一種異硫鏈霉菌及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種異硫鏈霉菌及其應(yīng)用，該菌株為異硫鏈霉菌（ Streptomyces althioticus ）LMZY，已于2014年3月28日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為：CCTCCM2014110。本發(fā)明所選育的菌株可利用農(nóng)業(yè)廢棄物后高產(chǎn)木聚糖酶，有效解決農(nóng)業(yè)廢棄物的再生利用，降低生產(chǎn)成本，減少環(huán)境污染，提高產(chǎn)品附加價(jià)值。CCTCC NO: M 20141102014.03.28
【專利說明】一種異硫鏈霉菌及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體而言，涉及一株利用玉米芯粉產(chǎn)木聚糖酶能力較強(qiáng)的異硫鏈霉菌lstreptomyces alth1ticus)及其應(yīng)用。
[0002]

【背景技術(shù)】
[0003]半纖維素是繼纖維素以外第二大再生資源，廣泛地存在于木材、禾本科植物、農(nóng)作物廢棄物之中。木聚糖作為植物半纖維素的重要組分，約占植物總糖的三分之一，其主要成分為D-2木糖(是一種能夠被微生物細(xì)胞轉(zhuǎn)化成為單細(xì)胞蛋白質(zhì)和能量來源的五碳糖)。
[0004]木聚糖酶是指可將木聚糖降解成低聚糖和木糖的一組酶的總稱，主要包括內(nèi)切β-1，4-木聚糖酶、外切β-1，4-木聚糖酶和β-木糖苷酶等，其中內(nèi)切β-1，4-木聚糖酶為關(guān)鍵酶。作為新型的紙漿漂白助劑，木聚糖酶能降低漂白氯的用量，降低了造紙工業(yè)中的環(huán)境污染問題；在食品工業(yè)，木聚糖酶處在小麥面粉的改良和提高果蔬汁有效成分浸出率外，其降解形成的功能性低木聚糖有顯著的雙歧桿菌增殖能力，不被消化特性，無齲齒性，促進(jìn)人體對(duì)鈣的吸收等多種良好的生理學(xué)特性作為飼用酶制劑，木聚糖酶可以有效解除木聚糖的抗?fàn)I養(yǎng)性，促進(jìn)畜禽對(duì)粗飼料的消化吸收，同時(shí)添加木聚糖酶還可以減少畜禽腸道疾病，增進(jìn)畜禽健康，使畜禽體重均勻，減少粘糞，降低空氣中氨氣和硫化物濃度；木聚糖酶能水解植物中的半纖維素，所形成的戊糖可以進(jìn)一步用于生產(chǎn)木糖醇、酒精、有機(jī)酸等產(chǎn)品，在可再生資源生物轉(zhuǎn)化利用中具有重要作用。因此，木聚糖酶在造紙、食品、飼料、紡織、醫(yī)藥及能源等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。
[0005]木聚糖酶的種類繁多且廣泛存在于海洋及陸地，但因?yàn)楂@得難易程度及純度的原因，當(dāng)前商用木聚糖酶仍主要依靠微生物發(fā)酵制得。已報(bào)道產(chǎn)木聚糖酶的微生物主要有細(xì)菌、放線菌、真菌、曲霉、木霉等。而國(guó)內(nèi)外研究和應(yīng)用最多的是細(xì)菌、曲霉、木霉所產(chǎn)的木聚糖酶，如:朱啟忠等報(bào)道用麥草提取的半纖維素誘導(dǎo)鏈霉菌Strs-2，產(chǎn)酶活力小于50U/ml ;也有研究者直接用農(nóng)業(yè)廢棄物誘導(dǎo)菌株產(chǎn)生木聚糖酶，但產(chǎn)酶水平普遍較低。如Charin Techapun等報(bào)道菌株鏈霉菌Abl06利用農(nóng)業(yè)廢棄物產(chǎn)酶活力僅15 U/ml ;李家群等用稻草粉在最佳條件下發(fā)酵培養(yǎng)鏈霉菌LH-3，木聚糖酶活力最高為120.3 U/ml)略低于曲霉和木霉，但通常并不分泌纖維素酶，因此其具有較高的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。
[0006]


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]由于放線菌產(chǎn)木聚糖酶的報(bào)道較少，因此本發(fā)明人通過實(shí)驗(yàn)室利用農(nóng)業(yè)廢棄物對(duì)產(chǎn)木聚糖酶的放線菌進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化篩選，篩得的放線菌做進(jìn)一步選育，獲得了一株可利用玉米芯粉高產(chǎn)木聚糖酶的菌株異硫鏈霉菌{Str印tomyces。本發(fā)明所獲得的菌株不僅僅能高產(chǎn)木聚糖酶，更重要的是有效解決了農(nóng)業(yè)廢棄物的再生利用，降低生產(chǎn)成本，減少環(huán)境污染，提高產(chǎn)品附加價(jià)值。
[0008]為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，發(fā)明人通過大量試驗(yàn)反復(fù)進(jìn)行菌種誘變選育研究，并最終獲得了一株利用玉米芯粉產(chǎn)木聚糖酶能力較強(qiáng)的異硫鏈霉菌C?trep tomycesalth1ticus)\MTi,已于2014年3月28日保藏于中國(guó).武漢.武漢大學(xué).中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為:CCTCC Μ 2014110。
[0009]本發(fā)明的涉及的高產(chǎn)木聚糖酶的異硫鏈霉菌{Streptomyces alth1ticus) LMZY具有如下生物學(xué)特征:
形態(tài)學(xué)特征:孢子絲螺旋形，氣生菌絲粉狀，白色，背面淺褐色。
[0010]生理特性:利用葡萄糖、果糖、鼠李糖、甘露醇以及半乳糖；在阿拉伯糖、木糖、肌醇以及麥芽糖等作為碳源；產(chǎn)生抑制革蘭氏陽性和陰性細(xì)菌的異硫霉素(alth1mycin)。
[0011]代謝特性:代謝過程能產(chǎn)木聚糖酶。
[0012]與已有的異硫鏈霉菌相比，本發(fā)明通過誘變篩選獲得的異硫鏈霉菌(S trep tomyces alth1ticus) LMZY具有如下優(yōu)點(diǎn)和顯著進(jìn)步:
(1)本發(fā)明所選育的菌株可利用農(nóng)業(yè)廢棄物后高產(chǎn)木聚糖酶，發(fā)酵后所得發(fā)酵液中木聚糖酶活高達(dá)38.86U/ml。
[0013](2)本發(fā)明有效解決農(nóng)業(yè)廢棄物的再生利用，降低了生產(chǎn)成本，減少環(huán)境污染，提高了產(chǎn)品附加價(jià)值。
[0014]

【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1為發(fā)酵周期對(duì)酶活的影響曲線圖。
[0016]圖2為發(fā)酵溫度對(duì)酶活的影響柱形圖。
[0017]圖3為接種量對(duì)酶活的影響柱形圖。
[0018]圖4為初始pH對(duì)酶活的影響柱形圖。
[0019]圖5為裝液量對(duì)酶活的影響柱形圖。
[0020]

【具體實(shí)施方式】
[0021]以下通過實(shí)施例形式對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說明，但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)施例，凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
[0022]實(shí)施例一:菌種的選育
(1)菌株
異硫鏈霉菌(Streptomyces alth1ticus)
(2)培養(yǎng)基
每1 L所述富集培養(yǎng)基含有:自制玉米芯木聚糖10g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、Κ2ΗΡ041.5 g、MgS04.7H20 1 g，所述液體培養(yǎng)基pH自然；
每1 L所述選擇性分離培養(yǎng)基含有:自制玉米芯木聚糖8g、KN03 lg、NaCl 0.5g、MgS04
?7H20 0.5g、K2HP04lg、瓊脂20g，所述平板固體培養(yǎng)基pH自然；
每1 L所述搖瓶上種子培養(yǎng)基含有:可溶性淀粉20g、KN03 lg、K2HP04 0.5g、MgS04.7H20 0.5g、NaCl 0.5 g、FeS04.7H20 0.0lg，所述液體培養(yǎng)基 pH 自然；
每1 L所述固體斜面培養(yǎng)基含有:可溶性淀粉20g/L、KN03 lg/L、K2HP04 0.5g/L、MgS04
?7H20 0.5g/L、NaCl0.5 g/L、FeS04.7H20 0.01 g/L、瓊脂 20 g/L 0.1MPa 滅菌20min,所述斜面固體培養(yǎng)基pH自然；
每1 L所述搖瓶上復(fù)篩發(fā)酵培養(yǎng)基含有:玉米芯粉20g、酵母粉10 g、K2HP04 0.5g、Na2HP04 0.5g、MgS04.7H20 1.0g，所述發(fā)酵培養(yǎng)基 pH5.5。
[0023](3)實(shí)驗(yàn)中所用溶液
無菌生理鹽水:取8.5g氯化鈉溶于1L的蒸餾水中溶解，0.1MPa滅菌20min。
[0024]⑷實(shí)驗(yàn)步驟
從造紙廠采集土樣10份，水樣6分。首先從每份樣品中取一定樣品，用無菌生理鹽水將樣品打散；再用富集培養(yǎng)基(自制玉米芯木聚糖10g/L、蛋白胨10 g/L、NaCl 5 g/L、K2HP04 1.5 g/L、MgS04.7H20 1 g/L 0.1MPa 滅菌 20min) 30°C培養(yǎng) Id ;接著用生理鹽水梯度稀釋成不同的土壤懸液，取0.1ml涂布于選擇性分離平板置37°C條件下，培養(yǎng)2-4d，挑取透明圈大且明顯的放線菌形態(tài)的菌株作為初篩菌株；挑出平板上的單菌落，接入斜面固體培養(yǎng)基保藏備用。
[0025]通過搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)驗(yàn)證，獲得了一株利用玉米芯粉產(chǎn)木聚糖酶能力較強(qiáng)的異硫鏈霉菌{Streptomyces alth1ticus) LMZY，于2014年3月28日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為:CCTCC Μ 2014110。
[0026]實(shí)例二:異硫鏈霉菌LMZY的培養(yǎng)條件優(yōu)化
(1)菌株:實(shí)例一篩選出的菌種異硫鏈霉菌LMZY
(2)方法步驟:
發(fā)酵培養(yǎng)基為初始培養(yǎng)基(玉米芯粉20g/L、酵母粉10 g/L、K2HP04 0.5g/L、Na2HP040.5g/L、MgS04.7H20 l.0g/L)。初始發(fā)酵條件為:自然pH，接種量10%，裝液量50 ml/250ml, 37 °C，180r/min 搖瓶發(fā)酵 72h。
[0027]采用單因素試驗(yàn)考察異硫鏈霉菌LMZY的發(fā)酵溫度、初始pH、發(fā)酵周期、接種量、裝液量對(duì)木聚糖酶產(chǎn)量的影響。
[0028]a.發(fā)酵周期的優(yōu)選試驗(yàn)
其它發(fā)酵條件為初始發(fā)酵條件，每隔12h取樣測(cè)量木聚糖酶酶活，確定異硫鏈霉菌LMZY產(chǎn)木聚糖酶的最優(yōu)發(fā)酵周期。
[0029]由圖1可知，當(dāng)發(fā)酵到120h時(shí)酶活最高，為3.546U/ml。故選擇發(fā)酵周期為120h。
[0030]b.發(fā)酵溫度的優(yōu)選試驗(yàn)
發(fā)酵時(shí)間取上述試驗(yàn)確定的最優(yōu)結(jié)果，其它發(fā)酵條件為初始發(fā)酵條件，分別在25 °C、28 °C、31 °C、34 °C、37 °C、40 1:和43 °C搖床中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)后測(cè)定木聚糖酶酶活，考察溫度對(duì)異硫鏈霉菌LMZY產(chǎn)木聚糖酶的影響。
[0031]由圖2可知，當(dāng)發(fā)酵溫度為40°C時(shí)，酶活最高，為4.129 U/ml。故選擇發(fā)酵溫度為40。。。
[0032]c.接種量的優(yōu)選試驗(yàn)
發(fā)酵時(shí)間和發(fā)酵溫度取上述試驗(yàn)確定的最優(yōu)結(jié)果，其它發(fā)酵條件為初始發(fā)酵條件，接種量分別為2%、4%、6%、8%、10%和12%時(shí)，考察接種量對(duì)異硫鏈霉菌LMZY產(chǎn)木聚糖酶的影響。
[0033]由圖3知，當(dāng)接種量為6%時(shí)，酶活最高，為4.589U/ml。故選擇接種量為6%。
[0034]d.初始pH的優(yōu)選試驗(yàn)
發(fā)酵時(shí)間、溫度、和接種量取上述試驗(yàn)確定的最優(yōu)結(jié)果，其它發(fā)酵條件為初始發(fā)酵條件，調(diào)整初始pH分別為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0和8.5，搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)后測(cè)定木聚糖酶酶活，考察PH對(duì)異硫鏈霉菌LMZY產(chǎn)木聚糖酶的影響。
[0035]由圖4可知，當(dāng)發(fā)酵初始pH為5.0時(shí)，酶活最高4.876U/ml。故選擇初始pH為5.0。
[0036]e.發(fā)酵搖瓶裝液量的優(yōu)選試驗(yàn)
發(fā)酵時(shí)間、溫度、和接種量和初始PH取上述試驗(yàn)確定的最優(yōu)結(jié)果，其它發(fā)酵條件為初始發(fā)酵條件，采用250 ml搖瓶裝液，搖瓶裝液量分別為30ml、50ml、70ml、90ml時(shí)，考察裝液量對(duì)異硫鏈霉菌LMZY產(chǎn)木聚糖酶的影響。
[0037]由圖5可知，當(dāng)搖瓶裝液量為50ml (搖瓶體積250ml)時(shí)，酶活為4.887U/ml。故選擇裝液量為50ml (搖瓶體積250ml)。
[0038]實(shí)例三:發(fā)酵驗(yàn)證試驗(yàn)
以異硫鏈霉菌LMZY為發(fā)酵菌株；培養(yǎng)條件為發(fā)酵時(shí)間120h，溫度40°C，接種量6%，初始ρΗ5.0，裝液量50ml (搖瓶為250ml);培養(yǎng)基成分為:玉米芯粉31.45g/L、大豆粉16 g/L、硝酸鉀 8g/L、K2HPO4 0.4g/L、Na2HPO4 0.528g、MgSO4.7H20 0.4g/L，進(jìn)行發(fā)酵驗(yàn)證試驗(yàn)。發(fā)酵后所得發(fā)酵液中木聚糖酶活為38.86U/ml。
【權(quán)利要求】
1.異硫鏈霉菌(5.^Γ<9/7?ο?_7--(95.LMZY,它的專利保藏編號(hào)為 CCTCC Μ2014110。
2.權(quán)利要求1所述的異硫鏈霉菌LMZY發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶的工藝。
3.權(quán)利要求1所述的異硫鏈霉菌LMZY在利用農(nóng)業(yè)廢棄物玉米芯粉生產(chǎn)木聚糖酶的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N1/20GK104263667SQ201410260651
【公開日】2015年1月7日 申請(qǐng)日期:2014年6月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月13日
【發(fā)明者】蔡俊, 羅玲, 王常高, 杜馨, 周安盛, 向夢(mèng)雄 申請(qǐng)人:湖北工業(yè)大學(xué)