)明中青蒿素在4-20 μ g范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的log-log線性關(guān)系。青蒿素對照品的log-log 線性回歸方程為：Y = 1. 28e+000X+4. 71e+000, R = 0· 979546。
[0069] 3.樣品的制備和青蒿素含量的測定
[0070] 在青蒿植株的上，中和下部共取2g新鮮的青蒿葉片，于45°C烘箱中烘至恒重。然 后從烘干的枝條上敲下葉和花蕾，磨成粉末。稱取約〇. lg干粉于2mL Eppendorf管中，力口 入2mL乙醇，用40W超聲波處理30min，5000rpm離心10min，取上清用0. 22 μ m濾膜過濾，即 可用于HPLC-ELSD測定青蒿素的含量。
[0071] 采用HPLC-ELSD測定青蒿素含量，樣品進(jìn)樣體積為20 μ 1，根據(jù)峰面積代入線形回 歸方程計算出樣品中的青蒿素含量（mg)，再除以樣品的青蒿葉干重（g)，從而計算出青蒿 植株中青蒿素的含量。
[0072] 在本發(fā)明中轉(zhuǎn)AaMYBLli干擾載體的轉(zhuǎn)基因植株可顯著提高了青蒿中青蒿素含 量。在非轉(zhuǎn)化普通青蒿含量為8mg/g DW時，同時期轉(zhuǎn)AaMYBLli干擾載體青蒿中青蒿素的 含量平均達(dá)到12mg/g DW，其含量是非轉(zhuǎn)化青蒿含量的1. 5倍（圖2)。圖2:在青蒿中抑制 AaMYBLl的表達(dá)提高了青蒿素和二氫青蒿酸含量。A，轉(zhuǎn)AaMYBLIRNAi青蒿中，使用HPLC檢 測青蒿素。B，轉(zhuǎn)AaMYBLIRNAi青蒿中，使用HPLC檢測二氫青蒿酸含量。結(jié)果為三次重復(fù)的 平均值，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差。統(tǒng)計分析用t-test檢驗（*，P〈0. 01)。
[0073] 本實施例采用HPLC-ELSD法測定了轉(zhuǎn)基因青蒿中青蒿素含量，采用轉(zhuǎn)化AaMYBLli 干擾載體代謝工程策略發(fā)現(xiàn)AaMYBLl基因的表達(dá)與青蒿素的含量具有明顯的關(guān)聯(lián)關(guān)系，為 利用該基因進(jìn)行過表達(dá)研究進(jìn)而提高青蒿中青蒿素的含量提供了有力的實驗證據(jù)。
[0074] 本發(fā)明的青蒿MYB-like類轉(zhuǎn)錄因子編碼序列AaMYBLl能夠?qū)崿F(xiàn)提高植物中青蒿 素含量，將所述編碼序列連于植物表達(dá)調(diào)控載體上，構(gòu)建含所述編碼序列的植物表達(dá)載體； 將表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，將農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)入青蒿；通過抗生素篩選，獲得含有所述編碼序列的轉(zhuǎn) 化細(xì)胞，再生轉(zhuǎn)基因植株；本發(fā)明獲得的轉(zhuǎn)基因青蒿中青蒿素的含量受到顯著調(diào)控，在非轉(zhuǎn) 化普通青蒿含量為8mg/g DW時，同時期轉(zhuǎn)AaMYBLli干擾載體青蒿中青蒿素的含量平均為 12mg/g DW，其含量是非轉(zhuǎn)化青蒿含量的1.5倍。本發(fā)明提供了一個調(diào)控青蒿中青蒿素含量 的轉(zhuǎn)錄因子編碼序列，為利用該編碼序列大規(guī)模生產(chǎn)青蒿素打下了堅實的基礎(chǔ)。
[0075] 以上對本發(fā)明的具體實施例進(jìn)行了描述。需要理解的是，本發(fā)明并不局限于上述 特定實施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在權(quán)利要求的范圍內(nèi)做出各種變形或修改，這并不影 響本發(fā)明的實質(zhì)內(nèi)容。
【權(quán)利要求】
1. 一種青蒿MYB-like類轉(zhuǎn)錄因子編碼序列AaMYBLl，其特征是，所述編碼序列編碼的 氨基酸序列如SEQ ID NO :4所示。
2. 如權(quán)利要求1所述的青蒿MYB-like類轉(zhuǎn)錄因子編碼序列AaMYBLl，其特征是，所述 編碼序列的核苷酸序列如SEQ ID NO :3所示。
3. -種多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO :4所示。
4. 一種如權(quán)利要求1所述的青蒿MYB-like類轉(zhuǎn)錄因子編碼序列AaMYBLl在提高青蒿 素含量中的應(yīng)用，所述編碼序列通過提高青蒿腺毛密度而提高青蒿素含量。
5. 如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用包括如下步驟： 步驟一，將青蒿MYB-like類轉(zhuǎn)錄因子編碼序列AaMYBLl連于植物表達(dá)調(diào)控序列上，構(gòu) 建含青蒿MYB-like類轉(zhuǎn)錄因子編碼序列的植物表達(dá)載體； 步驟二，將步驟一中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，將農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)入青蒿； 步驟三，通過抗生素篩選，獲得含有青蒿青蒿MYB-like類轉(zhuǎn)錄因子編碼序列AaMYBLl 的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，再生轉(zhuǎn)基因植株，所述轉(zhuǎn)基因植株的青蒿素含量得到提高。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征是，步驟二中，所述轉(zhuǎn)入具體為：采用凍融法進(jìn) 行轉(zhuǎn)入。
7. -種提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征在于，包括如下步驟： (1) 對兩個青蒿栽培種MYB類轉(zhuǎn)錄因子分析，從青蒿cDNA文庫中克隆到青蒿R3MYB類 轉(zhuǎn)錄因子AaMYBLl ; (2) 把AaMYBLl基因可操作性地連接于表達(dá)調(diào)控序列，形成含AaMYBLl基因的植物RNA 干擾載體； (3) 將含AaMYBLl基因的植物干擾表達(dá)載體轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌H1105,獲得具有該干擾表 達(dá)載體的根癌農(nóng)桿菌菌株； (4) 利用所構(gòu)建的根癌農(nóng)桿菌菌株轉(zhuǎn)化青蒿，經(jīng)卡那霉素篩選得到抗性苗，再經(jīng)PCR檢 測為陽性的植株即為轉(zhuǎn)基因青蒿苗； (5) 對獲得的轉(zhuǎn)基因青蒿進(jìn)行腺毛密度通過，獲得腺毛密度顯著提高的轉(zhuǎn)基因青蒿，進(jìn) 而獲得青蒿素含量提高的青蒿植株。
8. 如權(quán)利要求7所述的提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征在于，步驟（4)中，所述 的經(jīng)PCR檢測的轉(zhuǎn)基因青蒿植株是指，分別設(shè)計合成AaMYBLl基因的檢測引物，進(jìn)行DNA擴 增，紫外線下觀察到目的條帶的陽性株系即為轉(zhuǎn)基因青蒿植株，所述的腺毛密度檢測是指 在熒光顯微鏡下，青蒿分泌型腺毛在特定波長下顯示明亮熒光，經(jīng)拍照后再統(tǒng)計其數(shù)量和 密度。
【文檔編號】C12N15/29GK104152463SQ201410374611
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2014年7月31日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月31日
【發(fā)明者】唐克軒, 張芳源 申請人:上海交通大學(xué)