原始卵泡激活劑及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】原始卵泡激活劑及其應(yīng)用，包括mTOR信號通路激活劑I和II，mTOR信號通路激活劑I為50-200μM磷脂酸，mTOR信號通路激活劑II為20-50μM普萘洛爾；PI3K信號通路激活劑，包括PI3K信號通路激活劑III和IV，PI3K信號通路激活劑III為30-100μM的bpV，PI3K信號通路激活劑IV為250-500μg/mL的740Y-P。本發(fā)明涉及一種體外激活試劑盒，聯(lián)合應(yīng)用mTOR和PI3K信號通路激活劑能夠激活小鼠和人卵巢組織中的原始卵泡并促進(jìn)卵泡的發(fā)育。該試劑盒的開發(fā)可廣泛用于輔助生殖領(lǐng)域治療卵巢早衰等卵泡儲備不足引起的疾病。
【專利說明】原始卵泡激活劑及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種原始卵泡激活劑及其應(yīng)用，特別涉及一種mTOR和PI3K信號通路激活劑在原始卵泡體外激活試劑盒中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]在哺乳動物中，生殖細(xì)胞的生長和成熟是一個受到激素精細(xì)調(diào)節(jié)的過程。這些激素包括來自下丘腦的促性腺激素和生殖器官自身產(chǎn)生的激素和生長因子等。在雌性哺乳動物體內(nèi)，卵泡是一個卵巢的基本功能單位，由位于中央的卵子及外圍一層或多層顆粒細(xì)胞構(gòu)成。按照卵泡中卵母細(xì)胞的不同生長發(fā)育階段，可以分為原始卵泡，初級卵泡，次級卵泡，腔卵泡，排卵前卵泡。原始卵泡是卵巢中處于靜息狀態(tài)的卵泡庫，在哺乳動物出生前或出生后，其數(shù)量是固定的，人每個卵巢中的原始卵泡大約有400,000左右。在卵巢的生長發(fā)育過程中，卵巢中的原始卵泡不停的被激活，進(jìn)入生長期經(jīng)過初級卵泡和次級卵泡階段。在次級卵泡階段，在初情期前沒有促性腺激素(FSH)分泌的情況下，這些卵泡就會死亡而發(fā)生卵泡閉鎖，而初情期后，在下丘腦分泌的FSH的刺激下，就會有一個或數(shù)個次級卵泡周期性的進(jìn)一步發(fā)育長大直至排卵前卵泡。在這個過程中卵母細(xì)胞的體積會增長幾百倍，周圍顆粒細(xì)胞數(shù)量也會迅速增加，由最初的單層6-9個細(xì)胞增加至數(shù)層上千個細(xì)胞。除了下丘腦分泌的促性腺激素外，卵泡的發(fā)育也受到卵巢內(nèi)部產(chǎn)生的激素和生長因子的影響，比如在卵泡內(nèi)卵母細(xì)胞和周圍的顆粒細(xì)胞就可以通過旁分泌的形式互相影響對方的生長發(fā)育。最終在排卵前激素峰的總用下，排卵前卵泡中卵母細(xì)胞成熟而排卵，而殘留的顆粒細(xì)胞和theca細(xì)胞則發(fā)生黃體化，分泌激素為受精卵的發(fā)育做準(zhǔn)備。
[0003]在哺乳動物的卵巢中，原始卵泡庫中不停有原始卵泡被激活而進(jìn)入生長期，這個過程被稱為初始招募(initial recruiment)。初始招募并不受FSH的調(diào)節(jié),而是受卵巢產(chǎn)生的一些生長因子的影響。許多生長因子都被發(fā)現(xiàn)參與了這個過程如TOGF，SDF, EGF等。在人每個月大約有1000個左右的原始卵泡進(jìn)入生長期，而當(dāng)原始卵泡庫中的原始卵泡不足于1000時(shí)，卵巢將不再排卵，而此時(shí)女性也將進(jìn)入絕經(jīng)期。正常女性進(jìn)入絕經(jīng)期的年齡都在50歲左右，而在一些病理?xiàng)l件下，由于卵巢中原始卵泡庫中儲備不足而令女性提前進(jìn)入絕境期(40歲之前)而引起卵巢早衰。卵巢早衰是一種非常常見的不孕不育癥,在育齡女性中的發(fā)病率大概在1%。目前，關(guān)于原始卵泡激活的機(jī)制研究還不是特別清楚，除了上述提到的一些生長因子，科學(xué)家們通過基因敲除小鼠的研究，發(fā)現(xiàn)信號通路PTEN-P13K-F0X03以及mT0R-p70S6K-rpS6在原始卵泡的激活中發(fā)揮重要的作用。因此如何找到一個有效的辦法調(diào)節(jié)原始卵泡的激活將具有非常重要的意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]解決的技術(shù)問題:本發(fā)明提供一種原始卵泡激活劑及其應(yīng)用，本發(fā)明的另一目的是提供一種原始卵泡體外激活試劑盒。
[0005]技術(shù)方案:原始卵泡激活劑，由mTOR信號通路激活劑和PI3K信號通路激活劑組成，所述mTOR信號通路激活劑包括mTOR信號通路激活劑I和II，mTOR信號通路激活劑I為50-200 μ M磷脂酸，mTOR信號通路激活劑II為20-50 μ M普萘洛爾；所述ΡΙ3Κ信號通路激活劑包括ΡΙ3Κ信號通路激活劑III和IV，PI3K信號通路激活劑III為30-100 μ M的bpV，PI3K信號通路激活劑IV為250-500 μ g/mL的740Y-P。
[0006]上述磷脂酸優(yōu)選為200 μ Μ，普萘洛爾優(yōu)選為50 μ Μ，所述bpV優(yōu)選為30 μ Μ，740Υ-Ρ優(yōu)選為250 μ g/mL。
[0007]上述原始卵泡激活劑在制備激活原始卵泡并促進(jìn)卵泡發(fā)育藥物中的應(yīng)用。
[0008]原始卵泡體外激活試劑盒，包括以下組分:l)mT0R信號通路激活劑I和II ；2)PI3K信號通路激活劑III和IV ；3)基本激活細(xì)胞培養(yǎng)液；4)L-15培養(yǎng)液。
[0009]一種原始卵泡體外激活試劑盒，mTOR信號通路激活劑I為磷脂酸，其濃度為:50-200 yM^TOR信號通路激活劑II為普萘洛爾，其濃度為:20-50 μ M ;PI3K信號通路激活劑III為bpV，其濃度為30-100 μ M ;PI3K信號通路激活劑IV為740Υ-Ρ，其濃度為250-500 μ g/mL ;基本激活細(xì)胞培養(yǎng)液配方=MEMa為母液，內(nèi)含丙酮酸鈉0.23mM、人血清白蛋白1wt.%、L-抗壞血酸50 μ g/mL、鏈霉素50mg/L和青霉素75mg/L。
[0010]一種原始卵泡體外激活試劑盒，試劑組成為:
[0011]溶液1:基本激活細(xì)胞培養(yǎng)液；
[0012]溶液II:L-15培養(yǎng)液為母液，內(nèi)含人血清白蛋白1wt.% ；
[0013]試劑1:mT0R信號通路激活劑I和II，含有50-200 μ M的磷脂酸和20-50 μ M的普萘洛爾，按照1mL基本激活細(xì)胞培養(yǎng)液的劑量分別預(yù)先分裝；
[0014]試劑I1:ΡΙ3Κ信號通路激活劑III和IV，含有30-100 μ M的的bpV和250-500 μ g/mL的的740Y-P，按照1mL基本激活細(xì)胞培養(yǎng)液的劑量分別預(yù)先分裝。
[0015]另一種原始卵泡體外激活試劑盒，試劑組成為:
[0016]溶液1:基本激活細(xì)胞培養(yǎng)液；
[0017]溶液II:L-15培養(yǎng)液為母液，內(nèi)含人血清白蛋白1wt.% ；
[0018]試劑1:預(yù)混在一起的mTOR信號通路激活劑I和II，含有50-200 μ M的磷脂酸和20-50 μ M的普萘洛爾，按照1mL基本激活細(xì)胞培養(yǎng)液的劑量預(yù)先分裝；
[0019]試劑I1:預(yù)混在一起的ΡΙ3Κ信號通路激活劑III和IV，含有30-100 μ M的PA和250-500 μ g/mL的740Y-P，按照1mL基本激活細(xì)胞培養(yǎng)液的劑量預(yù)先分裝。
[0020]上述的原始卵泡體外激活試劑盒，將溶液1、試劑1、試劑I1、溶液II分別包裝，再一同包裝在同一包裝盒內(nèi)。
[0021]上述原始卵泡體外激活試劑盒的制備方法，溶液1:基本激活細(xì)胞培養(yǎng)液配制方法如下:MEMa為母液，含有丙酮酸鈉0.23mM、人血清白蛋白1wt.%、L-抗壞血酸50 μ g/mL、鏈霉素50mg/L和青霉素75mg/L ;所述試劑I含有mTOR信號通路激活劑包括:(I) mTOR信號通路激活劑I，50-200 μ M的磷脂酸，(2)mTOR信號通路激活劑II，20-50 μ M的普萘洛爾；所述試劑II含有ΡΙ3Κ信號通路激活劑包括:(1)ΡΙ3Κ信號通路激活劑I，30-100 μ M的PA，(2)ΡΙ3Κ信號通路激活劑II，250-500 μ g/mL的740Y-P ;溶液II的配制方法如下:L_15培養(yǎng)液為母液，還含有人血清白蛋白1wt.%。
[0022]上述非診斷治療目的原始卵泡體外激活試劑盒的應(yīng)用方法，步驟如下:1)取卵巢皮質(zhì)于5mL溶液II，將卵巢皮質(zhì)切割成Imm3的小塊，用溶液II反復(fù)清洗；2)取ImL溶液I與試劑I混合，待試劑I完全溶解后，用溶液I配制成1mL的激活細(xì)胞培養(yǎng)液；3)將卵巢皮質(zhì)培養(yǎng)于含有懸浮小網(wǎng)的24-孔板,在小網(wǎng)下方加入400 μ L激活細(xì)胞培養(yǎng)液,培養(yǎng)24小時(shí)，培養(yǎng)條件為37°C，5% CO2 ；4) 24h后，取ImL溶液I與試劑II混合，待試劑II完全溶解后，用溶液I配制成1mL的激活細(xì)胞培養(yǎng)液；5)將培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液吸干，加入新配置的激活培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)，培養(yǎng)條件為37°C，5% CO2 ；6) 24小時(shí)后，激活過程完成，組織可用于后續(xù)操作。
[0023]有益效果:綜上，應(yīng)用mTOR和PI3K信號通路激活劑組成的原始卵泡體外激活試劑盒處理小鼠或人卵巢皮質(zhì)，可以激活組織中的原始卵泡并促進(jìn)卵泡的發(fā)育。在體外激活完畢的卵巢皮質(zhì)，經(jīng)過外科植入術(shù)，可以重新移植回母體，繼續(xù)正常的發(fā)育，直到發(fā)育成熟，因此本發(fā)明提供了一種mTOR信號通路激活劑，同時(shí)提供了一種可供體外培養(yǎng)操作用的試劑盒，以使該技術(shù)應(yīng)用于更大的醫(yī)學(xué)輔助生殖領(lǐng)域。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0024]圖1A為小鼠卵巢用mTOR信號通路激活劑處理24h后，收集卵巢組織通過western-blot的方法檢測mTOR信號通路激活后的下游標(biāo)志分子S6K1和rps6的磷酸化變化。p-S6Kl, p-rps6 為憐酸化的 S6K1 和 rps6。
[0025]圖1B為新生小鼠卵巢應(yīng)用mTOR信號通路激活劑處理24小時(shí)后，磷酸化rps6在新生小鼠卵巢中的表達(dá)。箭頭，存在于原始卵泡卵母細(xì)胞中的陽性信號。標(biāo)尺=100μπι。
[0026]圖1C為激活后的卵巢皮質(zhì)移植入受體小鼠腎被膜下14天后，可以促進(jìn)卵巢的發(fā)育示意圖。C為對照未處理卵巢；PA，PR0，mT0R激活劑PA和PRO處理的卵巢。標(biāo)尺=1mm。
[0027]圖1D為卵巢連續(xù)切片卵泡計(jì)數(shù)結(jié)果示意圖。原始，原始卵泡；初級，初級卵泡；次級，次級卵泡；有腔，早期有腔卵泡；大有腔，大有腔卵泡。*，P〈0.05，差異顯著；**，P〈0.01，差異極顯著。
[0028]圖2體外激活處理并不影響卵母細(xì)胞的質(zhì)量。卵巢移植后18天，受體鼠一次性腹腔注射hCG促進(jìn)排卵，收集卵巢，通過針刺排卵卵泡的方法收集卵子。其中一部分卵子進(jìn)行體外受精評價(jià)胚胎發(fā)育情況，一部分卵子和受精卵進(jìn)行固定及免疫熒光分析。a:收集的MII成熟卵子；b:MII卵子tubulin免疫熒光結(jié)果，視野中長條狀為tubulin標(biāo)記的紡錘體，長條狀中心為Hoechst33258染色，標(biāo)記細(xì)胞核；c:MII卵子5MeC免疫熒光結(jié)果，視野邊緣為5MeC染色,標(biāo)記卵母細(xì)胞的甲基化水平，中心為細(xì)胞核；d:體外受精1h后,雌雄原核形成的受精卵。偏離視野中心的為5MeC染色，標(biāo)記處于甲基化狀態(tài)的雌原核，視野中心為Hoechst33258染色，標(biāo)記細(xì)胞核，可見受精卵中的雌雄原核，雄原核呈去甲基化狀態(tài)，5MeC染色陰性。e:2細(xì)胞胚胎；f:囊胚；g:將2細(xì)胞進(jìn)行胚胎移植后生產(chǎn)的健康后代。
[0029] 圖3為PI3K信號通路激活劑單獨(dú)處理能夠激活新生小鼠卵巢中的原始卵泡示意圖。A)小鼠卵巢原始卵泡體外激活培養(yǎng)48小時(shí)后卵巢的發(fā)育。小鼠卵巢用PI3K激活劑激活并培養(yǎng)48小時(shí)后，將卵巢固定并進(jìn)行標(biāo)志分子的免疫組化檢測。左側(cè)(a，c，e)為對照，右側(cè)(b，d，f)為激活后的卵巢。a，b為F0X03的免疫組化結(jié)果，圖中箭頭所指為激活后的原始卵泡，F(xiàn)0X03的染色由細(xì)胞核(見對照)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞漿。c，d為BrdU的染色結(jié)果表明，激活后的卵巢組織中大量的細(xì)胞處于增殖狀態(tài)。e，f為AMH的免疫組化結(jié)果表明，激活后的卵巢在培養(yǎng)48小時(shí)后，相較于對照組卵巢，有更多的卵泡進(jìn)入次級卵泡階段。B)將培養(yǎng)過的卵巢進(jìn)行小鼠腎被膜下移植后14天卵巢的生長情況示意圖。在每張圖片中上層是對照組卵巢，下層是激活后的卵巢，代表不同的處理組。
[0030]圖4為mTOR與PI3K信號通路激活劑協(xié)同作用促進(jìn)新生小鼠卵巢的發(fā)育示意圖。新生小鼠的一側(cè)卵巢經(jīng)過不同組合的mTOR與PI3K激活劑處理，另一側(cè)卵巢應(yīng)用mTOR或PI3K激活劑單獨(dú)處理后，移植于同一受體小鼠的左右兩側(cè)腎被膜下發(fā)育14天。14天后，將移植的卵巢取出，觀察卵巢的發(fā)育情況。
[0031]圖5A為人卵巢組織經(jīng)mTOR或PI3K信號通路激活劑處理并體外培養(yǎng)6天后卵泡的發(fā)育情況。a和b，培養(yǎng)前卵巢皮質(zhì)中的原始卵泡，b為a的高倍鏡(20X)下圖片；c和d，對照組卵巢皮質(zhì)中處于向初級卵泡轉(zhuǎn)化的卵泡；e和f，mTOR信號通路激活劑處理卵巢皮質(zhì)中成簇存在的次級卵泡，e為低倍鏡(1X)的圖片，f為高倍鏡(20X)下不同視野的圖片；g，PI3K信號通路激活劑處理后卵巢皮質(zhì)中代表性的次級卵泡；h，mTOR與PI3K激活劑聯(lián)合應(yīng)用后卵巢皮質(zhì)中代表性的次級卵泡。標(biāo)尺=100 μ m。
[0032]圖5B為培養(yǎng)6天后，培養(yǎng)卵泡的細(xì)胞增殖示意圖。a和b，對照組的卵巢組織；(:和d，mTOR與PI3K激活劑聯(lián)合應(yīng)用后卵巢皮質(zhì)山和山為高倍鏡(20X)并且來自不同的視野。棕色標(biāo)記為BrdU標(biāo)記的處于增殖期的細(xì)胞核。
[0033]圖5C為卵泡計(jì)數(shù)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析示意圖。對照組，空白處理；處理l，mT0R信號通路激活劑處理組；處理2，PI3K信號通路激活劑處理組；處理3，mTOR激活劑與PI3K激活劑聯(lián)合應(yīng)用處理組；原始，原始卵泡；初級，初級卵泡；次級，次級卵泡；退化，退化的卵泡。*，P<0.05，#，P<0 .01，差異極顯著。
[0034]圖5A~C顯示mTOR與PI3K信號通路激活劑協(xié)同作用促進(jìn)人原始卵泡的激活和發(fā)育。人卵巢皮質(zhì)分別應(yīng)用mTOR、PI3K激活劑單獨(dú)和聯(lián)合處理，處理后卵巢皮質(zhì)繼續(xù)培養(yǎng)至第6天，收集卵巢皮質(zhì)進(jìn)行分析。

【具體實(shí)施方式】
[0035]以下實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改和替換，均屬于本發(fā)明的范圍。
[0036]若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。
[0037]實(shí)施例1
[0038]原始卵泡體外激活試劑盒,包括以下組分:
[0039]其中，溶液I配制方法如下:
[0040]基本激活細(xì)胞培養(yǎng)液:MEMa(GIBC0? Minimum Essential Medium (MEM) AlphaMedium(IX) liquid, Invitrogen)為母液,還含有人血清白蛋白10wt.%、丙酮酸鈉0.23mM、L-抗壞血酸(維生素C) 50 μ g/mL、鏈霉素50mg/L和青霉素75mg/L ；
[0041]其中，試劑I配制方法如下:
[0042]mTOR信號通路激活劑I和II，含有200 μ M的PA和50 μ M的propranolol，按照1mL基本激活細(xì)胞培養(yǎng)液的劑量預(yù)先分裝；
[0043]其中，試劑II配制方法如下:
[0044]PI3K信號通路激活劑III和IV，含有30-100 μ M的bpV和250-500 μ g/mL的740Y-P，按照1mL基本激活細(xì)胞培養(yǎng)液的劑量預(yù)先分裝；
[0045]其中，溶液II的配制方法入下:
[0046]L-15 (GIBCO, Invitrogen)和人血清白蛋白的混合液,其中人血清白蛋白占溶液11 體系 1wt.% ；
[0047]將這三種溶液分別盛裝，再一同包裝在同一包裝盒內(nèi)，使用時(shí)根據(jù)說明書中描述的原始卵泡體外激活方法進(jìn)行操作。
[0048]試劑盒使用方法如下:
[0049]I)取小鼠卵巢于5mL溶液II中，用溶液II反復(fù)清洗三次以上。
[0050]2)取ImL溶液I與試劑I混合，待試劑I完全溶解后，用溶液I配置成1mL的激活細(xì)胞培養(yǎng)液。
[0051]3)將小鼠卵巢培養(yǎng)于含有懸浮小網(wǎng)(Millicell cell culture inserts,Millipore)的24-孔板，在小網(wǎng)下方加入400 μ L激活細(xì)胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)24小時(shí)，培養(yǎng)條件為 37°C，5% C02。
[0052]4) 24h后，取ImL溶液I與試劑II混合，待試劑II完全溶解后，用溶液I配制成1mL的激活細(xì)胞培養(yǎng)液；
[0053]5)將培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液吸干,加入新配置的激活培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí),培養(yǎng)條件為 37°C，5% CO2 ；
[0054]6)24小時(shí)后，激活過程完成，將處理過的小鼠卵巢移植于受體小鼠的腎包囊下，并同時(shí)將受體小鼠的雙側(cè)卵巢摘除。
[0055]7)術(shù)后第二天，受體小鼠給予促卵泡素(FSH1IU/只)注射，連續(xù)18天。
[0056]8)在最后一天，給予受體小鼠1IU的人絨毛膜促性腺激素(hCG)處理。24小時(shí)后，收集移植的卵巢，通過針刺方法，釋放發(fā)育成熟的卵子。
[0057]9)將卵子與來自于同一品系的公鼠精子進(jìn)行體外受精后，將發(fā)育到的2細(xì)胞胚胎移植于假孕小鼠，并成功建立妊娠。最后統(tǒng)計(jì)經(jīng)過體外激活試劑盒處理后的卵巢得到的成熟卵子其受精率和產(chǎn)仔數(shù)與正常成年卵巢經(jīng)超數(shù)排卵得到的成熟卵子的區(qū)別。
[0058]實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1，表1為正常超排卵子與體外激活卵子體外受精后2細(xì)胞的胚胎發(fā)育率以及胚胎移植后成活率的比較。
[0059]從表1的結(jié)果可以看出，處理組的成熟卵子經(jīng)體外受精后，2-細(xì)胞胚胎的發(fā)育率為64.3 %，而超排卵子的2-細(xì)胞胚胎發(fā)育率為86.7%，因此，在2-細(xì)胞胚胎發(fā)育率，處理組的卵子低于超排卵子。將2細(xì)胞胚胎經(jīng)胚胎移植后，在產(chǎn)仔數(shù)方面，這兩種卵子卻幾乎沒有區(qū)別。因此，應(yīng)用原始卵泡體外激活試劑盒處理卵巢后，并不會影響卵母細(xì)胞的受精和胚胎發(fā)育過程。
[0060]表1
[0061]

【權(quán)利要求】
1.原始卵泡激活劑，其特征在于由mTOR信號通路激活劑和PI3K信號通路激活劑組成，所述mTOR信號通路激活劑包括mTOR信號通路激活劑I和II，mTOR信號通路激活劑I為50-200 μ M磷脂酸，mTOR信號通路激活劑II為20-50 μ M普萘洛爾；所述ΡΙ3Κ信號通路激活劑包括ΡΙ3Κ信號通路激活劑III和IV，PI3K信號通路激活劑III為30-100 μ M的bpV，PI3K信號通路激活劑IV為250-500 μ g/mL的740Y-P。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述原始卵泡激活劑，其特征在于所述磷脂酸為200μ Μ，普萘洛爾為 50 μ Μ，所述 bpV 為 30 μ M，740Υ-Ρ 為 250 μ g/mL。
3.權(quán)利要求1或2所述原始卵泡激活劑在制備激活原始卵泡并促進(jìn)卵泡發(fā)育藥物中的應(yīng)用。
4.原始卵泡體外激活試劑盒，其特征在于，包括以下組分: DmTOR信號通路激活劑I和II ; 2)PI3K信號通路激活劑III和IV ; 3)基本激活細(xì)胞培養(yǎng)液； 4)L-15培養(yǎng)液。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的原始卵泡體外激活試劑盒，其特征在于mTOR信號通路激活劑I為磷脂酸，其濃度為:50-200 μ M ;mT0R信號通路激活劑II為普萘洛爾，其濃度為:20-50 μ M ； ΡΙ3 Κ信號通路激活劑III為bpV，其濃度為30-100 μ M ； ΡΙ3Κ信號通路激活劑IV為740Υ-Ρ，其濃度為250-500 μ g/mL ;基本激活細(xì)胞培養(yǎng)液配方=MEMa為母液，內(nèi)含丙酮酸鈉0.23mM、人血清白蛋白10 wt.%、L_抗壞血酸50 μ g/mL、鏈霉素50mg/L和青霉素75mg/L0
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的原始卵泡體外激活試劑盒，其特征在于，試劑組成為: 溶液1:基本激活細(xì)胞培養(yǎng)液； 溶液II:L-15培養(yǎng)液為母液，內(nèi)含人血清白蛋白10 Wt.%; 試劑1:mT0R信號通路激活劑I和II，含有50-200 μ M的磷脂酸和20-50 μ M的普萘洛爾，按照1mL基本激活細(xì)胞培養(yǎng)液的劑量分別預(yù)先分裝； 試劑II:ΡΙ3Κ信號通路激活劑III和IV，含有30-100 μ M的的bpV和250-500 μ g/mL的的740Y-P，按照1mL基本激活細(xì)胞培養(yǎng)液的劑量分別預(yù)先分裝。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的原始卵泡體外激活試劑盒，其特征在于，試劑組成為: 溶液1:基本激活細(xì)胞培養(yǎng)液； 溶液II:L-15培養(yǎng)液為母液，內(nèi)含人血清白蛋白10 Wt.%; 試劑1:預(yù)混在一起的mTOR信號通路激活劑I和II，含有50-200 μ M的磷脂酸和20-50 μ M的普萘洛爾，按照1mL基本激活細(xì)胞培養(yǎng)液的劑量預(yù)先分裝； 試劑I1:預(yù)混在一起的ΡΙ3Κ信號通路激活劑III和IV，含有30-100 μ M的PA和250-500 μ g/mL的740Y-P，按照1mL基本激活細(xì)胞培養(yǎng)液的劑量預(yù)先分裝。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的原始卵泡體外激活試劑盒，其特征在于將溶液1、試劑1、試劑I1、溶液II分別包裝，再一同包裝在同一包裝盒內(nèi)。
9.權(quán)利要求6或7所述原始卵泡體外激活試劑盒的制備方法，其特征在于溶液1:基本激活細(xì)胞培養(yǎng)液配制方法如下=MEMa為母液，含有丙酮酸鈉0.23mM、人血清白蛋白1wt.%、L-抗壞血酸50 μ g/mL、鏈霉素50mg/L和青霉素75mg/L ;所述試劑I含有mTOR信號通路激活劑包括:(1) mTOR信號通路激活劑I，50-200 μ M的磷脂酸，(2) mTOR信號通路激活劑II，20-50 μ M的普萘洛爾；所述試劑II含有ΡΙ3Κ信號通路激活劑包括:(1) ΡΙ3Κ信號通路激活劑I，30-100 μ M的PA，(2) ΡΙ3Κ信號通路激活劑II，250-500 μ g/mL的740Y-P ;溶液II的配制方法如下:L-15培養(yǎng)液為母液，還含有人血清白蛋白1wt.%。
10.權(quán)利要求6或7所述非診斷治療目的原始卵泡體外激活試劑盒的應(yīng)用方法，其特征在于步驟如下: 1)取卵巢皮質(zhì)于5mL溶液II，將卵巢皮質(zhì)切割成Imm3的小塊，用溶液II反復(fù)清洗； 2)取1mL溶液I與試劑I混合，待試劑I完全溶解后，用溶液I配制成1mL的激活細(xì)胞培養(yǎng)液； 3)將卵巢皮質(zhì)培養(yǎng)于含有懸浮小網(wǎng)的24-孔板，在小網(wǎng)下方加入400μ L激活細(xì)胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)24小時(shí)，培養(yǎng)條件為37°C，5%C02 ； 4)24h后，取ImL溶液I與試劑II混合，待試劑II完全溶解后，用溶液I配制成1mL的激活細(xì)胞培養(yǎng)液； 5)將培養(yǎng)板中的培養(yǎng) 液吸干，加入新配置的激活培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)，培養(yǎng)條件為 37°C，5%C02 ； 6)24小時(shí)后，激活過程完成，組織可用于后續(xù)操作。
【文檔編號】C12N5/075GK104130972SQ201410326486
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2014年7月9日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月9日
【發(fā)明者】李晶, 張婧, 何元林, 孫昕卉 申請人:南京醫(yī)科大學(xué)