一株表面具有Galα1-4Galβ1-4GlcNAc結(jié)構(gòu)的工程菌及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種表面具有Galα1-4Galβ1-4GlcNAc結(jié)構(gòu)的工程菌，該工程菌為重組大腸桿菌，菌株命名為大腸桿菌(E.coli)W3110-lgtb-lgtc，是通過在大腸桿菌(E.coli)W3110中表達(dá)β-1,4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因lgtb和α-1,4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因lgtc基因獲得。本發(fā)明還公開了所述工程菌在制備抗志賀氏毒素感染藥物中的應(yīng)用，利用本發(fā)明提供的工程菌能夠發(fā)酵獲得表面具有Galα1-4Galβ1-4GlcNAc三糖結(jié)構(gòu)的志賀氏毒素受體模擬菌，其在抗志賀氏毒素感染藥物開發(fā)和相關(guān)疾病預(yù)防治療中具有良好的應(yīng)用前景。
【專利說明】—株表面具有Ga I α 1 -4Ga I β 1-4G IcNAc結(jié)構(gòu)的工程菌及
其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一株表面具有Gal a l_4Gal β l-4GlcNAc結(jié)構(gòu)的工程菌及其構(gòu)建方法以及該菌株在制備抗志賀氏毒素感染藥物中的應(yīng)用，屬于生物技術(shù)、基因工程和微生物發(fā)酵領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]許多人類病原菌觸發(fā)疾病是通過連接它們的微生物黏附蛋白到宿主細(xì)胞粘膜表面糖復(fù)合物的糖鏈上。例如，產(chǎn)志賀氏毒素大腸桿菌(STEC)產(chǎn)生的志賀氏毒素(Stx)與宿主腸細(xì)胞表面的寡糖鏈globotriose (Gal a l_4Gal β l_4Glc)結(jié)合,然后Stx通過轉(zhuǎn)位跨過腸屏障而進(jìn)入宿主的循環(huán)系統(tǒng)，從而引起痢疾，甚至是危及生命的溶血性尿毒綜合征(HUS)。
[0003]由于志賀氏毒素Stx對人類的危害，許多實(shí)驗(yàn)組對發(fā)展抗志賀氏毒素感染策略進(jìn)行了大量研究。特別的，Stx與globotriose的相互作用為抗Stx感染策略的開發(fā)提供了突破點(diǎn)。例如，Synsorb-Pk,—種由globotriose和硅膠構(gòu)成的綴合物,具有抑制Stx對人類腎腺癌細(xì)胞侵染的作用。在另一個實(shí)驗(yàn)組中，globotriose被結(jié)合到了殼聚糖上，這種globotriose-殼聚糖復(fù)合物能夠高效的吸收并中和非洲綠猴腎細(xì)胞上的Stx。構(gòu)建Stx受體模擬菌也是一種有效的抗Stx感染的設(shè)計(jì)。這種對抗腸道感染的方法是發(fā)展一種無害菌，使它具有和宿主腸細(xì)胞表面相似的寡糖結(jié)構(gòu)globotriose。這種Stx受體模擬菌(Stxreceptor-mimic bacteria)可以競爭地結(jié)合Stx,從而阻止宿主腸細(xì)胞對Stx的吸收。但是，以往研究表明，用GlcNAc替換Glc時，即Pl三糖(Gal a l-4Gal β l_4GlcNac)對Stx具有更強(qiáng)的吸收能力。大腸桿菌(E.coli)W3110的脂多糖(LPS)上的O-抗原天然截短，終止在N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)。利用這個特點(diǎn)有望開發(fā)具有高效抑制志賀氏毒素感染的受體模擬菌，但檢索發(fā)現(xiàn)關(guān)于表面具有Gal a l-4Gal β l_4GlcNAc結(jié)構(gòu)的工程菌還未見報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]針對現(xiàn)有方法的不足，本發(fā)明要解決的問題是提供一株表面具有Gal a l-4Gal β l-4GlcNAc結(jié)構(gòu)的工程菌及其構(gòu)建方法以及該菌株在制備抗志賀氏毒素感染藥物中的應(yīng)用。
[0005]本發(fā)明所述表面具有Gala l-4Gal0 l_4GlcNAc結(jié)構(gòu)的工程菌，其特征在于:所述工程菌為重組大腸桿菌，該菌株命名為大腸桿菌(E.cOli)W3110-lgtb-lgtc，其能夠發(fā)酵獲得表面具有Gala l_4Gali3 l_4GlcNAc三糖結(jié)構(gòu)的志賀氏毒素受體模擬菌，所述大腸桿菌(E.coli)W3110-lgtb-lgtc是通過在大腸桿菌(E.coli)W3110中表達(dá)β _1，4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因Igtb和α-1,4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因Igtc基因獲得，其基因型為W3110/p-lgtb+p-lgtc ;其中，所述Igtb和Igtc基因來源于腦膜炎雙球菌(Neisseriameningitides)MC58, Igtb 基因的載體為 pACT3, Igtc 基因的載體為 pET15b。[0006]上述表面具有Gal a l_4Gal β l_4GlcNAc結(jié)構(gòu)的重組大腸桿菌的構(gòu)建方法，步驟是:
[0007]將來源于腦膜炎雙球菌(Neisseria meningitides)MC58的Igtb基因構(gòu)建到載體PACT3上,得到重組質(zhì)粒pACT3-lgtb,通過CaCl2化學(xué)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化pACT3_lgtb到大腸桿菌(E.coli)W3110 中，得到大腸桿菌(E.coli)W3110_lgtb。
[0008]將來源于腦膜炎雙球菌(Neisseria meningitides)MC58的Igtc基因構(gòu)建到載體pET15b上，得到重組質(zhì)粒pET15b-lgtc，通過CaCl2化學(xué)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化pET15b_lgtc到上述大腸桿菌(E.coli)W3110-lgtb中，得到目標(biāo)重組大腸桿菌菌株，該菌株命名為大腸桿菌(E.coli)W3110-lgtb_lgtc,其基因型為 W3110/p-lgtb+p_lgtc。
[0009]本發(fā)明所述表面具有Gal a l_4Gal β l_4GlcNAc結(jié)構(gòu)的工程菌在制備抗志賀氏毒素感染藥物中的應(yīng)用。
[0010]其中:所述抗志賀氏毒素感染是利用上述工程菌E.coli W3110-lgtb-lgtc發(fā)酵獲得表面具有Gal a l-4Gal β l-4GlcNAc三糖結(jié)構(gòu)的志賀氏毒素受體模擬菌，使其在宿主腸道內(nèi)競爭性結(jié)合進(jìn)入宿主腸道的志賀氏毒素，達(dá)到抑制志賀氏毒素與宿主腸表皮細(xì)胞結(jié)合的效果，從而實(shí)現(xiàn)抑制志賀氏毒素對宿主的侵染。
[0011]其中:所述利用上述工程菌E.coli W3110-lgtb-lgtc發(fā)酵制備表面具有Gal a l-4Gal β l_4GlcNAc三糖結(jié)構(gòu)的志賀氏毒素受體模擬菌的方法是:
[0012]通過發(fā)酵培養(yǎng)大腸桿菌(E.coli)W3110-lgtb-lgtc并施加IPTG誘導(dǎo)，β -1, 4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶LgtB和α -1, 4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶LgtC在大腸桿菌(E.coli)W3110-lgtb-lgtc體內(nèi)表 達(dá)，催化半乳糖基(Gal-)連接到N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)上，搖瓶發(fā)酵最終獲得表面具有Gala l_4Gal0 l_4GlcNAc三糖結(jié)構(gòu)的志賀氏毒素受體模擬菌3.5g/L。
[0013]具體步驟是:
[0014]挑取所構(gòu)建的重組大腸桿菌(E.coli)W31 IO-1gtb-1gtc單菌落至50mL的LB (Luria-BertaniMedium)液體培養(yǎng)基中,氨節(jié)青霉素終濃度為100 μ g/mL,氯霉素終濃度為 30 μ g/mL, 37°C，200-220r/min,培養(yǎng) 12h。
[0015]將上述培養(yǎng)的菌液按照0.5-5% (v/v)的接種量接入1.5L的LB液體培養(yǎng)基中，氨芐青霉素終濃度為0.5-0.2mM，氯霉素終濃度為0.5-0.2mM，37°C，200_220r/min。
[0016]待菌液0D600 = 0.4-0.8時，加入終濃度為0.5-0.2mM的異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，16-370C，170-220r/min,培養(yǎng) 18_24h。
[0017]上述加入IPTG后，發(fā)酵溫度優(yōu)選16°C，培養(yǎng)時間優(yōu)選20h。
[0018]然后收集20g上述經(jīng)IPTG誘導(dǎo)20h的大腸桿菌(E.coli) W3110-lgtb_lgtc細(xì)胞沉淀，用200mL50% (w/v)苯酌在65°C下萃取15min ;然后4°C下10，OOOg離心30min ;收集上清溶液，用三蒸水透析去除苯酚，并凍干透析液；凍干的粉末溶于20mL0.02M醋酸鈉(PH=7.0)中，分別用DNase、RNase和蛋白酶K在37°C處理2h ;4°C下10，OOOg離心30min去除沉淀，然后溶液用110，OOOg超高速離心4°C 12h;離心所得膠狀物用三蒸水溶解，凍干可制備純的脂多糖(LPS)。
[0019]利用MALD1-T0F檢測提取的重組脂多糖(LPS)，結(jié)果見圖4。
[0020]本發(fā)明利用大腸桿菌(E.coli)W3110脂多糖(LPS)的特點(diǎn)，即大腸桿菌(E.coli)W3110的脂多糖上的O-抗原天然截短，終止在N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)。采用在大腸桿菌(E.coli) W3110 中表達(dá)來源于腦膜炎雙球菌(Neisseria meningitides)MC58 的 α -1, 4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶LgtC和β -1, 4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶LgtB，催化半乳糖基(Gal-)連接到N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)上，最終發(fā)酵獲得了表面具有Gal a l-4Gal β l-4GlcNAc三糖結(jié)構(gòu)的志賀氏毒素受體模擬菌，這種受體模擬菌能夠在宿主腸道內(nèi)競爭性結(jié)合進(jìn)入宿主腸道的志賀氏毒素，達(dá)到抑制志賀氏毒素與宿主腸表皮細(xì)胞結(jié)合的效果，從而有效的抑制志賀氏毒素對宿主的侵染。明顯體現(xiàn)了本發(fā)明公開的重組大腸桿菌及其在制備抗志賀氏毒素感染藥物中具有非常重要的價(jià)值。并且，利用本發(fā)明提供的重組大腸桿菌發(fā)酵制備抗志賀氏毒素感染藥物，步驟簡單，生產(chǎn)周期短，成本低，可以應(yīng)用于制備志賀氏毒素受體模擬菌藥物的大規(guī)模生產(chǎn)，是一種有效的抗志賀氏毒素感染策略，在藥物開發(fā)和疾病預(yù)防治療中具有良好的應(yīng)用前景。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]圖1E.coli W3110-lgtb-lgtc志賀氏毒素受體模擬菌構(gòu)建原理示意圖。
[0022]圖2菌落PCR驗(yàn)證大腸桿菌E.coli W3110-lgtb_lgtc中重組質(zhì)粒pACT3_lgtb和pET15b_lgtc。
[0023]圖3雙酶切驗(yàn)證大腸桿菌E.coli W3110-lgtb-lgtc中重組質(zhì)粒pACT3_lgtb和pET15b_lgtc。
[0024]圖4MALD1-T0F檢 測提取的重組脂多糖(LPS)。
【具體實(shí)施方式】
[0025]—般性說明:如下實(shí)施例所涉及的酶均購自Thermo公司，質(zhì)粒提取試劑盒和瓊脂糖凝膠回收DNA片段試劑盒購自BIOMIA公司，操作完全按照相應(yīng)說明書進(jìn)行。質(zhì)粒構(gòu)建中基因測序由華大基因公司完成。出發(fā)菌大腸桿菌(E.coli)W3110來源于ATCC (美國典型菌種保藏中心)；DH5a感受態(tài)細(xì)胞購自全式金生物技術(shù)有限公司。實(shí)施例中的其他實(shí)驗(yàn)方法及試劑如無特殊說明，均為本領(lǐng)域常規(guī)方法與市售試劑。
[0026]所述LB液體培養(yǎng)基為:蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaC15g/L。
[0027]實(shí)施例1、重組質(zhì)粒pACT3_lgtb的構(gòu)建
[0028](I) β -1, 4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶Igtb基因的克隆
[0029]根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫里提供的Igtb基因序列來設(shè)計(jì)引物:
[0030]Igtb-F:
[0031 ] 5，-CCTC GC TCTAGA ATGCAAAACCACGTTATCAGCTTAGC-3，
[0032]Igtb-R:
[0033]5，-CGC CCC AAGCTT TTATTATTGGAAAGGCACAATGA-3 ’
[0034]PCR (聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))反應(yīng)體系如下。
[0035]其中，引物濃度為20ymol/L，總共50 μ L的反應(yīng)體系。
[0036]
【權(quán)利要求】
1.一種表面具有Gal a l-4Gal β l_4GlcNAc結(jié)構(gòu)的工程菌， 其特征在于: 所述工程菌為重組大腸桿菌，該菌株命名為大腸桿菌(E.cOli)W3110-lgtb-lgtc，其能夠發(fā)酵獲得表面具有Gal a l-4Gal β l-4GlcNAc三糖結(jié)構(gòu)的志賀氏毒素受體模擬菌； 上述大腸桿菌(E.coli)W3110-lgtb-lgtc是通過在大腸桿菌(E.coli)W3110中表達(dá)β -1, 4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因Igtb和α -1, 4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因Igtc基因獲得，其基因型為W3110/p_lgtb+p_lgtc ;其中，所述Igtb和Igtc基因來源于腦膜炎雙球菌(Neisseriameningitides)MC58, Igtb 基因的載體為 pACT3, Igtc 基因的載體為 pET15b。
2.權(quán)利要求1所述表面具有Gala l-4Gal β l_4GlcNAc結(jié)構(gòu)的工程菌在制備抗志賀氏毒素感染藥物中的應(yīng)用。
3.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于:所述抗志賀氏毒素感染是利用權(quán)利要求1所述工程菌E.coli W3110-lgtb-lgtc發(fā)酵獲得表面具有Gal a l_4Gal β l_4GlcNAc三糖結(jié)構(gòu)的志賀氏毒素受體模擬菌，使其在宿主腸道內(nèi)競爭性結(jié)合進(jìn)入宿主腸道的志賀氏毒素，達(dá)到抑制志賀氏毒素與 宿主腸表皮細(xì)胞結(jié)合的效果，從而實(shí)現(xiàn)抑制志賀氏毒素對宿主的侵染。
【文檔編號】C12N1/21GK104017765SQ201410267157
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2014年6月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月16日
【發(fā)明者】陳敏, 趙雪爾, 張厚程, 王鵬 申請人:山東大學(xué)