綠鮑與皺紋盤鮑雜交種的二步pcr分子鑒定方法
【專利摘要】綠鮑與皺紋盤鮑雜交種的二步PCR分子鑒定方法，涉及一種鮑的DNA分子標(biāo)記檢測。(1)采用海洋動物組織基因組DNA提取試劑盒提取綠鮑、皺紋盤鮑及其雜交子一代基因組DNA；(2)以所提取的基因組DNA為模板進行多重PCR和常規(guī)PCR的平行擴增；(3)PCR擴增反應(yīng)程序為：多重PCR反應(yīng)程序和常規(guī)PCR反應(yīng)程序；(4)對兩個PCR反應(yīng)擴增產(chǎn)物分別進行凝膠電泳；(5)將電泳圖譜與標(biāo)準(zhǔn)圖譜進行比對；(6)對電泳結(jié)果圖譜進行分析。利用綠鮑和皺紋盤鮑線粒體基因和核基因的種間特異性位點，檢測時間短、結(jié)果直觀，檢測成本低、檢測技術(shù)易于操作，可準(zhǔn)確、簡單、快捷的對雜交種的真?zhèn)芜M行檢測，具有應(yīng)用和推廣價值。
【專利說明】綠鮑與皺紋盤鮑雜交種的二步PCR分子鑒定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種鮑的DNA分子標(biāo)記檢測，尤其是涉及綠鮑與皺紋盤鮑雜交種的二步PCR分子鑒定方法。
【背景技術(shù)】
[0002]鮑是海洋貝類的一種，被譽為海產(chǎn)八珍之首，素有“軟黃金”之稱，具有極高的營養(yǎng)價值和經(jīng)濟價值。我國是世界第一養(yǎng)鮑大國，據(jù)2012年漁業(yè)管理部門統(tǒng)計，我國鮑的養(yǎng)殖產(chǎn)量達9萬余噸，占全球鮑產(chǎn)量的80%以上，年產(chǎn)值超100億元，鮑養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)現(xiàn)已成為我國海水養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的支柱之一。
[0003]皺紋盤鮑(Haliotis discus hannai)主要分布在遼東半島和山東半島一帶,近年來，南移養(yǎng)殖成功，已成為我國南方主要的養(yǎng)殖鮑種。但由于皺紋盤鮑的耐高溫能力較差，夏季高溫期死亡率高,給養(yǎng)殖生產(chǎn)帶來巨大損失。本 申請人:2009年從美國弓丨進一批綠鮑(Haliotis f μ I gen),該鮑種具有個體大、耐高溫、繁殖量大、肉質(zhì)鮮美等特點。根據(jù)綠鮑與皺紋盤鮑在耐高溫等形狀上的互補性，通過綠鮑與皺紋盤鮑進行雜交，培育出生長快、耐高溫、抗逆性強的品種，對于我國改善鮑養(yǎng)殖品種結(jié)構(gòu)和推動整個鮑養(yǎng)殖業(yè)的產(chǎn)業(yè)鏈發(fā)展具有重要意義。 [0004]目前，國內(nèi)外對鮑及種間雜交的鑒定方法主要有4種:(I)外形特征鑒別:通過鮑的外形特征進行鑒定，如殼色、顏色、呼吸孔高度、螺頂高低水平、腹足顏色等進行判斷。該方法的優(yōu)點是比較直觀可大量操作。其缺點是要求個體規(guī)格較大，在種苗階段難于進行。
(2)同工酶鑒定:主要是通過聚丙烯酰胺凝膠或淀粉凝膠電泳技術(shù)，進一步分析作為基因產(chǎn)物的蛋白質(zhì)和同工酶來鑒定鮑種及不同鮑之間的雜交種。該技術(shù)操作要求嚴(yán)格，程序復(fù)雜，識別不直觀，而且同工酶表達與組織及發(fā)育時期有關(guān)，可利用的酶種類較少，重復(fù)性不夠好。(3)RFLP鑒定:對樣品純度要求較高，樣品用量大，技術(shù)步驟繁瑣、成本較高，應(yīng)用受到了一定的限制。(4)SSR微衛(wèi)星鑒定:檢測位點數(shù)量多，多態(tài)性高，但結(jié)果不夠直觀，結(jié)果具有共顯性，并且不能鑒定出雜交種的母本。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供能簡單、快速鑒定綠鮑與皺紋盤鮑雜交種的綠鮑與皺紋盤鮑雜交種的二步PCR分子鑒定方法。
[0006]本發(fā)明的具體步驟如下:
[0007](I)采用海洋動物組織基因組DNA提取試劑盒提取綠鮑、皺紋盤鮑及其雜交子一代基因組DNA ；
[0008](2)以所提取的基因組DNA為模板進行多重PCR和常規(guī)PCR的平行擴增；
[0009]多重PCR擴增采用兩對特異性引物:
[0010]引物1:afal42
[0011]F:CCGTTGAACATGCTCACAGTA[0012]R: TAATGGGCACATTCCGTAAAT
[0013]引物2:DF_1
[0014]F:ATCTCAATTAGTGCGACATCAC
[0015]R:CCAGAGCAAACTGATCGACTG
[0016]常規(guī)PCR擴增中采用的特異性引物:
[0017]引物:DF-2
[0018]F:TTCTCTGTTAATTTGTGTGG
[0019]R:CCGGTCTGAACTCAGATCACGT ；
[0020]在步驟⑵中，所述擴增的反應(yīng)體積可為25μ1，其中各組分用量可為:Buffer (IOmM) 2.5 μ I，dNTP (2.5mM) 0.5 μ I，Mg2+ (25mM) 1.5 μ I，rTaq (5U/ μ I) 0.2 μ I，弓 I物0.2mM，基因組DNA20-100ng，用雙蒸水補齊到25 μ I ;所述引物I與引物2的體積比可為I: 10
[0021](3) PCR擴增反應(yīng)程序為:
[0022]多重PCR反應(yīng)程序:
[0023]94°C3min— {94°C30s— [65°C —55°C每個循環(huán)降低0.5°C] — 72°C20s} X20 — {94°C 30s — 55°C 30s — 72°C 15s} — 72°C IOmin — 4°C^ ；
[0024]常規(guī)PCR反應(yīng)程序:
[0025]94°C 3min — {94°C 30s — 54°C 30s — 30°C 30s} X 30 — 72°C IOmin — 4°C ⑴；
[0026](4)對兩個PCR反應(yīng)擴增產(chǎn)物分別進行凝膠電泳；
[0027]在步驟(4)中，所述凝膠電泳可采用瓊脂糖凝膠電泳，質(zhì)量體積百分比濃度可為
1.2%, 100V電壓，電泳時間可為20~40min ；
[0028](5)將電泳圖譜與標(biāo)準(zhǔn)圖譜進行比對。
[0029](6)對電泳結(jié)果圖譜進行分析，其中:
[0030]多重PCR中，由引物I擴增出的目的條帶為大小在250bp左右皺紋盤鮑特異性的條帶(條帶1-1)，由引物2擴增出的目的條帶為大小在500~750bp之間的綠鮑特異性條帶(條帶1-2);常規(guī)PCR中，擴增出的產(chǎn)物是條帶為大小在250bp左右的特異性條帶(條帶 2-1)。
[0031]將電泳結(jié)果于可見燈箱下觀察拍照。
[0032]電泳圖譜進行比對后，只具有條帶1-1的DNA樣品，即為皺紋盤鮑樣品；只具有條帶1-2的DNA樣品，即為綠鮑樣品。同時具有條帶1-1及條帶1-2的樣品，即同時具有親本皺紋盤鮑和親本綠鮑的特異性條帶，說明該個體系二者的雜交種；具有條帶2-1的DNA樣品，即含有綠鮑線粒體基因特異性片段的DNA樣品，能判斷是綠鮑樣品或以綠鮑為母本的雜交子代。不具有任何條帶的DNA樣品，即不含有綠鮑線粒體基因特異性片段的DNA樣品，能判斷是皺紋盤鮑樣品或以皺紋盤鮑為母本的雜交子代。
[0033]同時，具有條帶1-1，條帶1-2，條帶2-1的DNA樣品，說明是以綠鮑為母本，皺紋盤鮑為父本的雜交后代，只具有條帶1-1及條帶1-2的DNA樣品，說明是以皺紋盤鮑為母本，綠鮑為父本的雜交后代。
[0034]本發(fā)明在引種成功的基礎(chǔ)上，對綠鮑與皺紋盤鮑進行雜交育種，獲得了綠鮑與皺紋盤鮑的雜交子代。經(jīng)驗證，雜交種在長勢、存活率及抗逆性上具有較高的雜種優(yōu)勢。然而，由于雜交種的外形與其父母本綠鮑和皺紋盤鮑過于相似，無法通過外形進行有效的鑒別。為準(zhǔn)確判斷雜交種的真?zhèn)?、保護鮑養(yǎng)殖人員的利益、提供鮑養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的積極性，本發(fā)明提供了一種準(zhǔn)確、快捷的雜交種鑒定方法。
[0035]本發(fā)明采用多重PCR和常規(guī)PCR相結(jié)合的二步PCR法，利用綠鮑和皺紋盤鮑線粒體基因和核基因的種間特異性位點，具有檢測時間短、結(jié)果直觀，檢測成本低、檢測技術(shù)易于操作等優(yōu)點，可準(zhǔn)確、簡單、快捷的對雜交種的真?zhèn)芜M行檢測，具有應(yīng)用和推廣價值。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0036]圖1為電泳圖譜對比圖。
[0037]圖2為電泳圖譜對比圖。
[0038]在圖1和2中，M是DNA marker (DL2000) ; I~4是皺紋盤鮑，5~8是綠鮑，9~12是綠鮑與皺紋盤鮑反交子一代(皺紋盤鮑早X綠鮑? ), 13~16是綠鮑與皺紋盤鮑正交子一代(綠鮑早X皺紋盤鮑? );從上至下，條帶大小分別為2000bp，750bp，250bp。
【具體實施方式】
[0039]實施例1
[0040]參見圖1，利用綠鮑早X皺紋盤鮑?進行雜交，獲得雜交苗種，采用采用天根海洋動物組織基因組DNA提取試劑盒(目錄號:DP324)提取樣品的基因組DNA。以DNA模板平行進行常規(guī)PCR和多重PCR擴增反應(yīng)，反應(yīng)最適體積為25 μ 1，其中各組分終濃度分別為:BufferlOmM, dNTP0.2mM, Mg2+1.5mM, TaqlU，引物對 0.2mM(如引物多對，0.2mM 為標(biāo)準(zhǔn)量)，基因組DNA50ng，用雙蒸水補齊到25 μ I ;
[0041]引物1:afal42
[0042]F:CCGTTGAACATGCTCACAGTA
[0043]R: TAATGGGCACATTCCGTAAAT
[0044]引物2:DF_1
[0045]F:ATCTCAATTAGTGCGACATCAC
[0046]R:CCAGAGCAAACTGATCGACTG
[0047]注:其中引物I與引物2的體積比為1:1
[0048]常規(guī)PCR擴增中采用的特異性引物:
[0049]引物:DF-2
[0050]F:TTCTCTGTTAATTTGTGTGG
[0051]R:CCGGTCTGAACTCAGATCACGT
[0052](3) PCR擴增反應(yīng)程序為:
[0053]多重PCR反應(yīng)程序:
[0054]94°C3min— {94°C30s— [65°C —55°C每個循環(huán)降低0.5°C] — 72°C20s} X20 — {94°C 30s — 55°C 30s — 72°C 20s} — 72°C IOmin — 4°C^?。
[0055]常規(guī)PCR反應(yīng)程序:
[0056]94°C 3min — {94°C 30s — 54°C 30s — 72°C 30s} X 30 — 72°C IOmin — 4°C ⑴。
[0057]PCR反應(yīng)結(jié)束后，取4.5 μ I PCR擴增產(chǎn)物在質(zhì)量體積百分比濃度為1.2%的瓊脂糖凝膠上進行電泳，IOOV電壓，電泳20~40min。電泳結(jié)束后在可見燈箱下進行觀察，同時對電泳圖譜進行對比分析。
[0058]電泳圖譜進行比對后，只具有條帶1-1的DNA樣品，說明該個體為皺紋盤鮑的DNA樣品；只具有條帶1-2的DNA樣品，說明該個體為綠鮑的DNA樣品。同時具有條帶1_1及條帶1-2的樣品，即同時具有親本皺紋盤鮑和親本綠鮑的特異性條帶，說明該個體系雜交種，缺少其中任意一條即為假雜種；具有條帶1-1，條帶1-2，條帶2-1的DNA樣品，說明是以綠鮑為母本，皺紋盤鮑為父本的雜交后代。三條特征帶缺一，均不能證明該雜交種為綠鮑為母本皺紋盤鮑為父本的雜種個體。
[0059]實施例2
[0060]參見圖1與2，與實施例1相似，所不同之處在于利用皺紋盤鮑早X綠鮑?進行雜交，獲得雜交苗種。將PCR擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果圖譜進行比對，只具有條帶1-1的DNA樣品，說明該個體為皺紋盤鮑的DNA樣品；只具有條帶1-2的DNA樣品，說明該個體為綠鮑的DNA樣品。同時具有條帶1-1及條帶1-2的樣品，即同時具有親本皺紋盤鮑和親本綠鮑的特異性條帶，說明該個體系雜交種，缺少其中任意一條即為假雜種；具有條帶1-1，條帶1-2，不具有條帶2-1的DNA樣品，說明是以皺紋盤鮑為母本，綠鮑為父本的雜交后代。兩條帶條帶缺一或多一，均不能證明該雜交種為皺紋盤鮑為母本綠鮑為父本的雜種個體。
[0061]本發(fā)明利用線粒體基因特異性片段和核基因特異性片段共同對二種鮑的雜交種及其親本進行分子鑒定，具有遺傳穩(wěn)定、操作簡便、鑒定快速、結(jié)果直觀、經(jīng)濟實用等優(yōu)點。采用動物組織基因組DNA提取試劑盒提取綠鮑、皺紋盤鮑及其正反雜交種的基因組DNA，進行多重PCR和常規(guī)PCR擴增反應(yīng)，采用瓊脂糖凝膠電泳對擴增產(chǎn)物進行觀察，比對親本與正、反雜交子代特異性條帶的差異，進而鑒別出綠鮑、皺紋盤鮑及其正反雜交種。
【權(quán)利要求】
1.綠鮑與皺紋盤鮑雜交種的二步PCR分子鑒定方法，其特征在于其具體步驟如下: (1)采用海洋動物組織基因組DNA提取試劑盒提取綠鮑、皺紋盤鮑及其雜交子一代基因組DNA ； (2)以所提取的基因組DNA為模板進行多重PCR和常規(guī)PCR的平行擴增； 多重PCR擴增采用兩對特異性引物:
引物 I:afal42
F: CCGTTGAACATGCTCACAGTA
R:TAATGGGCACATTCCGTAAAT
引物2 =DF-1
F:ATCTCAATTAGTGCGACATCAC
R:CCAGAGCAAACTGATCGACTG
常規(guī)PCR擴增中采用的特異性引物: 引物:DF-2
F: TTCTCTGTTAATTTGTGTGG
R:CCGGTCTGAACTCAGATCACGT ； (3)PCR擴增反應(yīng)程序為: 多重PCR反應(yīng)程序: 94°C3min— {94°C30s— [65°C —55?每個循環(huán)降低0.5°C ] ^ 72°C 20s} X20^ {94°C30s — 55°C 30s — 72°C 15s} — 72°C IOmin — 4°C^ ； 常規(guī)PCR反應(yīng)程序:
94°C 3min — {94°C 30s — 54°C 30s — 30°C 30s} X 30 — 72°C IOmin — 4°C^ ； (4)對兩個PCR反應(yīng)擴增產(chǎn)物分別進行凝膠電泳； (5)將電泳圖譜與標(biāo)準(zhǔn)圖譜進行比對； (6)對電泳結(jié)果圖譜進行分析，其中: 多重PCR中，由引物I擴增出的目的條帶為大小在250bp左右皺紋盤鮑特異性的條帶，記為條帶1-1，由引物2擴增出的目的條帶為大小在500~750bp之間的綠鮑特異性條帶，記為條帶1-2 ;常規(guī)PCR中，擴增出的產(chǎn)物是條帶為大小在250bp左右的特異性條帶，記為條帶2-1 ； 將電泳結(jié)果于可見燈箱下觀察拍照； 電泳圖譜進行比對后，只具有條帶1-1的DNA樣品，即為皺紋盤鮑樣品；只具有條帶1-2的DNA樣品，即為綠鮑樣品；同時具有條帶1-1及條帶1-2的樣品，即同時具有親本皺紋盤鮑和親本綠鮑的特異性條帶，說明該個體系二者的雜交種；具有條帶2-1的DNA樣品，即含有綠鮑 線粒體基因特異性片段的DNA樣品，能判斷是綠鮑樣品或以綠鮑為母本的雜交子代；不具有任何條帶的DNA樣品，即不含有綠鮑線粒體基因特異性片段的DNA樣品，能判斷是皺紋盤鮑樣品或以皺紋盤鮑為母本的雜交子代； 同時，具有條帶1-1，條帶1-2，條帶2-1的DNA樣品，說明是以綠鮑為母本，皺紋盤鮑為父本的雜交后代，只具有條帶1-1及條帶1-2的DNA樣品，說明是以皺紋盤鮑為母本，綠鮑為父本的雜交后代。
2.如權(quán)利要求1所述綠鮑與皺紋盤鮑雜交種的二步PCR分子鑒定方法，其特征在于在步驟(2)中，所述擴增的反應(yīng)體積可為25μ 1，其中各組分用量可為:Buffer2.5μ 1，dNTP0.5 μ 1，Mg2+1.5μ 1，rTaq0.2 μ 1，引物 0.2mM，基因組 DNA20_100ng，用雙蒸水補齊到25 μ I。
3.如權(quán)利要求1所述綠鮑與皺紋盤鮑雜交種的二步PCR分子鑒定方法，其特征在于在步驟(2)中，所述引物I與引物2的體積比為1:1。
4.如權(quán)利要求1所述綠鮑與皺紋盤鮑雜交種的二步PCR分子鑒定方法，其特征在于在步驟⑷中，所述凝膠電泳采用 瓊脂糖凝膠電泳，質(zhì)量體積百分比濃度為1.2%, IOOV電壓，電泳時間為20~40min。
【文檔編號】C12Q1/68GK104004855SQ201410279120
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2014年6月20日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月20日
【發(fā)明者】游偉偉, 郭勍, 柯才煥, 任鵬, 駱軒, 黃妙琴 申請人:廈門大學(xué)