一種利用miRNA5794基因預(yù)測水稻白葉枯病的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種利用miRNA5794基因預(yù)測水稻白葉枯病的方法，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。所述方法包括以下步驟：選取待測水稻和對照水稻，選取的所述對照水稻為未感染白葉枯病但與待測水稻在相同條件下栽培的水稻；分別分離所述待測水稻和所述對照水稻中的總miRNA基因；分別檢測所述待測水稻和所述對照水稻中的總miRNA基因中的miRNA5794基因的表達(dá)量，所述miRNA5794基因的序列如序列表中SEQ?ID?NO:1所示；根據(jù)所述待測水稻和所述對照水稻中的miRNA5794基因的表達(dá)量，判斷實(shí)驗(yàn)是否成功，若成功，進(jìn)一步判定所述待測植株是否感染白葉枯病。本發(fā)明提供的預(yù)測方法獲得了成功，可以在水稻白葉枯病癥出現(xiàn)前數(shù)天實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確預(yù)報(bào)，為早防早治贏得了時(shí)間，減少了白葉枯病對水稻造成的損失。
【專利說明】-種利用miRNA5794基因預(yù)測水稻白葉枯病的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種利用miRNA5794基因預(yù)測水稻白葉枯病 的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 水稻是我國主要糧食作物，白葉枯病是水稻兩大主要病害之一，屬世界性病害，亞 洲稻區(qū)發(fā)生尤重。白葉枯病發(fā)病率高、傳染快，發(fā)病稻田減產(chǎn)20-30%，甚至50%。與大部 分病害一樣，白葉枯病發(fā)病早期防治效果較佳。發(fā)病中后期，病菌已大量繁殖，已對水稻造 成了傷害，防治效果較差。由此可見，早期預(yù)報(bào)是水稻白葉枯病預(yù)防的關(guān)鍵所在。
[0003] 傳統(tǒng)水稻白葉枯病預(yù)報(bào)主要依據(jù)氣候、天氣、品種抗性、氮肥施用情況、以及病害 歷史等進(jìn)行推測，也可依據(jù)田間水稻白葉枯病癥狀表現(xiàn)，對后期病情發(fā)展進(jìn)行預(yù)報(bào)。
[0004] 在實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的過程中，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)現(xiàn)有技術(shù)至少存在以下問題：
[0005] 根據(jù)天氣、氣候、品種抗性、栽培現(xiàn)狀和歷史等進(jìn)行的預(yù)報(bào)結(jié)果是很模糊的，可說 明在一定區(qū)域與時(shí)間范圍內(nèi)病害發(fā)生的概率，但不能預(yù)報(bào)病害發(fā)生的具體時(shí)間與地點(diǎn)，預(yù) 報(bào)結(jié)果的可應(yīng)用性較差。例如，高溫高濕常作為水稻白葉枯病的流行預(yù)報(bào)的氣候條件，但不 能確定高溫高濕下病害是否一定出現(xiàn)、在那塊田出現(xiàn)、在那天出現(xiàn)。由于以上的不確定性， 農(nóng)民不能決定是否開始防治白葉枯、對哪塊田進(jìn)行防治、以及何時(shí)防治。同時(shí)，病癥出現(xiàn)表 明白葉枯病已進(jìn)入中后期，病菌已大量繁殖，白葉枯病流行已難以避免，使得利用病癥調(diào)查 進(jìn)行預(yù)報(bào)的工作也無太大實(shí)際意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了解決現(xiàn)有技術(shù)中水稻白葉枯病預(yù)報(bào)不及時(shí)、不準(zhǔn)確的缺點(diǎn)，本發(fā)明實(shí)施例提 供了一種利用miRNA5794基因預(yù)測水稻白葉枯病的方法。所述技術(shù)方案如下：
[0007] 選取9311水稻品種作為待測水稻和對照水稻；
[0008] 栽培所述待測水稻和所述對照水稻；
[0009] 分別分離所述待測水稻和所述對照水稻中的總miRNA基因；
[0010] 分別檢測所述待測水稻和所述對照水稻中的所述總miRNA基因中的miRNA5794基 因的表達(dá)量，所述miRNA5794基因的序列如序列表中SEQ ID N0:1所示；
[0011] 根據(jù)所述待測水稻和所述對照水稻中的miRNA5794基因的表達(dá)量，判定實(shí)驗(yàn)是否 成功，若成功，則進(jìn)一步判定所述待測植株是否感染白葉枯病。
[0012] 具體地，所述栽培所述待測水稻和所述對照水稻時(shí)，所述對照水稻在栽培時(shí)采用 保護(hù)性栽培措施并防治白葉枯病，除所述保護(hù)性栽培措施和防治白葉枯病外，所述對照水 稻與所述待測水稻的栽培條件保持一致。
[0013] 進(jìn)一步地，所述保護(hù)性栽培措施包括對土壤隔離、水源隔離和空間隔離。
[0014] 具體地，在上午8 :55?9 :05利用所述待測水稻和所述對照水稻的相同葉片的相 同部位進(jìn)行所述總miRNA基因的分離。
[0015] 具體地，采用實(shí)時(shí)定量PCR方法，檢測所述miRNA5794基因在所述待測水稻和所述 對照水稻中的表達(dá)量。
[0016] 進(jìn)一步地，所述實(shí)時(shí)定量PCR方法的前處理步驟包括：
[0017] 利用分光光度計(jì)測定并獲得分離的所述總miRNA基因的濃度；
[0018] 向所述總miRNA基因中加入外源參考miRNA基因，得到第一混合液，所述外源參考 miRNA基因的加入量為所述總miRNA基因質(zhì)量的0. 05 %，所述外源參考miRNA基因的序列 如序列表中SEQ ID N0:2所示；
[0019] 將所述總miRNA基因和所述外源參考miRNA基因的5'端與3'端連接，得到環(huán)化 的所述總miRNA基因和環(huán)化的所述外源參考miRNA基因的混合液；
[0020] 將所述環(huán)化的總miRNA基因和所述環(huán)化的外源參考miRNA基因的混合液進(jìn)行逆轉(zhuǎn) 錄，得到的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用于進(jìn)行所述實(shí)時(shí)定量PCR檢測。
[0021] 進(jìn)一步地，所述采用實(shí)時(shí)定量PCR方法，檢測所述miRNA5794基因在所述待測水稻 和所述對照水稻中的表達(dá)量，包括：
[0022] 將2μ 1所述逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、3μ 1濃度為ΙμΜ的引物、10μ 1定量PCR混合物和 0. 4 μ 150倍的R0X熒光校正染料混合均勻，得到第二混合液，將所述第二混合液在實(shí)時(shí)定 量PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)，所述反應(yīng)程序?yàn)椋?0°C 2分鐘；95°C 10分鐘；95°C 45秒，56°C 45秒， 66°C 30秒，67°C 30秒，共45個(gè)循環(huán)，其中，66°C 30秒和67°C 30秒這兩步在每循環(huán)一次后 分別增加〇. 1°C和0. 2°C，在每一次循環(huán)的最后一步收集熒光信號(hào)，所述熒光信號(hào)的強(qiáng)弱用 于衡量所述表達(dá)量的多少；
[0023] 所述引物包括：序列如序列表中SEQ ID N0:3所示的miRNA5794基因正向引物、序 列如序列表中SEQ ID N0:4所示的miRNA5794基因反向引物、序列如序列表中SEQ ID N0:5 所示的外源參考miRNA基因正向引物、以及序列如序列表中SEQ ID N0:6所示的外源參考 miRNA基因反向引物。
[0024] 進(jìn)一步地，將所述總miRNA基因的5'端與3'端連接的步驟包括：
[0025] 取5ng所述第一混合液、2μ 110X反應(yīng)緩沖液、1μ 150mM的MnCl2、4y 15M的甜菜 堿和1 μ 15u/μ 1的環(huán)化酶，用水補(bǔ)足20 μ 1后混勻，得到第三混合液，將所述第三混合液于 60°C保溫15分鐘后，80°C保溫10分鐘，使酶失活，得到所述環(huán)化的總miRNA基因和環(huán)化的 外源參考miRNA基因的混合液。
[0026] 進(jìn)一步地，將所述環(huán)化的總miRNA基因和環(huán)化的外源參考miRNA基因的混合液體 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄的步驟包括：
[0027] 取所述環(huán)化的總miRNA基因和所述環(huán)化的外源參考miRNA基因的混合液2 μ 1、 5μ1濃度為ΙμΜ的逆轉(zhuǎn)錄引物、2μ1濃度為10mM的dNTP、5yl濃度為lOOmM的DTT和 20U的逆轉(zhuǎn)錄酶，用水補(bǔ)足50 μ 1混勻后，得到第四混合液，將所述第四混合液于42°C保溫 2小時(shí)，75°C保溫15分鐘，使酶失活，得到所述逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物；所述逆轉(zhuǎn)錄引物包括miRNA5794 基因的逆轉(zhuǎn)錄引物和外源參考miRNA基因的逆轉(zhuǎn)錄引物，所述miRNA5794基因的逆轉(zhuǎn)錄引 物序列如序列表中SEQ ID NO: 7所不，所述外源參考miRNA基因的逆轉(zhuǎn)錄引物序列如序列 表中SEQ ID N0:8所示。
[0028] 具體地，所述判定實(shí)驗(yàn)是否成功方法為：若所述對照水稻的miRNA5794基因的表 達(dá)量最大值與表達(dá)量最小值的比值小于1. 5,則實(shí)驗(yàn)成功；若所述對照水稻的miRNA5794基 因的表達(dá)量最大值與表達(dá)量最小值的大于等于1. 5,則實(shí)驗(yàn)不成功。
[0029] 具體地，判定所述待測植株是否感染白葉枯病的方法為：若所述待測水稻的 miRNA5794基因的表達(dá)量小于2倍所述對照水稻的miRNA5794基因的表達(dá)量，則所述待測水 稻未感?。蝗羲龃郎y水稻的miRNA5794基因的表達(dá)量大于或等于2倍的所述對照水稻的 miRNA5794基因的表達(dá)量，則所述待測水稻感病。
[0030] 本發(fā)明實(shí)施例提供的技術(shù)方案帶來的有益效果是：本發(fā)明提供的一種利用 miRNA5794基因預(yù)測水稻白葉枯病的方法，可將miRNA5794基因的表達(dá)變化可作為水稻感 染白葉病菌的標(biāo)志物，用以明確待測水稻是否染病，以及明確發(fā)病的時(shí)間與田塊，避免了傳 統(tǒng)病害預(yù)報(bào)的模糊性。同時(shí)，本發(fā)明的預(yù)測時(shí)間早，可在水稻感染白葉枯病24小時(shí)內(nèi)作出 預(yù)報(bào)。

【具體實(shí)施方式】
[0031] 為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將對本發(fā)明實(shí)施方式作進(jìn)一 步地詳細(xì)描述。本發(fā)明中未標(biāo)注說明的試劑均為常用市售試劑，在大多數(shù)生物技術(shù)公司均 可購買到且效果幾乎無差別。
[0032] 實(shí)施例
[0033] 本發(fā)明實(shí)施例將9311水稻品種作為待測水稻和對照水稻，其中，待測水稻是指種 植于大田正常栽培條件下，需要監(jiān)控是否感染白葉枯病的水稻；對照水稻是指通過保護(hù)性 技術(shù)措施和白葉枯病防治措施，確保其為沒有感染白葉枯病的健康水稻，除保護(hù)性栽培措 施和防治白葉枯病外，對照水稻與待測水稻的栽培條件保持一致，其中，保護(hù)性栽培措施包 括土壤隔離、水源隔離和空間隔離。
[0034] 種子的選取：待測水稻的種子和對照水稻的種子均收獲于健康的9311水稻植株， 并且種子表面無明顯病蟲害危害癥狀。
[0035] 種子的前處理、播種與栽培條件：對照種子與待測種子均用濃度為70%的酒精浸 泡2分鐘，再用去離子水洗2次，在30°C的水中浸泡過夜，在30°C的溫度下對種子進(jìn)行催 芽，種子出芽后播種。
[0036] 從待測水稻生長的田塊中取土壤，利用滅菌鍋（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備 廠生產(chǎn)，型號(hào)為YSQ-LS-50S11)對土壤進(jìn)行高溫高壓消毒滅菌，消毒滅菌條件為：120°C，30 分鐘。消毒后的土壤作為對照水稻的種植土壤。將對照水稻在隔離條件下播種、移栽、生長 于填有消毒土壤的塑料盆中，待測水稻則種植于大田環(huán)境中，栽培待測水稻和對照水稻時(shí)， 除保護(hù)性栽培措施與白葉枯病防治措施外，待測水稻與待測水稻的栽培條件保持一致。
[0037] 保護(hù)性栽培措施包括：（1) 土壤隔離：利用盆栽，使對照水稻生長的土壤與大田土 壤隔離，避免通過土壤傳病感染白葉枯?。?2)水源隔離：采用自來水灌溉對照水稻，確保 大田水源不進(jìn)入對照水稻，避免通過水源感染白葉枯病；（3)空間隔離：對照水稻周圍10米 不種植其它水稻，避免與帶白葉枯菌的水稻葉片摩擦感染白葉枯病。待測水稻不防治白葉 枯病，除保護(hù)性栽培措施與白葉枯病防治措施外對照水稻與待測水稻的栽培條件盡可能保 持一致，包括播種、移栽、施肥、防蟲、防病（除白葉枯病外其它病害）等生產(chǎn)管理措施同時(shí)、 同步進(jìn)行。
[0038] 具體地，在對照水稻周圍10米范圍內(nèi)，不播種或種植其它水稻；對照水稻灌溉水 采用干凈的自來水；除以上條件外，對照水稻與待測水稻的其它栽培條件與普通大田常規(guī) 栽培條件相同，但所有栽培措施在對照水稻與待測水稻間保持一致，如播種、移栽、施肥、防 蟲、防病（除白葉病外其它病害）等生產(chǎn)管理措施同時(shí)、同步進(jìn)行。本次試驗(yàn)中，播種期為 2010年11月27日，地點(diǎn)為海南瓊海。
[0039] 將對照水稻和待測水稻采用相同的栽培條件種植，使對照水稻和待測水稻能夠在 相同的條件下生長，保證對照水稻和待測水稻的表達(dá)量不受栽培條件的影響。
[0040] 在需要預(yù)報(bào)白葉枯病是否發(fā)生的時(shí)期，如苗期和破口期至抽穗揚(yáng)花期，在上午8 : 55?9 :05分別取倒數(shù)第二片中部2/3的部位的葉片。每次對照水稻與待測水稻各取至少 3片葉片混合，用于代表對照水稻與待測水稻的樣本。所取葉片立即置于液氮中保存至總 miRNA基因的提取。在本實(shí)施例中，取樣時(shí)間段為2011年2月28號(hào)至當(dāng)年3月3號(hào)，連續(xù) 取樣5天，共獲得對照水稻與待測水稻各5個(gè)樣本，分別編號(hào)為C1?C5和T1?T5,其中C 表示Control，T表示Treatment，其中，對照水稻與待測水稻取樣的時(shí)間點(diǎn)是一致的，對照 水稻和待測水稻所選取的葉片位置也是相同的，這能夠使對照水稻和待測水稻之間的生物 時(shí)鐘與發(fā)育狀態(tài)是相同的，只有選取生物時(shí)鐘與發(fā)育狀態(tài)均相同的葉片才能進(jìn)一步保證對 照水稻和待測水稻間的miRNA表達(dá)量比較不受生物時(shí)鐘與發(fā)育的影響。
[0041] 分離總miRNA基因：利用miRNA基因分離試劑盒（miRNA基因分離試劑盒為市售， 貨號(hào)：R6727,生產(chǎn)公司：0mega，該試劑盒具體包括：RNA離心柱、基因組DNA去除離心柱、離 心管、MCL裂解緩沖液、XD結(jié)合緩沖液、RNA洗脫液II和DEPC水）分離上述C1?C5和 T1?T5水稻葉片中的總miRNA基因。
[0042] 具體操作方法如下：從液氮中分別取出C1?C5和T1?T5水稻葉片樣本，分別 置于10個(gè)研缽中，并立即向研缽中倒入液氮，充分研磨，分別研磨可以避免交叉污染。向 每個(gè)研缽中取大約l〇〇mg研磨好的粉末置于1. 5ml的離心管中，加700 μ L的裂解液，渦旋 30秒以混勻樣品，55°C保溫30分鐘，在離心力為12000Xg的室溫條件下離心5分鐘，得到 上清液，并將上清液轉(zhuǎn)移至離心柱中離心，用于去除基因組中的DNA，經(jīng)12000Xg室溫離 心2分鐘，并將流出的液體轉(zhuǎn)移至一個(gè)新的1. 5mL的離心管中，向該流出的液體中加入該 液體體積1. 1倍的無水乙醇并渦旋20秒混勻，將該渦旋后的液體轉(zhuǎn)移至RNA離心柱中經(jīng) 12000 X g室溫離心1分鐘，棄離心液，加入500 μ L濃度為96-100 %的乙醇到RNA離心柱中， 再經(jīng)12000 Xg室溫離心1分鐘，棄離心液，加入500 μ L XD結(jié)合緩沖液到RNA離心柱中， 12000 X g室溫離心1分鐘，棄離心液，加入750 μ L RNA洗脫液II到RNA離心柱中，12000 X g 室溫離心1分鐘，棄離心液，再加入750 μ LRNA洗脫液II到RNA離心柱中，12000 X g室溫離 心1分鐘，棄離心液，將RNA離心柱在大于12000 X g的最大速度下，室溫離心2分鐘，向RNA 離心柱中加入30-50 μ L DEPC水，室溫下放置5分鐘后，在大于12000 X g的最大速度下，室 溫離心1分鐘，離心獲得的液體即為含有總miRNA基因的溶液，將該溶液保存于-70°C備用。
[0043] 實(shí)時(shí)定量PCR(polymerase chain reaction,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）方法的前處理步驟 包括：
[0044] 總miRNA基因的定量：利用分光光度計(jì)（分光光度計(jì)由美國Quawell公司生產(chǎn)，型 號(hào)為Q5000)中RNA定量程序，測定并獲得分離的總miRNA基因的濃度，根據(jù)濃度與體積計(jì) 算總miRNA基因的質(zhì)量。
[0045] 向分離的總miRNA基因中加入外源參考miRNA基因，得到第一混合液：外源參考 miRNA基因的加入量為分離的總miRNA基因質(zhì)量的0. 05%，外源參考miRNA基因的序列如 序列表中SEQ ID NO:2所示，其由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。
[0046] miRNA基因環(huán)化：取含有約5ng總miRNA基因的第一混合液、2μ 110X反應(yīng)緩沖 液、1 μ 150mM的MnCl2、4 μ 15Μ的甜菜堿和1 μ 15u/μ 1的環(huán)化酶，用水補(bǔ)足20 μ 1后混勻， 得到第三混合液；將第三混合液于60°C保溫15分鐘后，80°C保溫10分鐘，使酶失活。將總 miRNA基因和外源參考miRNA基因的5'端與3'端連接，獲得環(huán)化的總miRNA基因和環(huán)化的 外源參考miRNA基因的混合液，該混合液用于滾環(huán)逆轉(zhuǎn)錄。其中，環(huán)化酶由美國Epicentre 公司生產(chǎn)，貨號(hào)為CL9021K。隨該酶一起提供的還有：10X反應(yīng)緩沖液、50mM的MnCl2、5M的 甜菜堿和無酶水。
[0047] 環(huán)化的總miRNA基因和環(huán)化的外源參考miRNA基因的混合液的逆轉(zhuǎn)錄：取環(huán)化的 總miRNA基因和環(huán)化的外源參考miRNA基因的混合液2 μ 1、5 μ 1濃度為1 μ Μ的逆轉(zhuǎn)錄引 物、2 μ 1濃度為10mM的dNTP、5 μ 1濃度為lOOmM的DTT、20U的逆轉(zhuǎn)錄酶（美國Invitrigen 公司生產(chǎn)，貨號(hào)為18064-014)和5μ110Χ的逆轉(zhuǎn)錄緩沖液（隨逆轉(zhuǎn)錄酶一起提供），用 水補(bǔ)足50μ 1混勻后，42°C保溫2小時(shí)，75°C保溫15分鐘，使酶失活。該逆轉(zhuǎn)錄引物包括 miRNA5794基因的逆轉(zhuǎn)錄引物和外源參考miRNA基因的逆轉(zhuǎn)錄引物，miRNA5794基因的序列 如序列表中SEQ ID NO: 1所示；據(jù)此設(shè)計(jì)的miRNA5794基因的逆轉(zhuǎn)錄引物如序列表中SEQ ID N0:7所示；夕卜源參考miRNA基因的逆轉(zhuǎn)錄引物序列如序列表中SEQ ID N0:8所示，上述 逆轉(zhuǎn)錄引物均由美國Invitrigen公司合成。其中，逆轉(zhuǎn)錄包括兩類，一類為目標(biāo)基因，即 miRNA5794基因的逆轉(zhuǎn)錄，另一類為外源參考miRNA基因（外源參考miRNA基因命名為ECK 基因）的逆轉(zhuǎn)錄，兩個(gè)逆轉(zhuǎn)錄過程平行進(jìn)行，且所有反應(yīng)成份與條件均相同，僅逆轉(zhuǎn)錄引物 不一致。對于miRNA5794基因的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)來說，所設(shè)計(jì)的逆轉(zhuǎn)錄引物跨過了 mi RNA5794 基因環(huán)化時(shí)的連接接點(diǎn)，因此，在逆轉(zhuǎn)錄時(shí)，僅環(huán)化成功的miRNA5794基因被逆轉(zhuǎn)錄，從而 降低了其他基因的干擾。
[0048] 實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的表達(dá)量：實(shí)時(shí)定量PCR同樣包括兩類，一類為 目標(biāo)基因，即miRNA5794基因的實(shí)時(shí)定量，另一類為外源參考miRNA基因的實(shí)時(shí)定量，二者 平行進(jìn)行，所有反應(yīng)成份與條件均相同，僅引物不相同。引物包括：miRNA5794基因正向引 物序列如序列表中SEQ ID N0:3所示；mi RNA5794基因反向引物序列如序列表中SEQ ID N0:4所示。引物還包括：夕卜源參考miRNA基因正向引物序列如序列表中SEQ ID N0:5所示； 外源參考mi RNA基因反向引物序列為如序列表中SEQ ID N0:6所示。實(shí)時(shí)定量PCR引物 均由美國Invitrigen公司合成。
[0049] 實(shí)時(shí)定量PCR方法的具體步驟如下：取2 μ 1上述逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、3 μ 1濃度為1 μ Μ 的引物（這里的引物指正向引物和反向引物等摩爾比混合物，即指序列如序列表中SEQ ID N0:3所示的miRNA5794基因正向引物和序列如序列表中SEQ ID N0:4所示的miRNA5794 基因反向引物的等摩爾比的混合物，或者指序列如序列表中SEQ ID N0:5所示的外源參考 miRNA基因正向引物和序列如序列表中SEQ ID N0:6所示的外源參考miRNA基因反向引物 的等摩爾比的混合物）、1〇 μ 1日本Toyobo公司生產(chǎn)的定量PCR混合物（貨號(hào)為QPS-201) 和0.411150倍的1?(?熒光校正染料（由日本1' 〇7〇13〇公司生產(chǎn)，并且隨0?5-201-起提供） 混合均勻，得到第二混合液，將該第二混合液在ABI StepOne實(shí)時(shí)定量PCR儀中按如下程 序進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測：50°C 2分鐘；95°C 10分鐘；95°C 45秒，56°C 45秒，66°C 30秒， 67°C 30秒，共45個(gè)循環(huán)，其中，66°C 30秒和67°C 30秒在每循環(huán)一次后分別增加0. 1°C和 0.2°C，在每一次循環(huán)的最后一步收集熒光信號(hào)，熒光信號(hào)的強(qiáng)弱用于衡量表達(dá)量的多少。 實(shí)時(shí)定量的結(jié)果由Microsoft Excel2010進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)處理時(shí)以外源參考miRNA基因?yàn)?miRNA5794表達(dá)分析的參考基因。結(jié)果見表1:
[0050] 表1 miRNA5794基因在對照水稻與待測水稻間的相對表達(dá)量
[0051]

【權(quán)利要求】
1. 一種利用miRNA5794基因預(yù)測水稻白葉枯病的方法，其特征在于，所述方法包括以 下步驟： 選取9311水稻品種作為待測水稻和對照水稻； 栽培所述待測水稻和所述對照水稻； 分別分離所述待測水稻和所述對照水稻中的總miRNA基因； 分別檢測所述待測水稻和所述對照水稻中的所述總miRNA基因中的miRNA5794基因的 表達(dá)量，所述miRNA5794基因的序列如序列表中SEQ ID N0:1所示； 根據(jù)所述待測水稻和所述對照水稻中的miRNA5794基因的表達(dá)量，判定實(shí)驗(yàn)是否成 功，若成功，則進(jìn)一步判斷所述待測植株是否感染白葉枯病。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述栽培所述待測水稻和所述對照水稻 時(shí)，所述對照水稻在栽培時(shí)采用保護(hù)性栽培措施并防治白葉枯病，除所述保護(hù)性栽培措施 和防治白葉枯病外，所述對照水稻與所述待測水稻的栽培條件保持一致。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述保護(hù)性栽培措施包括土壤隔離、水源 隔離和空間隔離。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在上午8 :55?9 :05利用所述待測水稻 和所述對照水稻的相同葉片的相同部位進(jìn)行所述總miRNA基因的分離。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，采用實(shí)時(shí)定量PCR方法，檢測所述 miRNA5794基因在所述待測水稻和所述對照水稻中的表達(dá)量。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述實(shí)時(shí)定量PCR方法的前處理步驟包 括： 利用分光光度計(jì)測定并獲得分離的所述總miRNA基因的濃度； 向所述總miRNA基因中加入外源參考miRNA基因，得到第一混合液，所述外源參考 miRNA基因的加入量為所述總miRNA基因質(zhì)量的0. 05 %，所述外源參考miRNA基因的序列 如序列表中SEQ ID NO:2所示； 分別將所述總miRNA基因和所述外源參考miRNA基因的5'端與3'端連接，得到環(huán)化 的所述總miRNA基因和環(huán)化的所述外源參考miRNA基因的混合液； 將所述環(huán)化的總miRNA基因和所述環(huán)化的外源參考miRNA基因的混合液進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄， 得到的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用于進(jìn)行所述實(shí)時(shí)定量PCR檢測。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述采用實(shí)時(shí)定量PCR方法，檢測所述 miRNA5794基因在所述待測水稻和所述對照水稻中的表達(dá)量，包括： 將2μ 1所述逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、3μ 1濃度為ΙμΜ的引物、10μ 1定量PCR混合物和0.4μ 150 倍的ROX熒光校正染料混合均勻，得到第二混合液，將所述第二混合液在實(shí)時(shí)定量PCR儀中 進(jìn)行反應(yīng)，所述反應(yīng)程序?yàn)椋?0°C 2分鐘；95°C 10分鐘；95°C 45秒，56°C 45秒，66°C 30秒， 67°C 30秒，共45個(gè)循環(huán)，其中，66°C 30秒和67°C 30秒在每循環(huán)一次后分別增加0. 1°C和 0. 2°C，在每一次循環(huán)的最后一步收集熒光信號(hào)，所述熒光信號(hào)的強(qiáng)弱用于衡量所述表達(dá)量 的多少； 所述引物包括：序列如序列表中SEQ ID NO:3所不的miRNA5794基因正向引物、序列 如序列表中SEQ ID N0:4所示的miRNA5794基因反向引物、序列如序列表中SEQ ID NO:5 所示的外源參考miRNA基因正向引物、以及序列如序列表中SEQ ID NO:6所示的外源參考 miRNA基因反向引物。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，將所述環(huán)化的總miRNA基因和所述環(huán)化的 外源參考miRNA基因的混合液進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄的步驟包括： 取所述環(huán)化的總miRNA基因和環(huán)化的外源參考miRNA基因的混合液2 μ 1、5 μ 1濃度為 1 μ Μ的逆轉(zhuǎn)錄引物、2 μ 1濃度為10mM的dNTP、5 μ 1濃度為lOOmM的DTT和20U的逆轉(zhuǎn)錄 酶，用水補(bǔ)足50μ 1混勻后，得到第四混合液，將所述第四混合液于42°C保溫2小時(shí)，75°C 保溫15分鐘，使酶失活，得到所述逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物；所述逆轉(zhuǎn)錄引物包括miRNA5794基因的逆轉(zhuǎn) 錄引物和外源參考miRNA基因的逆轉(zhuǎn)錄引物，所述miRNA5794基因的逆轉(zhuǎn)錄引物序列如序 列表中SEQ ID NO: 7所示，所述外源參考miRNA基因的逆轉(zhuǎn)錄引物序列如序列表中SEQ ID NO:8所示。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述判定實(shí)驗(yàn)是否成功的方法為：若所述 對照水稻的miRNA5794基因的表達(dá)量最大值與表達(dá)量最小值的比值小于1. 5,則實(shí)驗(yàn)成功； 若所述對照水稻的miRNA5794基因的表達(dá)量最大值與表達(dá)量最小值的比值大于等于1. 5， 則實(shí)驗(yàn)不成功。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，判定所述待測植株是否感染白葉枯病的 方法為：若所述待測水稻的miRNA5794基因的表達(dá)量小于2倍所述對照水稻的miRNA5794 基因的表達(dá)量，則所述待測水稻未感?。蝗羲龃郎y水稻的miRNA5794基因的表達(dá)量大于 或等于2倍的所述對照水稻的miRNA5794基因的表達(dá)量，則所述待測水稻感病。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104141003SQ201410309692
【公開日】2014年11月12日 申請日期:2014年6月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月30日
【發(fā)明者】馮濤, 李甜甜 申請人:江漢大學(xué)