專利名稱：原始卵泡體外激活試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種醫(yī)療用試劑盒，特別涉及一種原始卵泡體外激活試劑盒。
背景技術(shù)：
在哺乳動(dòng)物中，生殖細(xì)胞的生長(zhǎng)和成熟是一個(gè)受到激素精細(xì)調(diào)節(jié)的過(guò)程。這些激素包括來(lái)自下丘腦的促性腺激素和生殖器官自身產(chǎn)生的激素和生長(zhǎng)因子等。在雌性哺乳動(dòng)物體內(nèi)，卵泡是一個(gè)卵巢的基本功能單位，由位于中央的卵子及外圍一層或多層顆粒細(xì)胞構(gòu)成。按照卵泡中卵母細(xì)胞的不同生長(zhǎng)發(fā)育階段，可以分為原始卵泡，初級(jí)卵泡，次級(jí)卵泡， 腔卵泡，排卵前卵泡。原始卵泡是卵巢中處于靜息狀態(tài)的卵泡庫(kù)，在哺乳動(dòng)物出生前或出生后，其數(shù)量是固定的，在人每個(gè)卵巢中的原始卵泡大約有400，000左右。在卵巢的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，卵巢的中的原始卵泡不停的被激活，進(jìn)入生長(zhǎng)期經(jīng)過(guò)初級(jí)卵泡和次級(jí)卵泡階段。在次級(jí)卵泡階段，在初情期前沒(méi)有促性腺激素(FSH)分泌的情況下，這些卵泡就會(huì)死亡而發(fā)生卵泡閉鎖，而初情期后，在下丘腦分泌的FSH的刺激下，就會(huì)有一個(gè)或數(shù)個(gè)次級(jí)卵泡周期性的進(jìn)一步發(fā)育長(zhǎng)大直至排卵前卵泡。在這個(gè)過(guò)程中卵母細(xì)胞的體積會(huì)增長(zhǎng)幾百倍，周圍顆粒細(xì)胞數(shù)量也會(huì)迅速增加，由最初的單層6-9個(gè)細(xì)胞增加至數(shù)層上千個(gè)細(xì)胞。除了下丘腦分泌的促性腺激素外，卵泡的發(fā)育也受到卵巢內(nèi)部產(chǎn)生的激素和生長(zhǎng)因子的影響，比如在卵泡內(nèi)卵母細(xì)胞和周圍的顆粒細(xì)胞就可以通過(guò)旁分泌的形式互相影響對(duì)方的生長(zhǎng)發(fā)育。 最終在排卵前激素峰的總用下，排卵前卵泡中卵母細(xì)胞成熟而排卵，而殘留的顆粒細(xì)胞和 theca細(xì)胞則發(fā)生黃體化，分泌激素為受精卵的發(fā)育做準(zhǔn)備。在哺乳動(dòng)物的卵巢中，原始卵泡庫(kù)中不停有原始卵泡被激活而進(jìn)入生長(zhǎng)期，這個(gè)過(guò)程被稱為初始招募(initial recruitment)。初始招募并不受FSH的調(diào)節(jié)，而是受卵巢產(chǎn)生的一些生長(zhǎng)因子的影響。許多生長(zhǎng)因子都被發(fā)現(xiàn)參與了這個(gè)過(guò)程如PDGF，SDF, EGF等。 在人每個(gè)月大約有1000個(gè)左右的原始卵泡進(jìn)入生長(zhǎng)期，而當(dāng)原始卵泡庫(kù)中的原始卵泡不足于1000時(shí)，卵巢將不再排卵，而此時(shí)女性也將進(jìn)入絕經(jīng)期。正常女性進(jìn)入絕經(jīng)期的年齡都在50歲左右，而在一些病理?xiàng)l件下，由于卵巢中原始卵泡庫(kù)中儲(chǔ)備不足而令女性提前進(jìn)入絕經(jīng)期(40歲之前)而引起卵巢早衰。卵巢早衰是一種非常常見(jiàn)的不孕不育癥，在育齡女性中的發(fā)病率大概在1%。目前，關(guān)于原始卵泡激活的機(jī)制研究還不是特別清楚，除了上述提到的一些生長(zhǎng)因子，科學(xué)家們通過(guò)基因敲除小鼠的研究，發(fā)現(xiàn)信號(hào)通路PTEN-Pm-F0X03 在原始卵泡的激活中發(fā)揮重要的作用。因此如何找到一個(gè)有效的辦法調(diào)節(jié)原始卵泡的激活將具有非常重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明尋找到一種原始卵泡的激活方法，同時(shí)根據(jù)該方法發(fā)明了一種原始卵泡體外激活試劑盒。本發(fā)明的原始卵泡體外激活方法，包括以下步驟步驟1，取卵巢皮質(zhì)于5ml溶液III中將卵巢皮質(zhì)切割成Imm3左右的小塊，用溶液III反復(fù)清洗三次以上；步驟2，將卵巢皮質(zhì)培養(yǎng)于含有懸浮小網(wǎng)(Millicell cell culture inserts, Millipore)的24-孔板，在小網(wǎng)下方加入400 μ 1溶液I培養(yǎng)24小時(shí)，培養(yǎng)條件為37°C,5% CO2 ；步驟3，然后吸出溶液I，換入溶液II并繼續(xù)培養(yǎng)M小時(shí)；其中，溶液I 基本激活細(xì)胞培養(yǎng)液+I-IOOyMmbPV(Pic)或bpV(HOpic)；溶液 II 基本激活細(xì)胞培養(yǎng)液+50-500 μ g/ml的740Y-P ；步驟4，24小時(shí)后激活完畢；以上方法經(jīng)過(guò)試驗(yàn)證明效果明顯，有關(guān)效果試驗(yàn)如下I小鼠卵巢原始卵泡體外激活培養(yǎng)48小時(shí)后卵巢的發(fā)育小鼠卵巢用原始卵泡體外激活試劑盒激活并培養(yǎng)48小時(shí)后，將卵巢固定并進(jìn)行標(biāo)志分子的免疫組化檢測(cè)。如

圖1，左側(cè)(A，C，E)為對(duì)照，右側(cè)(B，D，F(xiàn))為激活后的卵巢。 A，B，F(xiàn)0X03的免疫組化結(jié)果，箭頭所指為激活后的原始卵泡，F(xiàn)0X03的染色由細(xì)胞核(見(jiàn)對(duì)照)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞漿。C，D，BrdU的染色結(jié)果表明，激活后的卵巢組織中大量的細(xì)胞處于增殖狀態(tài)。E，F(xiàn)，AMH的免疫組化結(jié)果表明，激活后的卵巢在培養(yǎng)48小時(shí)后，相較于對(duì)照組卵巢， 有更多的卵泡進(jìn)入次級(jí)卵泡階段。II用原始卵泡體外激活試劑盒激活后小鼠卵巢在腎被膜下迅速發(fā)育將用激活試劑盒處理過(guò)的卵巢，移植入受體鼠的腎被膜下，同時(shí)將受體鼠的雙側(cè)卵巢切除。術(shù)后第二天，每天給小鼠注射FSH至第14天，然后將受體鼠處死，取卵巢，如圖2 所示，在每張圖片中上層是對(duì)照組卵巢，下層是激活后的卵巢。與對(duì)照組相比各處理組的卵巢都明顯偏大(圖2A，B, C，D)，表明應(yīng)用激活試劑盒處理后，能明顯促進(jìn)小鼠卵巢的發(fā)育。III應(yīng)用原始卵泡體外激活試劑盒激活后小鼠卵巢發(fā)育正常將用激活試劑盒處理過(guò)的卵巢，移植入受體鼠的腎被膜下，同時(shí)將受體鼠的雙側(cè)卵巢切除。術(shù)后第二天，每天給小鼠注射FSH至第18天，給于一次性腹腔注射hCG(10IU/ 鼠)，7小時(shí)后，收集卵巢，準(zhǔn)備切片并進(jìn)行H&E染色。如圖3所示，與對(duì)照組卵巢(圖3A)相比，用原始卵泡體外激活試劑盒激活后的卵巢(圖3B)含有更多的排卵前卵泡，并且對(duì)hCG 刺激發(fā)生反應(yīng)引發(fā)GVBD(生發(fā)泡破裂)現(xiàn)象，箭頭所標(biāo)示的是正在成熟的卵泡，可以見(jiàn)到卵子中GVBD后所形成的紡錘體以及發(fā)生擴(kuò)展的卵丘細(xì)胞。而在對(duì)照組卵巢中，由于絕大多數(shù)卵泡并沒(méi)有發(fā)育到排卵前卵泡階段因此對(duì)hCG的刺激并不發(fā)生反應(yīng)。由于應(yīng)用原始卵泡體外激活試劑盒處理后，小鼠的卵巢可以正常發(fā)育并對(duì)hCG的刺激發(fā)生反應(yīng)，接下來(lái)我們想要看到處理過(guò)的卵巢是否會(huì)產(chǎn)生功能正常的卵子。在hCG處理后12小時(shí)，收集卵巢，用機(jī)械法刺破排卵前卵泡并收集成熟的卵子，進(jìn)行體外受精并評(píng)價(jià)早期胚胎體外發(fā)育情況。如圖4所示為體外發(fā)育M、48、72、96小時(shí)后的2細(xì)胞，4_8細(xì)胞，桑椹胚和囊胚?？梢?jiàn)，應(yīng)用原始卵泡體外激活試劑盒激活后的小鼠卵巢發(fā)育和功能完全正常。IV應(yīng)用原始卵泡體外激活試劑盒激活后可以促進(jìn)人卵巢皮脂中原始卵泡的發(fā)育將新鮮的或復(fù)蘇的卵巢皮質(zhì)切割成l_2mm3左右的小塊后應(yīng)用原始卵泡體外激活試劑盒進(jìn)行處理，然后將卵巢皮質(zhì)移植入受體免疫缺陷小鼠的腎被膜下，同時(shí)將受體鼠的卵巢手術(shù)切除。術(shù)后第二天開(kāi)始，隔天給小鼠注射FSH至20周左右收集卵巢。如圖5A所示，同對(duì)照組相比，激活后的人卵巢皮質(zhì)發(fā)育迅速，在腎被膜下可以看見(jiàn)發(fā)育長(zhǎng)大的卵巢皮質(zhì)(圖5A右側(cè)腎臟)。將卵巢組織剝出后，進(jìn)行組織切片可以看到一個(gè)直徑大約在3mm左右的有腔卵泡(圖5B)，在卵泡腔中央是一個(gè)COC(卵卵丘細(xì)胞復(fù)合物)，可以看到處于GV期的卵子 (圖 5C)?？傊?，應(yīng)用原始卵泡體外激活試劑盒處理小鼠或人卵巢皮質(zhì)，可以激活組織中的原始卵泡并促進(jìn)卵泡的發(fā)育，無(wú)論是在人或小鼠，卵泡發(fā)育完全正常，在小鼠能夠得到功能完全正常的卵子，受精后胚胎在體外能夠發(fā)育到囊胚階段。本發(fā)明根據(jù)以上原始卵泡體外激活方法設(shè)計(jì)了一種試劑盒，該試劑盒可以用于原始卵泡體外激活，通過(guò)使用該試劑盒，證明操作簡(jiǎn)單，省時(shí)省力，激活率強(qiáng)，避免了現(xiàn)用現(xiàn)配的繁瑣，同時(shí)使操作標(biāo)準(zhǔn)化。因此本發(fā)明提供一種原始卵泡體外激活試劑盒。本發(fā)明的試劑盒，包括以下組分1，PTEN 抑制劑2，PII 激活劑3，基本激活細(xì)胞培養(yǎng)液4，L-15 培養(yǎng)液其中，PTEN抑制劑，為一種小分子化合物，其中PTEN(phosphatase and tensin homo log deleted on chromosome ten)為一新發(fā)現(xiàn)的抑癌基因，其中文名為人第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因，位于10q23. 3，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為5151cbmRNA。PTEN 抑制齊[J 選自bpV (pic) (Dipotassium Bisperoxo (picolinato) oxovanadate, 或 bpV(HOpic)(Dipotassium Bisperoxo (5-hydroxypyridine-2-carboxyl)oxovanadate, 或其它的PTEN分子抑制劑，這些PTEN抑制劑，屬于現(xiàn)有技術(shù)，可以從市場(chǎng)上購(gòu)買得到，其用量為1-100 μ M ；其中bpV (pic)和bpV (HOpic)的結(jié)構(gòu)式如下
權(quán)利要求
1.一種原始卵泡體外激活試劑盒，其特征在于，包括以下組分1)PTEN抑制劑；2)PII激活劑；3)基本激活細(xì)胞培養(yǎng)液；4)L-15培養(yǎng)液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的試劑盒，其特征在于，其中，PTEN抑制劑選自bpV(pic)或 bpV (HOpic)或其它的PTEN分子抑制劑，其用量為1-100μΜ;其中，PII激活劑選自 740Υ-Ρ，或其它的PII激活劑，其用量為50-500 μ g/ml ；其中，基本激活細(xì)胞培養(yǎng)液為MEMa中含有丙酮酸鈉0. 23mM，人血清白蛋白10%，卵泡刺激素0. 03-0. lIU/ml, L-抗壞血酸50 μ g/ml，鏈霉素50mg/l，青霉素75mg/l的培養(yǎng)液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的試劑盒，其特征在于，其包括以下試劑溶液I 基本激活細(xì)胞培養(yǎng)液+PTEN抑制劑+PUK激活劑，溶液II 基本激活細(xì)胞培養(yǎng)液+PUK激活劑，溶液III :L-15培養(yǎng)液；溶液III為L(zhǎng)-15培養(yǎng)液。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的試劑盒，其特征在于，溶液 I 含有 1-100 μ M 的 bpV(pic)或 bpV (HOpic)以及 50-500 μ g/ml 的 740Y-P 的基本激活細(xì)胞培養(yǎng)液；溶液II 含有50-500 μ g/ml的740Y-P的基本激活細(xì)胞培養(yǎng)液。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的試劑盒，其特征在于，溶液I 含有50 μ M的bpV(pic)或bpV (HOpic)以及150 μ g/ml 740Y-P的基本激活細(xì)胞培養(yǎng)液；溶液Π 含有150 μ g/ml的740Y-P基本激活細(xì)胞培養(yǎng)液。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的試劑盒，其特征在于，其中，基本激活細(xì)胞培養(yǎng)液即MEMa中含有丙酮酸鈉0. 23mM，人血清白蛋白10%，卵泡刺激素0. 03-0. 1 IU/ml，L-抗壞血酸50 μ g/ml，鏈霉素50mg/l，青霉素75mg/l的培養(yǎng)液，配制方法如下將上述原材料按配方比例混合均勻即可；其中，溶液I的配制方法如下(1)基本激活細(xì)胞培養(yǎng)液，O) PTEN抑制劑，C3) PII激活劑，將上述原材料按配方混合均勻即可；其中，溶液II的配制方法如下(1)基本激活細(xì)胞培養(yǎng)液，激活劑，將上述原材料按配方混合均勻即可。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的試劑盒，其特征在于，其中，溶液 I 的含有 l-ΙΟΟμΜ 的 bpV(pic)或 bpV(HOpic)以及 50-500 μ g/ml 740Y-P 的基本激活細(xì)胞培養(yǎng)液；配制方法如下將上述原材料按配方混合均勻即可；其中，溶液II含有50-500 μ g/ml的740Y-P基本激活細(xì)胞培養(yǎng)液；配制方法如下將上述原材料按配方混合均勻即可。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的試劑盒，其特征在于，是將溶液I，溶液II，溶液III分別盛裝，再一同包裝在同一包裝盒內(nèi)。
9.權(quán)利要求1的試劑盒的應(yīng)用方法，步驟如下1)取卵巢皮質(zhì)于5ml溶液III中將卵巢皮質(zhì)切割成Imm3左右的小塊，用溶液III反復(fù)清洗三次以上；2)將卵巢皮質(zhì)培養(yǎng)于含有懸浮小網(wǎng)的24-孔板，在小網(wǎng)下方加入400μ1溶液I培養(yǎng) 24小時(shí)，培養(yǎng)條件為37°C，5% CO2 ；3)然后吸出溶液I，換入400μ 1溶液II并繼續(xù)培養(yǎng)M小時(shí)；4)24小時(shí)后激活完畢。
10.原始卵泡體外激活方法，包括以下步驟步驟1，取卵巢皮質(zhì)于5ml溶液III中將卵巢皮質(zhì)切割成Imm3左右的小塊，用溶液III 反復(fù)清洗三次以上；步驟2，將卵巢皮質(zhì)培養(yǎng)于含有懸浮小網(wǎng)的24-孔板，在小網(wǎng)下方加入400 μ 1溶液I培養(yǎng)M小時(shí)，培養(yǎng)條件為37 °C，5 % CO2 ；步驟3，然后吸出溶液I，換入溶液II并繼續(xù)培養(yǎng)M小時(shí)；其中，溶液I 基本激活細(xì)胞培養(yǎng)液+I-IOOuM的bpV(pic)或bpV(HOpic)；溶液II 基本激活細(xì)胞培養(yǎng)液+50-500 μ g/ml的740Y-P ； 步驟4，M小時(shí)后激活完畢。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種醫(yī)療用試劑盒，特別涉及一種原始卵泡體外激活試劑盒。本發(fā)明所述的試劑盒，包括以下組分PTEN抑制劑；PI3K激活劑；基本激活細(xì)胞培養(yǎng)液；L-15培養(yǎng)液。
文檔編號(hào)C12N5/075GK102533642SQ20111038720
公開(kāi)日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2011年11月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月28日
發(fā)明者李慶, 李晶 申請(qǐng)人:李慶, 李晶