改性聚丙烯腈樹脂柔性固定化木瓜蛋白酶的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種改性聚丙烯腈樹脂柔性固定化木瓜蛋白酶的方法，包括以下步驟：1)制備柔性載體：包括將聚丙烯腈樹脂微球利用四乙烯五胺進行改性，得改性后的聚丙烯腈柔性載體；2)載體的活化：包括將改性后的聚丙烯腈柔性載體先用磷酸緩沖液浸泡，然后利用戊二醛進行交聯反應；得到戊二醛活化的聚丙烯腈柔性載體；3)制備固定化木瓜蛋白酶：包括將戊二醛活化的聚丙烯腈柔性載體與木瓜蛋白酶進行固定化反應，最終得固定化木瓜蛋白酶。本發(fā)明的方法克服了現有技術所合成的載體在酶固定化過程中，由于剛性碰撞造成的酶活力損失，同時又可最大限度地保留游離酶的均相催化活性，從而解決共價結合法固定化酶活力回收率偏低的問題。
【專利說明】改性聚丙烯腈樹脂柔性固定化木瓜蛋白酶的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種固定化酶的制備方法，具體涉及一種利用改性聚丙烯腈樹脂柔性固定化木瓜蛋白酶的方法，屬于酶固定化【技術領域】。
【背景技術】
[0002]木瓜蛋白酶作為生物催化劑的重要成員之一，在食品、日化、醫(yī)藥等領域有廣泛的應用。盡管木瓜蛋白酶具有優(yōu)良的催化性能，但直接使用游離酶作為生物催化時，不僅回收率低，操作穩(wěn)定性差，且無法實現重復利用，這就造成了酶的浪費，增加了成本，也使應用受到了一定的限制。酶的固定化技術則能夠較好的解決上述問題。固定化木瓜蛋白酶的核心在于合理選擇和設計性能優(yōu)良的固定化載體和簡單有效的固定化方法。然而在利用各類載體對木瓜蛋白酶進行固定化的過程中，人們逐漸發(fā)現傳統(tǒng)的酶固定化方法雖然有很多的優(yōu)點，但都有各自的不足。如包埋法中載體對大分子底物和產物擴散的限制；交聯法中酶的不可再生；物理吸附法和離子結合法中酶易于從載體上脫落等。而由共價結合法制備的固定化酶與載體結合穩(wěn)定，不易脫落，可以長期使用，因此克服了上述固定化方法中的一些不足，但該法的主要不足就在于固定化時常采用較激烈的條件，以牢固的共價鍵形式將酶固定在載體上，因而使酶活損失較大。為此人們期望通過對共價結合法進行改進。
[0003]現有的酶固定化方法主要有如下幾種:
[0004]1.曲偉光等人利用聚合接枝法，合成了一種具有親水性的環(huán)氧聚合物柔性載體:PS-acyl-P (AM-CO-GMA)，并成功用于柔性共價固定化脂肪酶。結果表明，所得固定化酶的熱穩(wěn)定性、操作穩(wěn)定性和 對有機溶劑的耐受性均有提高。但該載體不僅合成步驟繁瑣且穩(wěn)定性較差。
[0005]2.魏榮卿等人采用殼聚糖為載體，選用雙醛淀粉作為改性功能基，柔性固定化木瓜蛋白酶，結果表明，所得固定化酶活回收率明顯提高了。但由于雙醛淀粉具有氧化度不均一、水溶性較差的缺點，不僅反應速度慢，而且嚴重影響酶的固定化的效果，進而影響酶的固定化性質。
[0006]3.選用聚苯乙烯系大孔樹脂作為酶固定化載體，通過接枝改性的方法來改善載體的親水性，用來固定化酶，但這類材料在合成過程中使用了氯甲醚，改性原理屬于加成反應，在改性過程中有氯化氫生成，因此原子利用率不高，對環(huán)境也不友好。

【發(fā)明內容】

[0007]本發(fā)明需要解決的技術問題是提供一種利用柔性載體制備固定化木瓜蛋白酶的方法，采用本發(fā)明的方法能解決共價結合法固定化酶活力回收率偏低的問題。
[0008]為了解決上述技術問題，本發(fā)明提供一種改性聚丙烯腈樹脂柔性固定化木瓜蛋白酶的方法，包括以下步驟:
[0009]I)、制備柔性載體，依次進行以下步驟:
[0010]①、聚丙烯腈樹脂改性:[0011]將聚丙烯腈樹脂微球加入至反應溶劑中浸泡20~28h，從而使聚丙烯腈樹脂微球充分溶脹；然后加入作為親水性柔性基團的四乙烯五胺(TEPA)，作為催化劑的NaOH，所述聚丙烯腈樹脂微球:四乙烯五胺(TEPA) =NaOH的重量比為1: 11~12:0.1~0.2 ;在氮氣保護下于70°C~90°C、以150~200r/min的轉速攪拌反應9~11小時；過濾后，得改性后的聚丙烯腈樹脂微球；
[0012]②、改性后的聚丙烯腈樹脂微球用反應溶劑浸泡洗滌至洗滌液為無色，再依次用去離子水、乙醇、乙醚洗滌(數次)，然后用去離子水洗滌，接著依次進行堿洗、水洗、酸洗和水洗,40~60°C下干燥至恒重，得改性后的聚丙烯腈柔性載體(PAN-TEPA)；
[0013]2)、載體的活化:
[0014]取Ig改性后的聚丙烯腈柔性載體(PAN-TEPA)，用8~12ml (較佳為1mL)的pH為6.5~8.5的磷酸緩沖液浸泡20~28h，從而使改性后的聚丙烯腈柔性載體(PAN-TEPA)充分溶脹；然后過濾分離，得浸泡后PAN-TEPA ；
[0015]在浸泡后PAN-TEPA中加入體積濃度為2%~6%的戊二醛8~12ml (較佳為1mL)，于20~30°C (較佳為25°C )交聯反應7~9h時后，過濾，所得濾餅依次用去離子水、pH為6.5~8.5的磷酸緩沖液洗滌后，于40~60°C下真空干燥至恒重，得到戊二醛活化的聚丙烯腈柔性載體；
[0016]3)、制備固定化木瓜蛋白酶:
[0017]將戊二醛活化的聚丙烯腈柔性載體浸泡在8~12ml (較佳為1mL)的pH為6.5~
8.5的磷酸緩沖液的錐形瓶中，然后加入木瓜蛋白酶，所述木瓜蛋白酶與戊二醛活化的聚丙烯腈柔性載體的質量比為:0.06~0.10:1，于25~35°C (固定化溫度)恒溫振蕩2~4h后，過濾分離；
[0018]所得濾餅用pH為6.5~8.5的磷酸緩沖液進行反復沖洗(8~10次)后，于36~380C (較佳為37°C )的真空干燥器中干燥4.5~5.5h(較佳為5h)后,得固定化木瓜蛋白酶。于冰箱中保存(4°C )即可。
[0019]作為本發(fā)明的改性聚丙烯腈樹脂柔性固定化木瓜蛋白酶的方法的改進:
[0020]所述步驟I)中的反應溶劑為乙二醇(ED)。
[0021]作為本發(fā)明的改性聚丙烯腈樹脂柔性固定化木瓜蛋白酶的方法的進一出改進:
[0022]所述步驟①:加入四乙烯五胺(TEPA)和NaOH后，接通氮氣，在氮氣保護下先以150~200rpm的攪拌速度在20~30°C的常溫下攪拌1.5~2.5h ;然后繼續(xù)在氮氣保護下于70°C~90°C、以150~200r/min的轉速攪拌反應9~11小時；過濾后，得改性后的聚丙烯腈樹脂微球。
[0023]作為本發(fā)明的改性聚丙烯腈樹脂柔性固定化木瓜蛋白酶的方法的進一出改進:所述pH為6.5~8.5的磷酸緩沖液具體為0.lmol/L的pH7.0的磷酸緩沖液(PBS)。
[0024]作為本發(fā)明的改性聚丙烯腈樹脂柔性固定化木瓜蛋白酶的方法的進一出改進:所述步驟①每Ig聚丙烯腈樹脂微球(PAN)配用250~350mL的反應溶劑。
[0025]本發(fā)明的制備柔性載體的過程中，載體以大孔交聯聚丙烯腈微球(即，聚丙烯腈系共聚體、聚丙烯腈樹脂微球)為母體，通過化學改性的方式將親水性四乙烯五胺引入母體中，制得一種聚丙烯腈柔性載體。本發(fā)明所用的柔性鏈為四乙烯五胺屬多胺類化合物。
[0026] 在本發(fā)明中:[0027]聚丙烯腈樹脂微球選用D - 160型大孔吸附樹脂，交聯度7 % DVB,含氮量
22.18%，功能基含量:15.83CN mmol/g ;例如可購自中藍晨光化工研究院。
[0028]步驟(1)的聚丙烯腈樹脂改性中的“依次進行堿洗、水洗、酸洗和水洗”為常規(guī)操作方式，即為:將前一步驟的所得物先進行堿洗(放入濃度為lmol/L的NaOH溶液中浸泡I~3小時)；然后水洗至洗滌液為中性；再進行酸洗(將水洗后的所得物放入濃度為Imol/L的HCl溶液中浸泡I~3小時)；然后水洗至洗滌液為中性。
[0029]本發(fā)明所采用的測定方法具體如下:
[0030]樣品中酶含量的測定:取適量樣品待測液，在278nm處用紫外可見分光光度計測
其吸光度，通過標準曲線，確定待測液中酶蛋白的濃度。根據下式計算酶的固載量Qe:
【權利要求】
1.改性聚丙烯腈樹脂柔性固定化木瓜蛋白酶的方法，其特征是包括以下步驟: 1)、制備柔性載體，依次進行以下步驟: ①、聚丙烯腈樹脂改性: 將聚丙烯腈樹脂微球加入至反應溶劑中浸泡20~28h，從而使聚丙烯腈樹脂微球充分溶脹；然后加入作為親水性柔性基團的四乙烯五胺，作為催化劑的NaOH，所述聚丙烯腈樹脂微球:四乙烯五胺=NaOH的重量比為1: 11~12:0.1~0.2 ;在氮氣保護下于70°C~90°C、以150~200r/min的轉速攪拌反應9~11小時；過濾后，得改性后的聚丙烯腈樹脂微球； ②、改性后的聚丙烯腈樹脂微球用反應溶劑浸泡洗滌至洗滌液為無色，再依次用去離子水、乙醇、乙醚洗滌，然后用去離子水洗滌，接著依次進行堿洗、水洗、酸洗和水洗，40~60°C下干燥至恒重，得改性后的聚丙烯腈柔性載體； 2)、載體的活化: 取Ig改性后的聚丙烯腈柔性載體，用8~12ml的pH為6.5~8.5的磷酸緩沖液浸泡20~28h，從而使改性后的聚丙烯腈柔性載體充分溶脹；然后過濾分離，得浸泡后PAN-TEPA ； 在浸泡后PAN-TEPA中加入體積濃度為2 V0~6%的戊二醛8~12ml，于20~30°C交聯反應7~9h時后，過濾，所得濾餅依次用去離子水、pH為6.5~8.5的磷酸緩沖液洗滌后，于40~60°C下真 空干燥至恒重，得到戊二醛活化的聚丙烯腈柔性載體； 3)、制備固定化木瓜蛋白酶: 將戊二醛活化的聚丙烯腈柔性載體浸泡在8~12ml的pH為6.5~8.5的磷酸緩沖液的錐形瓶中，然后加入木瓜蛋白酶，所述木瓜蛋白酶與戊二醛活化的聚丙烯腈柔性載體的質量比為:0.06~0.10:1，于25~35°C恒溫振蕩2~4h后，過濾分離； 所得濾餅用pH為6.5~8.5的磷酸緩沖液進行反復沖洗后，于36~38°C的真空干燥器中干燥4.5~5.5h后,得固定化木瓜蛋白酶。
2.根據權利要求1所述的改性聚丙烯腈樹脂柔性固定化木瓜蛋白酶的方法，其特征是: 所述步驟I)中的反應溶劑為乙二醇。
3.根據權利要求2所述的改性聚丙烯腈樹脂柔性固定化木瓜蛋白酶的方法，其特征是: 所述步驟①:加入四乙烯五胺和NaOH后，接通氮氣，在氮氣保護下先以150~200rpm的攪拌速度在20~30°C的常溫下攪拌1.5~2.5h ;然后繼續(xù)在氮氣保護下于70°C~90°C、以150~200r/min的轉速攪拌反應9~11小時；過濾后，得改性后的聚丙烯腈樹脂微球。
4.根據權利要求1、2或3所述的改性聚丙烯腈樹脂柔性固定化木瓜蛋白酶的方法，其特征是: 所述pH為6.5~8.5的磷酸緩沖液為0.lmol/L的pH7.0的磷酸緩沖液。
5.根據權利要求4所述的改性聚丙烯腈樹脂柔性固定化木瓜蛋白酶的方法，其特征是:所述步驟①中每Ig聚丙烯腈樹脂微球配用250~350mL的反應溶劑。
6.根據權利要求5所述的改性聚丙烯腈樹脂柔性固定化木瓜蛋白酶的方法，其特征是:所述步驟I)中:聚丙烯腈樹脂微球:四乙烯五胺=NaOH的重量比為I:11.89:0.12，所述步驟2)中:戊二醛的體積濃度為4%，交聯反應溫度為25°C ；所述步驟3)中:木瓜蛋白酶與戊二醛 活化的聚丙烯腈柔性載體的質量比為0.08~0.10:1。
【文檔編號】C12N11/08GK104031903SQ201410259402
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2014年6月12日 優(yōu)先權日:2014年6月12日
【發(fā)明者】熊春華, 賈倩, 姚彩萍, 周蘇果 申請人:浙江工商大學