一種球根鳶尾病毒檢測(cè)引物及方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明根據(jù)鳶尾輕花葉病毒、水仙潛隱病毒和菜豆黃花葉病毒三種病毒的外殼蛋白基因的核苷酸序列，分別設(shè)計(jì)合成了三對(duì)相應(yīng)的特異性引物；并同時(shí)公開(kāi)了利用該三對(duì)特異性引物同時(shí)對(duì)球根鳶尾葉片中的鳶尾輕花葉病毒、水仙潛隱病毒和菜豆黃花葉病毒進(jìn)行檢測(cè)的方法。本發(fā)明建立了一種通過(guò)一次反應(yīng)就能同時(shí)檢測(cè)出3種球根鳶尾病毒即鳶尾輕花葉病毒、水仙潛隱病毒和菜豆黃花葉病毒的檢測(cè)方法，具有檢測(cè)效率高、所需成本低的特點(diǎn)，且即使樣本中3種球根鳶尾病毒的RNA含量很低，本發(fā)明也能檢測(cè)出來(lái)，因而本發(fā)明具有很高的檢測(cè)靈敏度。
【專(zhuān)利說(shuō)明】-種球根鳶尾病毒檢測(cè)引物及方法 【【技術(shù)領(lǐng)域】】
[0001] 本發(fā)明涉及生物學(xué)領(lǐng)域的一種植物病毒檢測(cè)方法，具體涉及一種球根鳶尾病毒檢 測(cè)引物及方法。 【【背景技術(shù)】】
[0002] 鸞尾輕花葉病毒（Iris mild mosaic virus，IMMV)、水仙潛隱病毒（Narcissus latent virus，NLV)和菜豆黃花葉病毒（Bean yellow mosaic virus，BYMV)是危害球根鸞 尾的三種主要病毒。
[0003] 在田間這三種病毒常常復(fù)合侵染，造成球根鳶尾花色斑駁、葉片產(chǎn)生花葉退綠、切 花的數(shù)量和質(zhì)量明顯下降，從而嚴(yán)重影響球根鳶尾的品質(zhì)。當(dāng)種球連續(xù)種植幾年后，病毒積 累到一定程度，會(huì)造成種球的退化，失去再利用的價(jià)值，這幾種病毒的復(fù)合侵染已經(jīng)成為球 根鳶尾大規(guī)模生產(chǎn)的主要限制因素。目前，球根鳶尾病毒尚無(wú)特別有效的化學(xué)防治方法，因 此，對(duì)球根鳶尾進(jìn)行病毒鑒定，結(jié)合莖尖組培脫毒使種球復(fù)壯，顯得尤為重要，但在種球復(fù) 壯過(guò)程中，經(jīng)常需要對(duì)其進(jìn)行病毒檢測(cè)。
[0004] 目前，植物病毒檢測(cè)大多采用基于抗血清的酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)（即ELISA方法）， 但抗血清不僅價(jià)格較高、一種抗血清只能檢測(cè)一種病毒、檢測(cè)程序繁瑣，而且還存在一定程 度的假陽(yáng)性反應(yīng)、檢測(cè)靈敏性相對(duì)較低等問(wèn)題。近年來(lái)，為了提高病毒檢測(cè)效率，基于PCR 技術(shù)的病毒檢測(cè)技術(shù)正在迅速發(fā)展，但單重PCR檢測(cè)技術(shù)，一個(gè)反應(yīng)只能檢測(cè)一種病毒，若 應(yīng)用于田間多種病毒復(fù)合侵染的球根鳶尾病毒的檢測(cè)，則存在著耗時(shí)、耗力、費(fèi)用高的問(wèn) 題。 【
【發(fā)明內(nèi)容】
】
[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于提供一種球根鳶尾病毒檢測(cè)引物及方法。
[0006] 本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案解決上述技術(shù)問(wèn)題的：一種球根鳶尾病毒檢測(cè)引物， 其具體包括如下三個(gè)引物對(duì)：
[0007] 鳶尾輕花葉病毒引物對(duì)：正向引物5' -GAAGGTAAAGCACCATACAT-3'，反向引物 5'-CGTGCTAGTGACATATCGGTAA-3' ；
[0008] 水仙潛隱病毒引物對(duì)：正向引物5' -AATTGGTGCATTTGGTGC-3'，反向引物 5,-TCAAAAGCGTAGGGGATCAT-3，；
[0009] 菜豆黃花葉病毒引物對(duì)：正向引物5' -AGACACACAGCAGGAGATGT-3'，反向引物 5,-GCTTACCCTGTCAGAGTAGA-3,。
[0010] 進(jìn)一步地，所述鳶尾輕花葉病毒引物對(duì)對(duì)鳶尾輕花葉病毒PCR擴(kuò)增出770bp的產(chǎn) 物；所述水仙潛隱病毒引物對(duì)對(duì)水仙潛隱病毒PCR擴(kuò)增出266bp的產(chǎn)物；所述菜豆黃花葉 病毒引物對(duì)對(duì)菜豆黃花葉病毒PCR擴(kuò)增出186bp的產(chǎn)物。
[0011] 進(jìn)一步地，利用上述三個(gè)引物對(duì)對(duì)球根鳶尾病毒進(jìn)行檢測(cè)，其檢測(cè)方法如下：根據(jù) 鳶尾輕花葉病毒、水仙潛隱病毒和菜豆黃花葉病毒三種病毒的外殼蛋白基因的核苷酸序列 分別設(shè)計(jì)合成出如權(quán)利要求1中所述鳶尾輕花葉病毒引物對(duì)、水仙潛隱病毒引物對(duì)及菜豆 黃花葉病毒引物對(duì)；然后分別利用鳶尾輕花葉病毒引物對(duì)對(duì)球根鳶尾葉片中的鳶尾輕花葉 病毒、水仙潛隱病毒引物對(duì)對(duì)球根鳶尾葉片中的水仙潛隱病毒、菜豆黃花葉病毒引物對(duì)對(duì) 球根鳶尾葉片中的菜豆黃花葉病毒進(jìn)行mRT-PCR反應(yīng)，最后將反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行1 %瓊脂糖凝 膠電泳分析和克隆測(cè)序比對(duì)。
[0012] 進(jìn)一步地，所述mRT-PCR反應(yīng)的反應(yīng)體系和反應(yīng)程序如下：
[0013] 反應(yīng)體系：反應(yīng)體系的總體積為50yL，含有0. 3yL5U/yL的Taq酶、5yL的 lOXTaq 酶 buffer、4 μ L2. 5mmol/L 的 dNTPs、1 μ L 模板、0· 12-0. 32 μ mol/L 的鳶尾輕花葉 病毒正向引物、〇· 12-0. 32 μ mol/L的鳶尾輕花葉病毒反向引物、0· 08-0. 24μ mol/L的水仙 潛隱病毒正向引物、〇· 08-0. 24 μ mol/L的水仙潛隱病毒反向引物、0· 04-0. 24 μ mol/L的菜 豆黃花葉病毒正向引物、0.04-0. 24 μ mol/L的菜豆黃花葉病毒反向引物，其余成分為滅菌 雙蒸水；其中，每所述引物對(duì)中的正向引物和反向引物的濃度均相等，所述鳶尾輕花葉病毒 正向引物、鳶尾輕花葉病毒反向引物、水仙潛隱病毒正向引物、水仙潛隱病毒反向引物、菜 豆黃花葉病毒正向引物、菜豆黃花葉病毒反向引物的濃度均是以反應(yīng)體系的總體積50 μ L 為基準(zhǔn)；
[0014] 反應(yīng)程序：94°C預(yù)變性 5min ;94°C變性 30s，48-58°C退火 30s，72°C延伸 lmin，循 環(huán)35次；72°C延伸10min ;4°C終止反應(yīng)。
[0015] 本發(fā)明的有益效果在于：
[0016] 針對(duì)鳶尾輕花葉病毒、水仙潛隱病毒和菜豆黃花葉病毒三種病毒的外殼蛋白基因 的核苷酸序列，分別設(shè)計(jì)合成了三對(duì)相應(yīng)的特異性引物，并利用該三對(duì)特異性引物同時(shí)對(duì) 球根鳶尾葉片中的鳶尾輕花葉病毒、水仙潛隱病毒和菜豆黃花葉病毒進(jìn)行mRT-PCR反應(yīng)， 建立了一種通過(guò)一次反應(yīng)就能同時(shí)檢測(cè)出3種球根鳶尾病毒即鳶尾輕花葉病毒、水仙潛隱 病毒和菜豆黃花葉病毒的檢測(cè)方法，具有檢測(cè)效率高、所需成本低的特點(diǎn)，且即使樣本中3 種球根鳶尾病毒的RNA含量很低，本發(fā)明也能檢測(cè)出來(lái)，因而本發(fā)明具有很高的檢測(cè)靈敏 度。 【【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】】
[0017] 下面參照附圖結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的描述。
[0018] 圖1為本發(fā)明中實(shí)施例一的1 %瓊脂糖凝膠電泳圖。
[0019] 圖2為本發(fā)明中實(shí)施例二的1%瓊脂糖凝膠電泳圖。
[0020] 圖3為本發(fā)明中實(shí)施例三的1 %瓊脂糖凝膠電泳圖。 【【具體實(shí)施方式】】
[0021] 本發(fā)明列舉了以下幾個(gè)代表性實(shí)施例，這些實(shí)施例僅是示例性的，且不用于限制 本發(fā)明的范圍，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施方法。
[0022] 實(shí)施例一
[0023] 本發(fā)明一種球根鳶尾病毒的檢測(cè)方法，根據(jù)鳶尾輕花葉病毒、水仙潛隱病毒和菜 豆黃花葉病毒三種病毒的外殼蛋白基因的保守核苷酸序列分別設(shè)計(jì)合成了鳶尾輕花葉病 毒引物對(duì)、水仙潛隱病毒引物對(duì)及菜豆黃花葉病毒引物對(duì)，然后分別利用鳶尾輕花葉病毒 引物對(duì)對(duì)球根鳶尾葉片中的鳶尾輕花葉病毒，水仙潛隱病毒引物對(duì)對(duì)球根鳶尾葉片中的水 仙潛隱病毒，菜豆黃花葉病毒引物對(duì)對(duì)球根鳶尾葉片中的菜豆黃花葉病毒進(jìn)行mRT-PCR反 應(yīng)，最后將反應(yīng)廣物進(jìn)行1 %瓊脂糖凝I父電泳實(shí)驗(yàn)和克隆測(cè)序比對(duì)。
[0024] 其中，各引物對(duì)具體為：⑴鳶尾輕花葉病毒引物對(duì)（如SEQ ID N0 :1、2所示）：正 向引物 5' -GAAGGTAAAGCACCATACAT-3'，反向引物 5' -CGTGCTAGTGACATATCGGTAA-3' ；（2)水 仙潛隱病毒引物對(duì)（如SEQ ID N0:3、4所示）：正向引物5'-AATTGGTGCATTTGGTGC-3'，反 向引物5'-TCAAAAGCGTAGGGGATCAT-3' ；（3)菜豆黃花葉病毒引物對(duì)（如SEQIDN0:5、6所 示）：正向引物 5' -AGACACACAGCAGGAGATGT-3'，反向引物 5' -GCTTACCCTGTCAGAGTAGA-3'。
[0025] 另外， 申請(qǐng)人:為方便描述，以下將鳶尾輕花葉病毒簡(jiǎn)稱(chēng)為IMMV，水仙潛隱病毒簡(jiǎn)稱(chēng) 為NLV，菜豆黃花葉病毒簡(jiǎn)稱(chēng)為BYMV。本發(fā)明檢測(cè)方法的具體操作步驟如下：
[0026] 步驟100 :根據(jù)鳶尾輕花葉病毒、水仙潛隱病毒和菜豆黃花葉病毒三種病毒的外 殼蛋白基因核苷酸序列，利用Primer5. 0軟件設(shè)計(jì)三對(duì)特異性引物（即所述鳶尾輕花葉病 毒引物對(duì)、水仙潛隱病毒引物對(duì)及菜豆黃花葉病毒引物對(duì)），再用DNAman軟件對(duì)所設(shè)計(jì)的 三對(duì)特異性引物進(jìn)行校正，證實(shí)三對(duì)引物間不存在自身匹配和競(jìng)爭(zhēng)性擴(kuò)增，以確保上述三 種病毒能擴(kuò)增出差異明顯的特異性片段，并由上海生工生物工程有限公司合成上述三對(duì)特 異性引物。
[0027] 步驟200 :RNA提?。簩⑼瑫r(shí)被IMMV、NLV和BYMV三種病毒復(fù)合侵染的球根鳶尾葉 片〇. 2g、健康葉片0. 2g分別進(jìn)行RNA提取，并以健康葉片為陰性對(duì)照。RNA提取采用Trizol 法：〇. 2g球根鳶尾帶病毒葉片或健康葉片放入研缽中，加入液氮研磨成粉狀，接著將粉狀 葉片置于第一離心管中，再加入lmL Trizol并劇烈震蕩20?30S，然后將第一離心管置于 室溫下靜置5min以使葉片充分裂解，接著將第一離心管于lOOOOrpm下離心5min，將上清移 至第二離心管中，往第二離心管中加入200uL氯仿，并振蕩混勻，于室溫下放置3min，接著 在4°C、lOOOOrpm下離心15min，然后吸取上層水相至第三離心管中，往第三離心管中加入 0. 5mL異丙醇混勻，并于室溫下放置10min，接著將第三離心管于4°C、lOOOOrpm條件下離心 10min，并棄去上清液，則RNA沉于管底；之后加lmL75%乙醇（DEPC處理水配制）于第三離 心管中并溫和振蕩第三離心管，得到懸浮液，再于4°C、lOOOOrpm條件下離心5min，并棄去 上清液，然后將第三離心管置于冰上晾干l〇min，最后用30uL DEPC處理水溶解RNA樣品。
[0028] 步驟300 :反轉(zhuǎn)錄cDNA :將經(jīng)步驟200處理所得的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，具體內(nèi)容為： 將反應(yīng)管置于冰上，加入 luL Primer 01igo(dt)、luL dNTP 混合物（10mmol/L)、4uL DEPC 處理水、4uL RNA樣品至反應(yīng)管中，輕輕混勻再進(jìn)行稍微離心，接著將反應(yīng)管置于65°C水浴 中加熱5min后，立即將反應(yīng)管置于冰上5min，接著將反應(yīng)管稍微離心后再將反應(yīng)管置于冰 上，并加入4uL5 X反轉(zhuǎn)錄酶緩沖液、0. 5uL20U/uL的RNAase抑制劑、luL200U/uL反轉(zhuǎn)錄酶、 4. 5uL DEPC處理水至反應(yīng)管中，然后將反應(yīng)管置于42°C水浴中加熱60min,再將反應(yīng)管置 于70°C下熱擊10min，最后終止反應(yīng)。
[0029] 步驟400 :PCR擴(kuò)增：以經(jīng)步驟300處理所得的cDNA為模板，并以步驟100中獲得 的三對(duì)引物為引物對(duì)同時(shí)進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0030] 為了進(jìn)行對(duì)比，本實(shí)施例同時(shí)進(jìn)行了單重PCR擴(kuò)增反應(yīng)和多重PCR擴(kuò)增反應(yīng)，即 PCR擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)體系包括單重PCR反應(yīng)體系和多重PCR反應(yīng)體系，其中，單重PCR擴(kuò)增 反應(yīng)和多重PCR擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)程序一致而反應(yīng)體系不同。PCR擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)體系和反 應(yīng)程序具體內(nèi)容如下：
[0031] 單重PCR反應(yīng)體系：反應(yīng)體系的總體積為50yL，包括0. 3yL5U/yL的Taq酶、 54 1^的10父了&1酶1311打61'、4 4 1^.5臟〇1/1的（1階138、14 1^模板、14 1^(^111〇1/11麗￥或 NLV或BYMV的正向引物、1μ L10ymol/L IMMV或NLV或BYMV的反向引物，其余成分為滅菌 雙蒸水。
[0032] 多重PCR反應(yīng)體系：反應(yīng)體系的總體積為50yL，含有0. 3yL5U/yL的Taq酶、 5以1^的10父丁&9酶1311打61'、4 4 1^.5臟〇1/1的(1階1^、14 14莫板、0.164 111〇1/1的1麗￥正向 引物、0. 16ymol/L 的 IMMV 反向引物、0. 12ymol/L 的 NLV 正向引物、0. 12ymol/L 的 NLV 反 向引物、0. 12ymol/L的BYMV正向引物、0. 12ymol/L的BYMV反向引物，其余成分為滅菌雙 蒸水；其中，所述IMMV正向引物和IMMV反向引物、NLV正向引物和NLV反向引物、BYMV正 向引物和BYMV反向引物的濃度均是以反應(yīng)體系的總體積50 μ L為基準(zhǔn)。
[0033] PCR 反應(yīng)程序：94°C預(yù)變性 5min、94°C變性 30s、54°C退火 30s、72°C延伸 lmin，循 環(huán)35次；72°C延伸lOmin ;4°C終止反應(yīng)。
[0034] 步驟500 :取5 μ L PCR產(chǎn)物以1 %瓊脂糖凝膠（熒光染料）為電泳支持介質(zhì)，在 0. 5 X ΤΒΕ和120V電壓下電泳30min，然后在0. 5 μ g/mL溴化乙錠染色液中染色15min，用紫 外透射儀觀察，具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1。
[0035] 本實(shí)施例1 %瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示，IMMV引物對(duì)的單重PCR擴(kuò)增 反應(yīng)結(jié)果如圖1中的標(biāo)識(shí)1所示，NLV引物對(duì)的單重PCR擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)果如圖1中的標(biāo)識(shí)2所 示，BYMV引物對(duì)的單重PCR擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)果如圖1中的標(biāo)識(shí)3所示，由IMMV引物對(duì)、NLV引物 對(duì)、BYMV引物對(duì)的三對(duì)引物參與的多重PCR擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)果如圖1中的標(biāo)識(shí)4所示，健康葉 片的單重PCR擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)果如圖1中的標(biāo)識(shí)5所示。由圖1可知，IMMV引物對(duì)的單重PCR 擴(kuò)增反應(yīng)得到擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為770bp的條帶，NLV引物對(duì)的單重PCR擴(kuò)增反應(yīng)得到擴(kuò)增片 段長(zhǎng)度為266bp的條帶，BYMV引物對(duì)的單重PCR擴(kuò)增反應(yīng)得到擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為186bp的條 帶，由IMMV引物對(duì)、NLV引物對(duì)、BYMV引物對(duì)三對(duì)引物參與的多重PCR擴(kuò)增反應(yīng)，可同時(shí)得 到擴(kuò)增片段長(zhǎng)度770bp、266bp和186bp的三條明亮清晰的條帶，可見(jiàn)，本發(fā)明可以一次性同 時(shí)檢測(cè)出球根鳶尾的IMMV、NLV、BYMV三種病毒，且特異性好、檢測(cè)效率高。
[0036] 實(shí)施例二
[0037] 將實(shí)施例一步驟400中的多重PCR反應(yīng)體系得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)割膠回收，然 后分別與PMD18-T simple vector進(jìn)行體外連接，再挑取陽(yáng)性克隆，最后提取質(zhì)粒測(cè)序，以 檢查鳶尾輕花葉病毒、水仙潛隱病毒和菜豆黃花葉病毒三種病毒的擴(kuò)增結(jié)果。
[0038] 且測(cè)序結(jié)果為：IMMV、NLV和BYMV的擴(kuò)增產(chǎn)物分別是由770、266和186個(gè)核苷酸 組成的序列，其中所述IMMV擴(kuò)增產(chǎn)物序列如SEQ ID N0 :7所示，所述NLV擴(kuò)增產(chǎn)物序列如 SEQ ID N0:8所示，所述BYMV擴(kuò)增產(chǎn)物序列如SEQ ID N0:9所示。用NCBI分析同源性結(jié) 果表明，所得的擴(kuò)增產(chǎn)物序列SEQ ID N0 :7與參考序列即IMMV的外殼蛋白基因序列的同源 率達(dá)到99%，序列SEQ ID N0 :8與參考序列NLV的外殼蛋白基因序列的同源率達(dá)到98%， 序列SEQ ID N0 :9與參考序列BYMV的外殼蛋白基因序列的同源率達(dá)到100%。由此可見(jiàn)， 所得的擴(kuò)增產(chǎn)物SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:8和SEQ ID N0:9序列分別為IMMV、NLV和BYMV 的外殼蛋白基因的部分序列，從而證明了本發(fā)明檢測(cè)結(jié)果的可靠性。
[0039] 此外，為了考察本發(fā)明球根鳶尾病毒的檢測(cè)方法的靈敏度， 申請(qǐng)人:對(duì)實(shí)施例一步 驟200中的RNA樣品進(jìn)行10' 10_2、10_3、10_4、10_5 -系列的梯度稀釋?zhuān)缓蠼?jīng)過(guò)多重RT-PCR 擴(kuò)增反應(yīng)，再進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)，具體結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，IMMV、NLV 和BYMV三種病毒在樣品濃度稀釋100倍后均仍能擴(kuò)增出特異條帶，由此可見(jiàn)本發(fā)明具有很 高的靈敏度。
[0040] 實(shí)施例三
[0041] 多重RT-PCR同時(shí)檢測(cè)IMMV、NLV和BYMV的應(yīng)用：
[0042] 步驟1 :取樣地點(diǎn)為福建省農(nóng)科院花卉研究中心種質(zhì)資源圃。隨機(jī)選取6個(gè)大田 中有復(fù)合侵染癥狀的球根鳶尾葉片樣品，且6個(gè)球根鳶尾葉片樣品均為0. 2g ;接著對(duì)各樣 品進(jìn)行RNA提?。ú僮魍瑢?shí)施例一的步驟200)，并將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA (操作同實(shí)施例一 的步驟300)。
[0043] 步驟2 :以處理所得的cDNA為模板，并以本發(fā)明所述的三對(duì)引物為引物對(duì)同時(shí)進(jìn) 行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。PCR擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)體系和反應(yīng)程序具體內(nèi)容如下：
[0044] PCR反應(yīng)體系：反應(yīng)體系的總體積為50 μ L，含有0. 3 μ L5U/ μ L的Taq酶、5 μ L的 10父了&9酶131^€61'、4 4 1^.5臟〇1/1的（1階1^、14 14莫板、0.2(^111〇1/1的1麗￥正向引物、 0.2(^111〇1/1的1麗￥反向引物、0.16 4 111〇1/1的1￥正向引物、0.16 4 111〇1/1的1￥反向弓| 物、0· 16ymol/L的BYMV正向引物、0· 16ymol/L的BYMV反向引物，其余成分為滅菌雙蒸 水；PCR反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性5min、94°C變性30s、58°C退火30s、72°C延伸lmin，循環(huán)35 次；72°C延伸lOmin ;4°C終止反應(yīng)。
[0045] 步驟3 :取5yL PCR產(chǎn)物以1 %瓊脂糖凝膠（熒光染料）為電泳支持介質(zhì)，在 0· 5 X TBE和120V電壓下電泳30min，然后在0· 5 μ g/mL溴化乙錠染色液中染色15min，用紫 外透射儀觀察，具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3。
[0046] 本實(shí)施例的1 %瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)如圖3所示，利用多重RT-PCR體系對(duì)6個(gè)球 根鳶尾葉片樣品進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，每個(gè)所述樣品均能擴(kuò)增出三條明亮清晰特異性條帶，說(shuō)明所 采集的樣品受IMMV、NLV及BYMV三種病毒復(fù)合侵染，且擴(kuò)增得到的特異性條帶片段長(zhǎng)度分 另ij 770bp、226bp和186bp，與實(shí)施例一中單重PCR檢測(cè)結(jié)果一致?？梢?jiàn)本發(fā)明檢測(cè)方法可以 一次性同時(shí)檢測(cè)出甘薯的IMMV、NLV、BYMV三種病毒，特異性好、檢測(cè)效率高特異性好、效率 商。
[0047] 本發(fā)明針對(duì)IMMV、NLV和BYMV三種病毒的外殼蛋白基因的核苷酸序列，分別設(shè)計(jì) 合成了三對(duì)相應(yīng)的特異性引物，并利用該三對(duì)特異性引物同時(shí)對(duì)球根鳶尾葉片中的IMMV、 NLV和BYMV進(jìn)行mRT-PCR反應(yīng)，建立了一種新的PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序，使mRT-PCR反應(yīng) 得到了大小差異明顯，長(zhǎng)度分別為770bp、226bp和186bp的三條IMMV、NLV和BYMV的擴(kuò)增 片段序列；本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了一次反應(yīng)就能同時(shí)檢測(cè)出3種球根鳶尾病毒即IMMV、NLV和BYMV 的目標(biāo)，因而本發(fā)明檢測(cè)效率高，本發(fā)明所用試劑為分子生物學(xué)常用試劑，所需成本低，且 即使樣本中3種球根鳶尾病毒的RNA含量很低，本發(fā)明也能檢測(cè)出來(lái)，因而本發(fā)明具有很高 的檢測(cè)靈敏度。
[0001] SEQUENCE LISTING 福建省農(nóng)科院科學(xué)院作物研究所 <P0> -種球根鳶尾病毒檢測(cè)引物及方法 <13()> 10000 <!60> 9 -|7(r Ρ; κ rl rersioti ^ 1 <210> 1 <211> 20 <2]2> DNA <213> 人丄序列 <400> I gcUiggUuiag cticctilaccil 20 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 2 cgtgctagtg acatatcggt aa 22 <210> 3 <21l> IH <212> DNA <213> 人工序列 <400> 3 aattggtgca tttggtgc 18 <210> 4 <21l> 20 <212> DNA <213> 人工序列
[0002] <400> 4 tcaaaagcgt aggggatcat 20 <2!0> 5 <211> 20 <2I2> DNA <213> 人工序列 <400> 5 agacac￡icag caggagatgt 20 <2!(?> 6 <211> 2() <212> DNA <213> 人工序列 <400 Ο gcttaccctg tcagagtaga 20 <2I0> 7 <211> 77() <2I2> DMA <213> iris mild mosaic virus <40()> 7 gaaggtaaag caccatacat ctcggactac gcgctgcgtc gtctatacac agaagaacaa 60 atgcctcagg agaatctaga tcagtatcta cgcgcacttg tagatatcgc taaagagcgt 120 gacgacgatc cacaatttgt agaacaccag tcaggtggga cggatactgt ggatgcagcg 180 gaccctttca agcgaaatca aaatcctatg cgtagcagcg aatcacaaac gtctagtcaa 240 cctgcaacaa cccctccaca gacacagctt gacaaagatg ttaatgttgg tacaagcggc 300 acatttcgca taccacgact aaagagctta agttcaaaac tttcacttcc aaaggtccga 360 ggtagcacag ccgtaaaccr accacatctg uacaataUi accccaacca agagcaactr 420 tcgaacacta gggctacgga cgaacaattt tcagcttggt atgaaggggt taagggt^ac 480
[0003] tatgatgtca cagatgatga gatgcacatc ataatgaatg gactgatggt gtggtgtatc 540 gagaatggta cttcaccaaa tctcaacggt atgtgggtta tgatggatgg agatactcag 600 gttacttatc cgatcaaacc actacttgat tacgcacaac ccacactacg tcaaatcatg 660 catcatttca gcaacttggc agaagcgtac attgaanaac agaattacga gagaccatac 720 atgccaaggt atgggcggat tcgaaacctt accgatatgt cactagcacg 770 <2I0> 8 <21l> 266 <2I2> [)ΝΛ <213> Narcissus latent virus <40()> 8 aattggtgca tttggtgcgc taacaacggc acatcgtccg aagttgatac gtcgcaaaca 60 atggagattc gcgatggttt tgggaaggtt caggctatcc ccattgaggt ttttgtgaac 120 ccagctgttg agaatggegg tttacgaaag ataatgagge atttctctgg cataactcac 180 gagattttaa aggctggtaa gcgaatgaca gcctggggaa ataagagggg etttaergag 240 aaatcaatga tcccctacgc ttttga 266 <2I0> 9 <21l> 186 <2I2> DNA <213> Bean yellow inosaic virus <400> 9 agacacacag caggagatgt caatcgtgat atgcacacca tgcttggtgt tegtatttag 60 agtatccgtc tttaaattct ctataatttg gcgttacatt acttaatact atgtattagt 120 gaggtttcac ctccagcatt ttaaattcag tatgtgtatc atteteteta ctctgacagg 180 gtaage 18o
【權(quán)利要求】
1. 一種球根鳶尾病毒檢測(cè)引物，其特征在于：具體包括如下三個(gè)引物對(duì)： 鳶尾輕花葉病毒引物對(duì)：正向引物5' -GAAGGTAAAGCACCATACAT-3'，反向引物 5'-CGTGCTAGTGACATATCGGTAA-3' ； 水仙潛隱病毒引物對(duì)：正向引物5' -AATTGGTGCATTTGGTGC-3'，反向引物 5,-TCAAAAGCGTAGGGGATCAT-3，； 菜豆黃花葉病毒引物對(duì)：正向引物5' -AGACACACAGCAGGAGATGT-3'，反向引物 5,-GCTTACCCTGTCAGAGTAGA-3,。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述一球根鳶尾病毒檢測(cè)引物，其特征在于：所述鳶尾輕花葉病毒 引物對(duì)對(duì)鳶尾輕花葉病毒PCR擴(kuò)增出770bp的產(chǎn)物；所述水仙潛隱病毒引物對(duì)對(duì)水仙潛隱 病毒PCR擴(kuò)增出266bp的產(chǎn)物；所述菜豆黃花葉病毒引物對(duì)對(duì)菜豆黃花葉病毒PCR擴(kuò)增出 186bp的產(chǎn)物。
3. -種球根鳶尾病毒檢測(cè)方法，其特征在于：根據(jù)鳶尾輕花葉病毒、水仙潛隱病毒和 菜豆黃花葉病毒三種病毒的外殼蛋白基因的核苷酸序列分別設(shè)計(jì)合成出如權(quán)利要求1中 所述鳶尾輕花葉病毒引物對(duì)、水仙潛隱病毒引物對(duì)及菜豆黃花葉病毒引物對(duì)；然后分別利 用鳶尾輕花葉病毒引物對(duì)對(duì)球根鳶尾葉片中的鳶尾輕花葉病毒、水仙潛隱病毒引物對(duì)對(duì)球 根鳶尾葉片中的水仙潛隱病毒、菜豆黃花葉病毒引物對(duì)對(duì)球根鳶尾葉片中的菜豆黃花葉病 毒進(jìn)行mRT-PCR反應(yīng)，最后將反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行1 %瓊脂糖凝膠電泳分析和克隆測(cè)序比對(duì)。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述一種球根鳶尾病毒檢測(cè)方法，其特征在于：所述mRT-PCR反應(yīng) 的反應(yīng)體系和反應(yīng)程序如下： 反應(yīng)體系：反應(yīng)體系的總體積為50 μ L，含有0. 3 μ L5U/ μ L的Taq酶、5 μ L的lOXTaq 酶 buffer、4y L2. 5mmol/L 的 dNTPs、l μ L 模板、0· 12-0. 32ymol/L 的鳶尾輕花葉病毒正 向引物、0. 12-0. 32 μ mol/L的鳶尾輕花葉病毒反向引物、0. 08-0. 24 μ mol/L的水仙潛隱病 毒正向引物、〇· 08-0. 24ymol/L的水仙潛隱病毒反向引物、0· 04-0. 24ymol/L的菜豆黃 花葉病毒正向引物、0.04-0. 24 μ mol/L的菜豆黃花葉病毒反向引物，其余成分為滅菌雙蒸 水；其中，每所述引物對(duì)中的正向引物和反向引物的濃度均相等，所述鳶尾輕花葉病毒正向 引物、鳶尾輕花葉病毒反向引物、水仙潛隱病毒正向引物、水仙潛隱病毒反向引物、菜豆黃 花葉病毒正向引物、菜豆黃花葉病毒反向引物的濃度均是以反應(yīng)體系的總體積50 μ L為基 準(zhǔn)； 反應(yīng)程序：94°C預(yù)變性5min ;94°C變性30s，48-58°C退火30s，72°C延伸lmin，循環(huán)35 次；72°C延伸lOmin ;4°C終止反應(yīng)。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK104059999SQ201410325043
【公開(kāi)日】2014年9月24日 申請(qǐng)日期:2014年7月9日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月9日
【發(fā)明者】黃敏玲, 樊榮輝, 鐘淮欽, 吳建設(shè), 林兵, 葉秀仙, 羅遠(yuǎn)華 申請(qǐng)人:福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所