一種調(diào)控fbxo31基因表達的小分子rna模擬物在制備胃癌診斷試劑中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種調(diào)控FBXO31基因表達的小分子RNA模擬物在制備胃癌診斷試劑中的應(yīng)用，所述調(diào)控FBXO31基因表達的小分子RNA模擬物，分別為miR-20a的模擬物和miR-17的模擬物；miR-20a的模擬物核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示，miR-17的模擬物核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。本發(fā)明提供了一種診斷胃癌的新思路，為研發(fā)胃癌診斷試劑提供了新途徑。
【專利說明】-種調(diào)控FBX031基因表達的小分子RNA模擬物在制備胃癌 診斷試劑中的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種調(diào)控FBX031基因表達的小分子RNA模擬物在制備胃癌診斷試劑 中的應(yīng)用，屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] 胃癌是世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，其死亡率位居腫瘤相關(guān)死亡的第二 位。根據(jù)2008年的統(tǒng)計數(shù)據(jù)，胃癌發(fā)生率占癌癥總發(fā)生率的8 %，而胃癌死亡率占癌癥相關(guān) 死亡的10%。東亞是胃癌發(fā)病率最高的區(qū)域，特別是中國。由于在胃癌的早期階段很難以 被診斷，導(dǎo)致大多數(shù)患者在發(fā)現(xiàn)時就到了晚期或轉(zhuǎn)移性階段。利用傳統(tǒng)的手術(shù)治療，化療或 放療在改善胃癌患者的生存率方面沒有太大的意義。因此，關(guān)鍵是尋找新的診斷或預(yù)后標(biāo) 志物和治療祀標(biāo)，以提商胃癌患者的存活率。
[0003] FBX031屬于F-box家族，含有F-box結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)參與 Skpl-Cullin-F-box(SCF)E3泛素連接酶復(fù)合體的組成，介導(dǎo)泛素-蛋白酶體依賴的降解途 徑，進而調(diào)控細胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，細胞周期進程，中心體的穩(wěn)定性等。根據(jù)除F-box結(jié)構(gòu)域 之外的其他結(jié)構(gòu)域的組成可將F-box蛋白被分為三大家族。FBXW含有WD40重復(fù)序列；FBXL 含有富含亮氨酸重復(fù)序列和FBX0包含其他領(lǐng)域。FBX031屬于FBX0組。
[0004] FBX031位于染色體16q24. 3,在神經(jīng)元的發(fā)育，DNA損傷修復(fù)反應(yīng)和腫瘤發(fā)生等過 程中起到了至關(guān)重要的作用。FBX031最初被認為是一種候選抑癌基因，研究發(fā)現(xiàn)FBX031在 乳腺癌中表達水平顯著降低，在乳腺癌細胞中過表達FBX031后可抑制細胞的克隆形成及 細胞增殖，誘導(dǎo)細胞衰老和G1期細胞周期阻滯。此外，與正常肝組織相比，F(xiàn)BX031在肝癌中 的表達水平也顯著降低，但在食管鱗狀細胞癌（鱗癌）中FBX031卻得到相反的結(jié)果。K0G0 等人表明，F(xiàn)BX031表達水平越高，腫瘤的侵襲能力越強、臨床分期級別越高，愈后越差。從 這些結(jié)果來看，F(xiàn)BX031在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用還存在爭議。目前還不清楚FBX031在胃 癌中的表達水平和功能如何，以及它在胃癌中是如何被調(diào)控。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種調(diào)控FBX031基因表達的小分子RNA模擬物 的應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明技術(shù)方案如下：
[0007] -種調(diào)控FBX031基因表達的小分子RNA模擬物在制備胃癌診斷試劑中的應(yīng)用，所 述調(diào)控FBX031基因表達的小分子RNA模擬物，分別為miR-20a的模擬物和miR-17的模擬 物；miR-20a的模擬物核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，miR-17的模擬物核苷酸序列如SEQ ID N0. 2 所示。
[0008] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，上述miR_20a的模擬物和miR-17的模擬物作為胃癌診斷試劑 的靶標(biāo)。
[0009] 有益效果
[0010] 本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了 FBX031表達在胃癌組織中顯著降低，該現(xiàn)象與胃癌進展密切 相關(guān)，并找到了調(diào)控FBX031基因的表達的小分子RNA miR-20a和miR-17,發(fā)現(xiàn)調(diào)控FBX031 基因的表達的小分子miR-20a和miR-17的過表達引起FBX031在胃癌中的表達降低，從而 提供了一種診斷胃癌的新思路，為研發(fā)胃癌診斷試劑提供了新途徑。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0011] 圖1FBX031基因在胃癌組織中的表達水平的檢測結(jié)果；
[0012] 圖1A為用RT-PCR方法檢測胃癌標(biāo)本中FBX031的mRNA水平的結(jié)果圖；
[0013] 圖中：N :癌旁正常組織，T :胃癌組織，β 2-M :內(nèi)參。
[0014] 圖1Β為用qRT-PCR的方法檢測53對胃癌標(biāo)本中FBX031的mRNA表達水平的統(tǒng)計 圖；
[0015] 圖1C為用Western blot方法檢測胃癌標(biāo)本中FBX031的蛋白表達水平的結(jié)果圖；
[0016] 圖中：N :癌旁正常組織，T :胃癌組織，β -actin :內(nèi)參。
[0017] 圖1D為用Western blot方法檢測52對胃癌標(biāo)本中FBX031的蛋白表達水平的統(tǒng) 計圖；
[0018] 圖2為胃癌和癌旁組織的組織芯片進行免疫組化檢測結(jié)果照片；
[0019] 圖2A為癌旁組織的組織芯片進行免疫組化檢測結(jié)果照片；
[0020] 圖2B為癌旁組織的組織芯片進行免疫組化檢測結(jié)果照片；
[0021] 圖2C為胃癌組織的組織芯片進行免疫組化檢測結(jié)果照片；
[0022] 圖2D為胃癌組織的組織芯片進行免疫組化檢測結(jié)果照片；
[0023] 圖2E為胃癌組織的組織芯片進行免疫組化檢測結(jié)果照片；
[0024] 圖2F為胃癌組織的組織芯片進行免疫組化檢測結(jié)果照片；
[0025] 圖3為FBX031表達陽性的病人與FBX031表達陰性的病人的存活期限統(tǒng)計曲線 圖；
[0026] 圖4對照質(zhì)粒（pCMV-myc)、表達野生型FBX031的質(zhì)粒（pCMV-myc-FBX031)和 F-box序列缺失的突變質(zhì)粒（pCMV-myc-FBX031 AF)分別轉(zhuǎn)染胃癌細胞BGC-823和HGC-27 后細胞克隆形成能力、細胞周期進程及細胞周期相關(guān)蛋白表達水平的檢測結(jié)果；
[0027] 圖 4A 為 pCMV-myc，pCMV-myc-FBX031，pCMV-myc-FBX031 Λ F 分別轉(zhuǎn)染胃癌細胞 BGC-823和HGC-27后細胞克隆形成能力的檢測結(jié)果；
[0028] 圖 4Β 為 pCMV-myc，pCMV-myc-FBX031，pCMV-myc-FBX031 Λ F 分別轉(zhuǎn)染胃癌細胞 BGC-823和HGC-27后細胞克隆形成數(shù)目的統(tǒng)計圖；
[0029] 圖4C為不同轉(zhuǎn)染的細胞所處的細胞周期的峰值圖；
[0030] 圖中：pCMV為轉(zhuǎn)染對照載體的胃癌細胞，F(xiàn)BX031為轉(zhuǎn)染FBX031表達載體的胃癌細 胞，AFBX031為轉(zhuǎn)染FBX031中F-box區(qū)域缺失的突變載體的胃癌細胞；
[0031] 圖4D為不同轉(zhuǎn)染細胞中細胞周期相關(guān)蛋白的表達水平的檢測結(jié)果；
[0032] 圖5為FBX031對裸鼠體內(nèi)的腫瘤形成能力的影響；
[0033] 圖5A為注射轉(zhuǎn)染對照載體的胃癌細胞和轉(zhuǎn)染FBX031表達載體的胃癌細胞2周 后，裸鼠腫瘤體積與時間關(guān)系的曲線圖；
[0034] 圖5B為注射轉(zhuǎn)染對照載體的胃癌細胞和轉(zhuǎn)染FBX031表達載體的胃癌細胞4周后 的裸鼠照片；
[0035] 圖5C為注射轉(zhuǎn)染對照載體的胃癌細胞和轉(zhuǎn)染FBX031表達載體的胃癌細胞4周 后，移植瘤體積的照片；
[0036] 圖?為注射轉(zhuǎn)染對照載體的胃癌細胞和轉(zhuǎn)染FBX031表達載體的胃癌細胞4周后 移植瘤重量比較柱狀圖；
[0037] 圖6為FBX031受小分子miR-17和miR-20a調(diào)控的檢測結(jié)果；
[0038] 圖6A為miR-20a和miR-17模擬物轉(zhuǎn)染細胞后，miR-17和miR-20a的表達水平柱 狀圖；
[0039] 圖6B為miR-20a和miR-17模擬物轉(zhuǎn)染細胞后，F(xiàn)BX031的mRNA表達水平柱狀圖；
[0040] 圖6C為miR-20a和miR-17模擬物轉(zhuǎn)染細胞后，F(xiàn)BX031的蛋白表達檢測照片；
[0041] 圖6D為miR-20a和miR-17抑制劑轉(zhuǎn)染細胞后，miR-17和miR-20a的表達水平柱 狀圖；
[0042] 圖6E為miR-20a和mi-17的抑制劑轉(zhuǎn)染細胞后，F(xiàn)BX031的mRNA表達水平柱狀圖；
[0043] 圖6F為miR-20a和miR-17抑制劑轉(zhuǎn)染細胞后，F(xiàn)BX031的蛋白表達檢測結(jié)果照片；
[0044] 圖6G為miR-20a和miR-17模擬物分別與野生型、結(jié)合位點1突變型、結(jié)合位點2 突變型及結(jié)合位點1，2均突變型共轉(zhuǎn)染胃癌細胞后，測得的熒光素酶活性柱狀圖；
[0045] 圖7為胃癌組織和癌旁組織中miR-20a和miR-17的表達檢測結(jié)果；
[0046] 圖7A為胃癌組織和癌旁組織中miR_20a的表達水平柱狀圖；
[0047] 圖7B為胃癌組織和癌旁組織中miR-17的表達水平柱狀圖；
[0048] 圖7C為胃癌組織和癌旁組織中miR_20a的表達水平的統(tǒng)計圖；
[0049] 圖7D為胃癌組織和癌旁組織中miR-17的表達水平的統(tǒng)計圖；
[0050] 圖7E為FBX031和miR-20a在胃癌中表達關(guān)系的統(tǒng)計圖；
[0051] 圖7F為FBX031和miR-17在胃癌中表達關(guān)系的統(tǒng)計圖。

【具體實施方式】
[0052] 下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步說明，并非對本發(fā)明的限制，凡依照本 發(fā)明公開的內(nèi)容進行的任何本領(lǐng)域的等同的替代，均屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0053] 實施例1
[0054] RT-PCR、qRT-PCR和Western blot方法檢測表明FBX031的mRNA和蛋白水平在人 胃癌組織中的表達水平均顯著下降；
[0055] 1.材料與方法
[0056] (1)病人
[0057] 56例胃癌及其周圍組織是來自于2012-2013期間在山東省腫瘤醫(yī)院進行胃腫瘤 切除術(shù)的病人，標(biāo)本保存于_80°C。通過對手術(shù)時病人的年齡、性別、病理類型、分化程度、腫 瘤大?。ㄖ睆剑?、侵襲情況、局部及遠端轉(zhuǎn)移的信息進行統(tǒng)計，具體情況如表1所示：
[0058] 表1、病人和腫瘤特征以及在FBX031蛋白在正常黏膜和胃癌組織中的表達水平
[0059] 病人和腫瘤特征 FBX031蛋白相對表達水平3 序號年齡/性別大小(cm) pTNM1 分化程度2 正常 腫瘤 1 66/M 9.0 T4N3M0 MucinousA 0.66 0.31 2 64/F 35 T4N2M0 LDA 1.35 0.36 3 68/M 7.0 T4N3M1 MDA 1.58 0.38 4 51/M 3.0 T3N2M0 LDA 1.12 1.09 5 72/M 2.5 T4N3M0 LDA 1.32 0.89 6 63/M 5.5 T4N3M0 LDA 1.96 0.79
[0060] 7 70/F 4.0 T4N1M1 MDA 1.67 0.10 8 62/M 5.0 T4N1M0 MDA 1.19 0.01 9 62/M 6.0 T4N2M0 LDA 0.43 0.03 10 58/M 2.0 T4N1M0 MDA 1.66 0.48 11 74/M 6? T3N0M0 MDA 1?8 1.18 12 50/F 4.0 T4N2M0 LDA 2.61 1.11 13 56/F 7.5 T4N1M0 LDA 0.20 0.56 14 62/F 3.5 T4N2M0 LDA 2.23 0.52 15 38/F 8.0 T4N1M0 LDA 1.09 1.33 16 59/M 4.0 T4N0M0 MucinousA 0.96 0.87 17 62/M 6.0 T4N3M0 LDA 1.78 0.01 18 58/F 4.0 T4N3M1 LDA 1.08 1.G9 19 54/M 7.0 T4N0M0 MucinousA 0.75 0.23 20 31/M 6.0 T4N3M1 LDA 072 1.04 21 54/M 4.0 T2N0M0 LDA 2.12 0.41 22 61/M 12 T4N1M0 LDA 0.54 0.02 23 49/M 3.0 T4N0M0 LDA 0.82 0.14 24 40/M 6.0 T4N1M0 MDA 0.27 0.10 25 61/M 5.0 T4N0M0 LDA 0.38 0.15 26 37/M 6.0 T4N3M0 LDA 2.40 2.10 27 60/M 5? T4N3M0 LDA 045 0 73 28 49/F 3.0 T4N1M0 LDA 2.89 1.38 29 46/F 2.0 T4N2M1 LDA 1.17 0.13 30 59/M 6.0 T4N3M0 LDA 1.21 1.19 31 59/F 11 T4N3M0 LDA 0.98 0.24 32 64/M 5.5 T4N3M0 LDA 2.13 0.51 33 65/M 5.5 T4N3M0 MucinousA 1.06 0.22 34 68/M 4.5 T4N3M0 LDA 1.S7 0 21 35 68/M 5 T4N3M0 LDA 36 52/F 9.0 T4N1 MO MDA 0.42 0.21
[0061] 37 69/M 7.5 T4N3M1 LDA 1.35 0.47 38 46/F 2.0 T4N1M0 LDA 2.78 1.12 39 59/M 8.2 T3N0M0 LDA 2.69 1.02 40 68/M 7.0 T4N1M0 MucinousA 1.02 1.57 41 64/M 5.5 T4N1M0 LDA 0.57 0.27 42 69/M 8,0 T4N2M0 MDA 2.38 0.42 43 45/M 10 T4N2M0 LDA 121 1.98 44 65/M 10 T4N3M1 LDA 0.46 0.32 45 69/M 7.5 T4N3M1 LDA 0.51 0.57 46 75/M 9.5 T4NOMO MDA - - 47 73/M 6,0 T4N2M0 LDA 0 48 0 26 48 77/M 1.5 T4N2M0 LDA - - 49 52/M 1 5 T4N3M0 LDA - - 50 37/F 13 T4N3M1 LDA 3 21 0.51 51 66/F 3.5 T4N2M0 LDA 0.88 0.59 52 30/F 4.5 T4N3M0 LDA 0.72 1.01 53 80/M 11 T4N3M1 MDA 1.76 181 54 56/F 5.4 T4N2M0 LDA 0.62 0.73 55 79/M 5.5 T4N2M0 MDA 1.42 0.09 56 56/M 5.5 T4N1M0 MDA 1.39 0.31
[0062] h 病理 tumor-node-metastasis。
[0063] 2_組織學(xué)分化狀態(tài)：LDA，Low低分化腺癌；MDA，中分化腺癌；MucinousA，粘液腺 癌。
[0064] 3_Western blot分析FBX031在胃癌和相應(yīng)的癌旁組織中的表達水平，相對蛋白豐 度基于條帶的密度掃描值并與內(nèi)參β-actin.相比不表達
[0065] (2) RNA 提取，反轉(zhuǎn)錄和 qRT-PCR
[0066] TRIzol試劑（購自Invitrogen公司）用于從組織標(biāo)本中提取總得RNA，具體步 驟：
[0067] ①收集細胞，PBS洗滌細胞后加入1ml Trizol后充分吹吸沉淀，室溫靜置5min。
[0068] ②加入0. 2ml的氯仿，渦旋振蕩器振蕩15s，室溫靜置2min。
[0069] ③ 4°C，12, 000g 離心 15min〇
[0070] ④將上層水相小心轉(zhuǎn)移至新的EP管，加入0. 5ml的異丙醇，輕輕混勻，室溫靜置 10min〇
[0071] ⑤ 4°C，12,000g 離心 lOmin。
[0072] ⑥小心棄上清，加入lml75%的乙醇，輕輕洗滌沉淀。
[0073] ⑦ 4°C，7,500g 離心 5min。
[0074] ⑧小心棄上清，室溫晾干，加入50 μ 1的DEPC-H20溶解RNA沉淀。
[0075] FBX031的PCR引物購買于Invitrogen。FBX031的引物序列如下：
[0076] 5' -CCGGCGGGAGGCAGGAGGAGT-3'（上游引物），
[0077] 5' -GCGGCGGTA GGTCAGGCAGTTGTCG-3'（下游引物）。
[0078] 以上引物是跨FBX031基因的內(nèi)含子區(qū)的，因此PCR產(chǎn)物的結(jié)果排除基因組DNA污 染的影響。
[0079] β 2-微球蛋白的表達（β 2-M)用來作為RNA上樣及反轉(zhuǎn)錄效率和擴增的對照。
[0080] cDNA的第一條鏈由隨機六聚體引物（Ν6)或miRNA引物和M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶（購自 Ferments公司）合成。上述隨機六聚體引物及M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶均購自Ferments公司，miRNA 引物購自廣州銳博生物工程有限公司。
[0081] 實時定量PCR是按照說明書，用Bi〇-RadCFX96TM實時PCR系統(tǒng)（購自Bio-Rad公 司）和the SYBR Green Kit (購自TaKaRa公司）完成的。靶分子的mRNA水平是由CT的方 法表示的，由人類β2-Μ或U6的表達做標(biāo)準(zhǔn)化處理。所有的反應(yīng)均設(shè)了三個復(fù)孔。
[0082] (3)蛋白質(zhì)印記分析
[0083] RIPA裂解液（購自碧云天生物技術(shù)研究院）用來從細胞或組織中提取總蛋白。
[0084] 用BCA法（Merck)檢測蛋白質(zhì)的濃度。蛋白質(zhì)進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電 泳（SDS-PAGE)，然后轉(zhuǎn)膜。將膜用FBX031的抗體（Abeam)進行雜交，加入辣根過氧化 物酶標(biāo)記的二抗。最后通過化學(xué)發(fā)光的方法（ECL，Millipore)檢測蛋白的表達情況。 3-actin(Sigma_Aldrich)用作內(nèi)參。上述方法均可參見以下文獻。
[0085] Yang Q, Wang B, Gao ff, Huang S, Liu Z, Li ff, Jia J. SIRTlis downregulated in gastric cancer and leads to Gl-phase arrest via NF-KB/Cyclin Dlsignaling. Mol Cancer Res. 2013Dec ;11 (12):1497-507.
[0086] (3)數(shù)據(jù)分析
[0087] FBX031的mRNA和蛋白水平表達的差異用t檢驗進行分析。
[0088] 2、實驗結(jié)果
[0089] 用RT-PCR和qRT-PCR的方法檢測了 53對胃癌標(biāo)本中FBX031的mRNA水平。發(fā)現(xiàn) 與對應(yīng)的癌旁組織相比，有38例胃癌組織中的FBX031的mRNA水平明顯降低（71. 7%，P = 0. 0004)，結(jié)果如圖1A和圖1B所示。
[0090] 用Western blot方法檢測了 52對胃癌組織中FBX031蛋白水平的表達情況。用 密度掃描法將條帶進行量化，發(fā)現(xiàn)與其相對應(yīng)的癌旁組織相比，有37例胃癌組織中的 FBX031蛋白表達水平顯著的降低（71.2%，p〈0. 0001)，結(jié)果如圖1C和圖1D所示。該結(jié)果 與qRT-PCR的結(jié)果是相一致的。
[0091] 上述數(shù)據(jù)表明與癌旁組織相比，胃癌組織中FBX031在mRNA和蛋白水平均有明顯 的降低。
[0092] 實施例2
[0093] 免疫組化檢測FBX031的表達與胃癌病人的臨床參數(shù)和術(shù)后存活的關(guān)系
[0094] 1、材料與方法
[0095] (1)組織芯片
[0096] 石蠟包埋的人類胃癌組織芯片購自上海芯超有限公司。一個芯片上含有180個 點，包含90例胃癌病人的標(biāo)本。每一例病人包含兩個點，一個點表不癌組織，另一個點表不 對應(yīng)的癌旁組織。關(guān)于病人的性別、年齡、腫瘤大小、臨床資料和生存周期等資料均由該公 司提供。
[0097] (2)免疫組化檢測
[0098] ①脫蠟和水化：脫蠟前將組織切片60°C烘烤2h
[0099] a.二甲苯脫錯5mimX 3次
[0100] b.無水乙醇浸泡5minX2次
[0101] c. 95%乙醇中浸泡5minX 2次
[0102] d 80%乙醇中浸泡5minX2次
[0103] ②抗原修復(fù)：微波爐加熱0. 01mol/L枸櫞酸鈉緩沖液（pH6. 0)至沸騰，將組織切片 放入，小火加熱20min，自然冷卻至室溫。
[0104] ③免疫組化染色：
[0105] a.取出切片，在蒸餾水中浸泡5min。PBS浸泡沖洗5minX3次。然后滴加3% H202 室溫處理lOmin，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，持續(xù)保持切片的濕潤。PBS浸泡沖洗5min X 3 次。
[0106] b.加入一抗FBX031(1:200稀釋），濕盒4°C過夜。PBS浸泡沖洗5minX3次。
[0107] c.滴加生物素標(biāo)記的二抗，37°C孵育30min。PBS沖洗5minX3次。
[0108] d.滴加 HRP-Streptavidin，37°C孵育 30min。
[0109] e. DAB顯色5-20min，等到陽性明顯，背景清晰，兩者差異對比度大。終止顯色，自 來水沖洗2min，從切片上端緩慢沖下。蘇木素復(fù)染2min。自來水沖洗10-15min。1%鹽酸 酒精分化。1 %氨水返藍。脫水、透明、封片、鏡檢。
[0110] (3)數(shù)據(jù)分析
[0111] FBX031蛋白表達水平與不同的臨床參數(shù)之間的關(guān)系用X2分析（見下面文獻）進 行評價。Cox比例風(fēng)險回歸模型進行單因素和多因素分析，來估計臨床病理參數(shù)和FBX031 蛋白表達水平對病人存活的影響。生存曲線用Kaplan-Meier法進行繪制的。X 2分析方法 可參見：
[0112] Wang DD, Chen YB, Pan K, Wang ff, Chen SP, Chen JG, Zhao JJ, Lv L, Pan QZ, Li YQ, Wang QJ, Huang LX, Ke ML, He J, Xia JC. Decreased expression of the ARID1A gene is associated with poor prognosis in primary gastric cancer. PLoS One. 2012 ；7(7):e40364. doi:10. 1371/journal, pone. 0040364. Epub2012Jull3.
[0113] 2、實驗結(jié)果
[0114] 用含有90對胃癌和癌旁組織的組織芯片進行免疫組化檢測，發(fā)現(xiàn)在所有癌旁組 織中FBX031都有明顯的染色，結(jié)果如圖2A和圖2B所示。而在胃癌組織中有52. 2%的染色 是陰性，結(jié)果如圖2E和圖2F所示。有38. 9 %的染色情況是弱陽性，結(jié)果如圖2C和2D所 /_J、1 〇
[0115] 總體來說，與癌旁組織相比，有84.4%的胃癌組織表現(xiàn)出FBX031蛋白表達水平的 降低。該結(jié)果進一步驗證了 FBX031在胃癌組織中表達水平降低的結(jié)論。
[0116] 通過分析FBX031表達與病人臨床指標(biāo)的聯(lián)系，結(jié)果顯示：FBX031蛋白的表達與腫 瘤大小（P = 〇. 022)，浸潤程度（P = 0. 024)和腫瘤分級（P = 0. 012)都有明顯的關(guān)系。而 與年齡，性別，局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移沒有關(guān)系，如表2所示：
[0117] 表2. FBX031表達與各種臨床病例參數(shù)的相關(guān)性
[0118]

【權(quán)利要求】
1. 一種調(diào)控FBX031基因表達的小分子RNA模擬物在制備胃癌診斷試劑中的應(yīng)用，所 述調(diào)控FBX031基因表達的小分子RNA模擬物，分別為miR-20a的模擬物和miR-17的模擬 物；miR-20a的模擬物核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，miR-17的模擬物核苷酸序列如SEQ ID NO. 2 所示。
2. 如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述miR-20a的模擬物和miR-17的模擬物 作為胃癌診斷試劑的靶標(biāo)。
【文檔編號】C12Q1/68GK104059972SQ201410267450
【公開日】2014年9月24日 申請日期:2014年6月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月16日
【發(fā)明者】劉志方, 張新潮, 徐霞, 孔葉, 鄒水燕 申請人:山東大學(xué)