一種小核糖核酸的電化學檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于微量微小RNA的電化學檢測方法，包括以下步驟：固定在電極表面報告DNA與阻塞DNA形成雙鏈a；阻塞DNA與靶標微小RNA分子結合，形成雙鏈b，使阻塞DNA從電極表面脫離；引物DNA與雙鏈b中阻塞DNA末端序列結合，自我復制形成DNA雙鏈c，并將靶標微小RNA置換下來；被置換下來的靶標微小RNA又重新回到工作電極表面，與其他的雙鏈a反應，N次循環(huán)反應后，電極表面的莖環(huán)結構的報告DNA也越來越多，進而電化學信號也越來越強，從而實現(xiàn)對單分子微小RNA的電化學檢測。同樣的原理還可推廣到DNA，siRNA的檢測中，應用前景廣泛。
【專利說明】—種小核糖核酸的電化學檢測方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及小核糖核酸檢測【技術領域】，特別涉及一種對痕量小核糖核酸的電化學單分子檢測方法。
【背景技術】
[0002]microRNA (微小RNA)是一類長度約為21~25個核苷酸的小分子RNA，通過與mRNA (信使RNA)互補結合，在轉錄后水平抑制靶基因的表達microRNA普遍存在于多細胞生物中，而且數(shù)量可觀，約占整個基因組基因總數(shù)2%左右。microRNA在生物進化過程中高度保守，并已被證實參與和調控了包括時序發(fā)育、細胞凋亡、脂肪代謝、神經元發(fā)育、細胞分化、激素分泌等在內的多種生理過程，以及包括肺癌、白血病在內的多種疾病發(fā)生過程。研發(fā)人員監(jiān)測大量已知microRNA在免疫反應中表達的變化，從而發(fā)現(xiàn)其在生理病理狀態(tài)下的重要作用。除此之外研發(fā)人員還可以發(fā)現(xiàn)和鑒定出新的生物標志物，從而達到監(jiān)測免疫細胞的信號轉導和組織器官的分化的目的。由于miCToRNA細胞特異性以及“時空”特異性的特點，近年來其在干細胞定向分化和自我更新功能維持中的作用，逐漸被科學家們發(fā)現(xiàn)。通過監(jiān)測大量已知miCToRNA在免疫反應中表達的變化，研發(fā)人員可以在較短的時間內發(fā)現(xiàn)新的干細胞分化的標志microRNA ;此外通過對已知的microRNA標志物表達量的檢測，可以達到對干細胞的多能性以及分化進行監(jiān)測的目的。根據(jù)國內外的相關報告，某些microRNA在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起著重要的作用。根據(jù)microRNA在人體中起到的調節(jié)蛋白生成的 殊作用，我們認為其在未來臨床檢測應用方面具有廣闊的前景。
[0003]現(xiàn)在常見的檢測祀標microRNA的方法有深度測序(Deep Sequencing)基因芯片(Micro-Array)、實時突光定量 PCR(Real-time qPCR)等。
[0004]上述方法大多需要大型、較昂貴設備的支持，檢測成本較高，不適合常規(guī)的分析檢測，因此需要發(fā)展一種簡單、成本低又靈敏的檢測方法。

【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種簡單的檢測靶標微小RNA的方法。本發(fā)明所述電化學單分子檢測方法是一種非常簡便的分析方法，通過三電極系統(tǒng)中電信號的變化可以直接判斷出待測樣品中是否存在靶標微小RNA，操作簡單，抗干擾能力強，能快速、精確的實現(xiàn)對靶標微小RNA的檢測。
[0006]本發(fā)明提供一種靶標微小RNA的電化學單分子檢測方法，包括以下步驟:
[0007]步驟一固定在工作電極表面的報告DNA與阻塞DNA形成雙鏈a，打開報告DNA的莖環(huán)結構；
[0008]步驟二靶標microRNA與雙鏈a中的阻塞DNA結合，形成雙鏈b，使阻塞DNA從工作電極表面脫離，報告DNA自發(fā)形成莖環(huán)結構；
[0009]步驟三引物DNA與雙鏈b中阻塞DNA末端序列結合，在DNA聚合酶的作用下，延伸，形成DNA雙鏈C，同時將靶標microRNA置換下來；[0010]步驟四被置換下來的靶標microRNA又重新回到工作電極表面，與其他的工作電極表面的雙鏈a發(fā)生反應；
[0011]步驟五經過上述N次循環(huán)反應后，工作電極表面的莖環(huán)結構的報告DNA也越來越多，工作電極表面電信號會越來越強，從而實現(xiàn)對單分子微小RNA的電化學單分子檢測。
[0012]優(yōu)選的，所述報告DNA5'端帶有可以修飾到電極表面的基團(如巰基，氨基等)，報告DNA3'端帶有電信號分子。
[0013]優(yōu)選的，所述阻塞DNA通過與報告DNA互補配對被固定與電極表面，
[0014]但不是直接連接與工作電極表面。
[0015]優(yōu)選的，所述阻塞DNA上有一段可以與靶標微小RNA配對的堿基序列。
[0016]優(yōu)選的，靶標microRNA是可以重復利用的。
[0017]優(yōu)選的,所述報告DNA與阻塞DNA形成雙鏈a時,報告DNA3'端電信號分子遠離金電極表面，電信號減弱。
[0018]優(yōu)選的，所述報告DNA在單分子鏈狀態(tài)下形成莖環(huán)結構時報告DNA3'端帶有電信號分子，靠近工作電極表面，增強電信號。
[0019]本發(fā)明提供一種靶標microRNA的檢測方法，包括以下步驟:報告DNA與阻塞DNA形成雙鏈，雙鏈形成可在修飾到電極表面之前，亦可在報告DNA固定到電極表面之后；靶標microRNA分子與阻塞DNA結合，形成雙鏈，并從電極表面脫離，報告DNA單鏈自發(fā)形成莖環(huán)結構，并使末端電信號分子靠近電極表面；之后引物DNA與阻塞DNA末端序列結合，并在DNA聚合酶的作用下，延伸，形成雙鏈DNA，并將靶標microRNA置換下來；被置換下來的靶標microRNA又重新回到電極表面，與其他的報告-阻塞雙鏈作用，再結合引物，擴增，置換，如此循環(huán)，電極表面的莖環(huán)結構的報告DNA也越來越多，進而電信號也越來越強，從而實現(xiàn)對痕量祀標microRNA的電化學單分子檢測。
[0020]本發(fā)明的有益效果是，本發(fā)明所述電化學單分子檢測方法是一種非常簡便的分析方法，通過三電極系統(tǒng)中電信號的變化可以直接判斷出待測樣品中是否存在靶標microRNA,操作簡單,抗干擾能力強，能快速、精確的實現(xiàn)對祀標microRNA的檢測,適于在臨床應用，如肺癌、白血病、腫瘤等疾病的診斷。同樣的原理還可推廣到DNA，si RNA的檢測中，應用前景廣泛。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]圖1是本發(fā)明所述靶微小RNA的電化學檢測方法的技術流程圖。
[0022]圖2是應用本發(fā)明所述微小RNA的電化學檢測方法對樣品進行檢測的交流阻抗譜測試圖。
[0023]圖3是應用本發(fā)明加入所述微小RNA反應前后的電化學響應信號。
[0024]圖4是應用本發(fā)明所述靶微小RNA的電化學檢測方法的一種靶微小RNA標準曲線圖。
【具體實施方式】
[0025]本發(fā)明中涉及到的名詞:
[0026] 所述靶標微小RNA:根據(jù)不同需要所要檢測的微小RNA種類。[0027]所述莖環(huán)結構包括三個部分:(I)環(huán)狀區(qū)，一般為長度15~30堿基的序列，能與目標分子特異結合；(2)莖干區(qū)，通常為長度5~8堿基的互補序列，莖干區(qū)通過氫鍵共價連接形成二級結構；(3)帶電基團，本發(fā)明所述報告DNA5'端帶有可以修飾到電極表面的基團或分子(如巰基，氨基，生物素，抗生物素等)，報告DNA3,端帶有電信號分子。
[0028]所述引物DNA:是一小段單鏈DNA,作為DNA復制的起始點,在核酸合成反應時,作為每個多核苷酸鏈進行延伸的出發(fā)點而起作用的多核苷酸鏈，在引物的3' -OH上，核苷酸以二酯鏈形式進行合成，因此引物的3' -OH，必須是游離的。
[0029]所述DNA聚合酶:是細胞復制DNA的重要作用酶，以DNA為復制模板，從將DNA由5'端點開始復制到3'端的酶。DNA聚合酶的主要活性是催化DNA的合成(在具備模板、引物、d NTP等的情況下)及其相輔的活性。
[0030]本發(fā)明涉及三組核酸序列，單鏈報告DNA (信標DNA)，阻塞DNA (阻斷DNA)和引物DNA。其中，報告DNA末端一端帶有可以修飾到電極表面的基團，(如疏基，氣基等)另一端則帶有電信號分子，且該報告DNA序列可以形成頸環(huán)結構。阻塞DNA為報告DNA的互補序列，同時其中有一段可以與靶標微小RNA分子互補配對。
[0031]本發(fā)明提供一種靶標微小RNA的電化學檢測方法，包括以下步驟:如圖1所示:
[0032]步驟一固定在工作電極表面的報告DNA與阻塞DNA形成雙鏈a，打開報告DNA的莖環(huán)結構；
[0033]步驟二靶標微 小RNA與雙鏈a中的阻塞DNA結合，形成雙鏈b，使阻塞DNA從工作電極表面脫離，報告DNA自發(fā)形成莖環(huán)結構；
[0034]步驟三引物DNA與雙鏈b中阻塞DNA末端序列結合，形成雙鏈C，同時將靶標微小RNA置換下來；
[0035]步驟四被置換下來的靶標微小RNA又重新回到工作電極表面，與其他的工作電極表面的雙鏈a發(fā)生反應；
[0036]步驟五經過上述N次循環(huán)反應后，工作電極表面的莖環(huán)結構的報告DNA也越來越多，工作電極表面電信號會越來越強，從而實現(xiàn)對單分子微小RNA的電化學單分子檢測。
[0037]所述步驟一中還包括按照靶標微小RNA種類的不同，設計不同的阻塞DNA和報告DNA分子單鏈，設計成的阻塞DNA要有一端序列可以與靶標微小RNA特異性結合；設計成的報告DNA分子單鏈包括三部分:(I)環(huán)狀區(qū)，一般為長度15~30堿基的序列，能與阻塞DNA特異性結合；(2)莖干區(qū)，通常為長度5~8堿基的互補序列，莖干區(qū)通過氫鍵共價連接形成二級結構；(3)帶電集團，本發(fā)明所述報告DNA5'端帶有可以修飾到電極表面的基團(如巰基，氨基等)，報告DNA3,端帶有電信號分子。利用本領域熟知的方法合成出上述符合要求的報告DNA之后,可以將報告DNA共價結合于工作電極表面,再將其與阻塞DNA形成雙鏈
a,或者可以先將報告DNA與阻塞DNA形成雙鏈a之后,雙鏈a再共價結合于工作電極表面。
[0038]所述步驟二中報告DNA自發(fā)形成莖環(huán)結構的同時，會將報告DNA3'端帶有的電信號分子拉近工作電極，使工作電極表面產生電信號。本發(fā)明所述方法中所述檢測電信號強度的電極系統(tǒng)是三電極系統(tǒng)，其中工作電極優(yōu)選金電極。
[0039]所述步驟三中還包括引物DNA和DNA聚合酶的加入，引物DNA為本領域人員熟知的通用引物。根據(jù)樣品的不同，檢測靶標微小RNA種類不同，所對應的阻塞DNA序列也不同，選用哪一種通用引物還要根據(jù)阻塞DNA序列的不同而確定。引物DNA5'端是可連接于阻塞DNA3 ’端的，并且引起阻塞DNA單鏈分子在DNA聚合酶的作用下，形成DNA雙鏈分子C，在合成雙鏈分子c的同時，將靶標微小RNA重新釋放出來，回到電極表面，進入循環(huán)反應。
[0040]經過上述N次循環(huán)反應后，工作電極表面的莖環(huán)結構的報告DNA也越來越多，工作電極表面電信號會越來越強，從而實現(xiàn)對單分子微小RNA的電化學單分子檢測。
[0041]為了進一步說明本發(fā)明，以下結合實施例和附圖對本發(fā)明提供的微小RNA的檢測方法進行詳細描述，以令本領域技術人員參照說明書文字能夠據(jù)以實施，但不能將他們理解為對本發(fā)明保護范圍的限定。
[0042]實施例1:
[0043]I)根據(jù)所測樣品確定靶標微小RNA序列為UAGC UUAU CAGA CUGA UGUU GA ；(3' -5')
[0044]2)根據(jù)所要檢測的靶標微小RNA序列合成阻塞DNA，序列為-Mkk TCTC AACA TCAGTCTG ATAA GCAT ; (3' -5') [0045]3)根據(jù)阻塞 DNA 序列合成報告 DNA:Fc-TAT CAGA CTGA TGTT GAGA TTCTGATA-(C)6-SH-(C)6 ; (3' -5')
[0046]4)引物 DNA:GAGA TTCT (3' -5')
[0047]5)將合成的報告 DNA 分子溶于含有 IOmM Tris-HCl，IOmM TCEP，ImM EDTA，0.1MNaCl的溶液中，終濃度為I μ Μ。將金電極浸泡入上述溶液中,放置過夜。然后將金電極沖洗干凈，浸泡入ImM巰基己醇中半小時；再將金電極浸泡在I μ M濃度的阻塞DNA分子溶液中，靜置I小時，形成雙鏈a,打開報告DNA分子的莖環(huán)結構
[0048]6)將金電極插入樣品中,樣品中含有的祀微小RNA會與金電極表面的雙鏈a發(fā)生置換反應，靶微小RNA與雙鏈a中的第二單鏈DNA分子結合，形成雙鏈b，使第二單鏈DNA分子從金電極表面脫離，第一單鏈DNA分子自發(fā)形成莖環(huán)結構；
[0049]7)在上述混合液中加入引物DNA、DNA聚合酶和dNTP，聚合反應形成雙鏈C，同時將待檢測樣品中的靶微小RNA置換下來；
[0050]8)被置換下來的靶微小RNA又重新回到金電極表面，與金電極表面其他的雙鏈a發(fā)生反應。經過上述N次循環(huán)反應后，金電極表面的莖環(huán)結構的第一單鏈DNA分子也越來越多，此時，金電極電化學反應會越來越強，最終達到250 μ A。從而實現(xiàn)對上述靶標微小RNA的電化學單分子的檢測；
[0051]9)圖2為報告DNA分子與阻塞DNA分子形成的雙鏈a修飾的工作電極的阻抗值變化；
[0052]10)圖3為加入微小RNA反應前后電流的變化；
[0053]11)圖4為微小RNA濃度的對數(shù)值與峰電流大小的線性關系圖。
[0054]盡管本發(fā)明的實施方案已公開如上，但其并不僅限于說明書和實施方式中所列運用，它完全可以被適用于各種適合本發(fā)明的領域，對于熟悉本領域的人員而言，可容易地實現(xiàn)另外的修改，因此在不背離權利要求及等同范圍所限定的一般概念下，本發(fā)明并不限于特定的細節(jié)和這里示出與描述的實施例。
【權利要求】
1.一種用于微量靶標microRNA的電化學檢測方法，其特征在于，包括以 下步驟: 步驟一報告DNA打開莖環(huán)結構，與阻塞DNA形成雙鏈a，并被固定到工作電極表面；或者報告DNA固定到電極表面后與阻塞DNA形成雙鏈a 步驟二靶標microRNA與雙鏈a中的阻塞DNA結合，形成雙鏈b，使阻塞DNA從工作電極表面脫離，報告DNA自發(fā)形成莖環(huán)結構； 步驟三引物DNA與雙鏈b中阻塞DNA末端序列結合，在DNA聚合酶的作用下，延伸，形成DNA雙鏈C，同時將靶標microRNA置換下來； 步驟四被置換下來的靶標microRNA又重新回到工作電極表面，與其他的工作電極表面的雙鏈a發(fā)生反應； 步驟五經過上述N次循環(huán)反應后，工作電極表面的莖環(huán)結構的報告DNA也越來越多，工作電極表面電信號會越來越強，從而實現(xiàn)對痕量微小RNA的電化學單分子檢測。
2.如權利要求1所述的用于靶標microRNA的電化學單分子檢測方法，其特征在于，所述靶標microRNA、報告DNA、阻塞DNA和引物DNA均為單鏈分子。
3.如權利要求1所述的用于靶標microRNA的電化學單分子檢測方法，其特征在于，所述報告DNA連接基團和電信號分子，分別位于報告DNA分子兩端。
4.如權利要求1所述 的用于靶標microRNA的電化學單分子檢測方法，其特征在于，所述阻塞DNA通過與報告DNA互補配對被固定于電極表面，但不是直接連接于工作電極表面。
5.如權利要求1所述的用于靶標microRNA的電化學單分子檢測方法，其特征在于，所述阻塞DNA上有一段可以與靶標microRNA配對的堿基序列。
6.如權利要求1所述的用于靶標microRNA的電化學單分子檢測方法，其特征在于，靶標microRNA是可以重復利用的。
7.如權利要求1或3所述的用于靶標microRNA的電化學單分子檢測方法，其特征在于，所述報告DNA與阻塞DNA形成雙鏈a時,報告DNA3'端電信號分子遠離金電極表面，電信號減弱。
8.如權利要求3所述的用于靶標microRNA的電化學單分子檢測方法，其特征在于，所述報告DNA在單鏈分子狀態(tài)下形成莖環(huán)結構時報告DNA3'端帶有電信號分子，靠近工作電極表面，增強電信號。
【文檔編號】C12Q1/68GK103993097SQ201410259207
【公開日】2014年8月20日 申請日期:2014年6月12日 優(yōu)先權日:2014年6月12日
【發(fā)明者】韓坤, 繆鵬, 王弼陡, 唐玉國 申請人:中國科學院蘇州生物醫(yī)學工程技術研究所